HPLC בשילוב עם טביעת אצבע כימית לזיהוי תבניות מרובות לזיהוי האותנטיות של קלמטידיס ארמנדי קאולי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), בשילוב עם זיהוי רב-תבניות של טביעות אצבע כימיות, המספק אסטרטגיה חדשה לזיהוי יעיל של הזנים האמיתיים של Clematidis Armandii Caulis וחומרי הניאוף שלו.
Abstract
שיטה לזיהוי חומרי מרפא סיניים וחומרי הניאוף הקשורים אליהם נבנתה על ידי לקיחת Clematidis Armandii Caulis (צ’ואנמוטונג, רפואה סינית מסורתית בשימוש אוניברסלי) כדוגמה. עשר אצוות של זני צ’ואנמוטונג מקוריים וחמש אצוות של ניאוף קשורים נותחו והושוו בהתבסס על טביעות האצבע של הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים (HPLC) בשילוב עם כימומטריה, כולל ניתוח אשכולות (CA), ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח אפליה אורתוגונלית של ריבועים מינימליים (OPLS-DA). בנוסף, התוכן של β-sitosterol נקבע. טביעת האצבע הכימית של צ’ואנמוטונג הוקמה, וזוהו 12 פסגות נפוצות. הדמיון בין טביעת האצבע של 10 אצוות של זני צ’ואנמוטונג מקוריים לבין טביעת האצבע של הבקרה היה 0.910-0.989, בעוד שהדמיון בין חמש אצוות של ניאוף היה רק 0.133-0.720. בהתבסס על הפסגות הנפוצות בכרומטוגרמה, 15 אצוות של דגימות סווגו לשלוש רמות תוכן על ידי PCA, ונצברו לארבע קטגוריות על ידי CA, והשיגו הבחנה ברורה בין צ’ואנמוטונג אותנטי לבין ניאוף של צ’ואנמוטונג. יתר על כן, שבעה מרכיבים דיפרנציאליים שיכולים לזהות ביעילות צ’ואנמוטונג אותנטי וחומרי ניאוף של צ’ואנמוטונג נמצאו באמצעות OPLS-DA. תכולת β-סיטוסטרול של 10 אצוות של זני צ’ואנמוטונג מקוריים הייתה 97.53-161.56 מיקרוגרם/גרם, בעוד שתכולת β-סיטוסטרול של חמש קבוצות הניאוף הייתה שונה מאוד, ביניהן תכולת β-סיטוסטרול של Clematis peterae Hand.-Mazz. וקלמטיס גוריאנה רוקסב. ו. פינתי רהד. et Wils. היה נמוך משמעותית מזה של זנים אותנטיים של Chuanmutong. תכולת רכיבי אינדקס HPLC ושיטת זיהוי טביעות אצבע כימיות מרובות תבניות שנקבעו במחקר זה מספקות אסטרטגיה חדשה לזיהוי יעיל של חומרי מרפא סיניים אותנטיים וחומרי ניאוף קשורים.
Introduction
צ’ואנמוטונג, קאולי יבש של קלמטיס ארמנדי פראנץ’. או Clematis מונטנה Buch.-Ham., היא רפואה סינית מסורתית המשמשת בדרך כלל במרפאות 1,2,3. הוא משמש לטיפול בבעיות במתן שתן, בצקת, פצעים על הלשון והפה, ירידה בהפרשת חלב, נוקשות במפרקים וכאבי שרירים הנגרמים על ידי חום לח4. Chuanmutong תמיד הושג מזני בר, המופצים בעיקר בדרום מערב סין, במיוחד בסצ’ואן, שם ניתן למצוא את האיכות הטובה ביותר 5,6. קשה להבחין בין זנים אותנטיים לבין ניאוף קרוב שלהם בשל המאפיינים הדומים שלהם 7,8,9,10. תקן האיכות של Chuanmutong במהדורת 2020 של הפרמקופיאה הסינית קובע רק את המאפיינים, הזיהוי המיקרוסקופי וזיהוי השכבה הדקה ללא קביעת תוכן, שאינם יכולים לזהות ביעילות ניאוף, ולכן יש סיכונים פוטנציאליים. יתר על כן, ישנם דיווחים מעטים המשווים ומזהים צ’ואנמוטונג וצמחים קשורים. כתוצאה מכך, שיטת בקרת איכות כדי להבטיח את האותנטיות של Chuanmutong ראוי למחקר נוסף.
המרכיבים הכימיים של צ’ואנמוטונג מורכבים בעיקר מטריטרפנואידים פנטציקליים מסוג אולנאן והגליקוזידים, הפלבנואידים והחומצות האורגניותשלהם 11,12,13,14. ביניהם, חומצה אולאנולית, β-סיטוסטרול, סטיגמסטרול וארגוסטרול יש השפעות משתנות בעוצמות שונות, אשר עשוי להיות חומרים פרמקודינמיים פוטנציאליים לקידום diuresis והקלה על חנק15,16. טביעות אצבע כימיות מתקבלות על ידי הפרדה וגילוי של רכיבים כימיים רבים הכלולים בדגימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), כרומטוגרפיית גז (GC) וכו ‘. אימוץ שיטות ניתוח סטטיסטיות מתאימות לניתוח המאפיינים של Chuanmutong יכול לקבוע את בקרת האיכות הכוללת ואת הזיהוי המדעי של הרפואה הסינית המסורתית17,18,19.
במחקר זה נאספו 10 אצוות של זנים אותנטיים של צ’ואנמוטונג וחמש אצוות של ניאוף. איכותם הושוותה ונותחה על ידי שיטת טביעת האצבע HPLC בשילוב עם זיהוי רב-תבניות, כולל ניתוח אשכולות (CA), ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), ניתוח אפליה אורתוגונלית חלקית של ריבועים לפחות (OPLS-CA), וקביעת תוכן של הרכיב הפרמקודינמי. פרוטוקול זה קובע שיטה לזיהוי זנים אותנטיים עם ספציפיות גבוהה, אסטרטגיה חדשה לזיהוי מדעי של זנים אותנטיים וניאוף של חומרי מרפא סיניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
איסוף הדגימות למחקר הוא צעד המפתח הראשון לבניית זיהוי רב-תבניות בזיהוי האותנטיות של חומרי מרפא סיניים. באמצעות מחקר שוק, מצאנו כי סצ’ואן יאן, ליאנגשאן ולשאן הם אזורי הייצור העיקריים של משאבי הבר של צ’ואנמוטונג. גם לזנים הקשורים של אותו סוג יש אותה תפוצה גיאוגרפית 6,20<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מינהל הרפואה הסינית המסורתית של סצ’ואן (מס’ 2020JC0088, מס’ 2021MS203).
Materials
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | – | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | – | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | – | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | – | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | – | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. . Chinese Medicine Specimen Picture Book. , 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. . Pharmacopoeia of The People’s Republic of China: (Edition 2020). , 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
