Summary
Hier presenteren we een protocol om high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) vast te stellen, gekoppeld aan chemische vingerafdruk multi-patroonherkenning, die een nieuwe strategie biedt voor het effectief identificeren van de echte variëteiten van Clematidis Armandii Caulis en zijn overspelige stoffen.
Abstract
Een methode voor het identificeren van Chinese medicinale materialen en hun gerelateerde overspeligen werd geconstrueerd door Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, een universeel gebruikte traditionele Chinese geneeskunde) als voorbeeld te nemen. Tien batches van echte Chuanmutong-variëteiten en vijf partijen verwante overspelige stoffen werden geanalyseerd en vergeleken op basis van de high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) vingerafdrukken in combinatie met chemometrie, waaronder clusteranalyse (CA), principal component analysis (PCA) en orthogonale partiële kleinste-kwadraten discriminatieanalyse (OPLS-DA). Bovendien werd het gehalte aan β-sitosterol bepaald. De controle chemische vingerafdruk van Chuanmutong werd vastgesteld en 12 gemeenschappelijke pieken werden geïdentificeerd. De overeenkomst tussen de vingerafdruk van 10 partijen echte Chuanmutong-variëteiten en de controlevingerafdruk was 0,910-0,989, terwijl de gelijkenis van vijf partijen overspelige stoffen slechts 0,133-0,720 was. Op basis van de gemeenschappelijke pieken in het chromatogram werden 15 partijen monsters ingedeeld in drie inhoudsniveaus per PCA en werden ze geaggregeerd in vier categorieën per CA, waardoor een duidelijk onderscheid werd gemaakt tussen authentieke Chuanmutong en overspelige stoffen van Chuanmutong. Verder werden zeven differentiële componenten gevonden die authentieke Chuanmutong en overspelige stoffen van Chuanmutong effectief kunnen identificeren via OPLS-DA. Het β-sitosterolgehalte van 10 partijen echte Chuanmutong-variëteiten was 97,53-161,56 μg / g, terwijl het β-sitosterolgehalte van de vijf partijen overspelige stoffen sterk varieerde, waaronder het β-sitosterolgehalte van Clematis peterae Hand.-Mazz. en Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. en Wils. was significant lager dan die van authentieke variëteiten van Chuanmutong. De HPLC-indexcomponentinhoud en chemische vingerafdruk multi-patroon herkenningsmethode die in deze studie is vastgesteld, bieden een nieuwe strategie voor het effectief identificeren van authentieke Chinese medicinale materialen en gerelateerde overspelige stoffen.
Introduction
Chuanmutong, droge Caulis van Clematis armandii Franch. of Clematis montana Buch.-Ham., is een traditionele Chinese geneeskunde die vaak wordt gebruikt in klinieken 1,2,3. Het wordt gebruikt voor de behandeling van urinewegproblemen, oedeem, zweren op de tong en mond, verminderde melkafscheiding, gewrichtsstijfheid en spierpijn veroorzaakt door vochtige warmte4. Chuanmutong is altijd verkregen uit wilde variëteiten, voornamelijk gedistribueerd in het zuidwesten van China, vooral in Sichuan, waar de beste kwaliteit te vinden is 5,6. Het is moeilijk om onderscheid te maken tussen authentieke variëteiten en hun nauw verwante overspelige stoffen vanwege hun vergelijkbare kenmerken 7,8,9,10. De kwaliteitsnorm van Chuanmutong in de 2020-editie van Chinese Farmacopee bepaalt alleen de eigenschappen, microscopische identificatie en dunnelaagidentificatie zonder bepaling van de inhoud, die geen effectieve vervalsingen kunnen identificeren en dus potentiële risico's met zich meebrengen. Bovendien zijn er weinig rapporten die Chuanmutong en aanverwante planten vergelijken en identificeren. Bijgevolg is een kwaliteitscontrolemethode om de authenticiteit van Chuanmutong te garanderen het waard om verder te worden bestudeerd.
De chemische bestanddelen van Chuanmutong zijn voornamelijk samengesteld uit oleanane-type pentacyclische triterpenoïden en hun glycosiden, flavonoïden en organische zuren 11,12,13,14. Onder hen hebben oleanolic acid, β-sitosterol, stigmasterol en ergosterol diuretische effecten van verschillende intensiteiten, wat potentiële farmacodynamische stoffen kunnen zijn voor het bevorderen van diurese en het verlichten van wurggreep15,16. Chemische vingerafdrukken worden verkregen door het scheiden en detecteren van veel chemische componenten in monsters door middel van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC), gaschromatografie (GC), enz. Het aannemen van geschikte statistische analysemethoden om de kenmerken van Chuanmutong te analyseren, kan de algehele kwaliteitscontrole en wetenschappelijke identificatie van de traditionele Chinese geneeskunde bepalen 17,18,19.
In deze studie werden 10 partijen authentieke Chuanmutong-variëteiten en vijf partijen overspelige stoffen verzameld. Hun kwaliteit werd vergeleken en geanalyseerd door de HPLC-vingerafdrukmethode in combinatie met multi-patroonherkenning, inclusief clusteranalyse (CA), principal component analysis (PCA), orthogonale partiële least-squares discriminatieanalyse (OPLS-CA) en inhoudsbepaling van de farmacodynamische component. Dit protocol stelt een methode vast voor het identificeren van authentieke rassen met een hoge specificiteit, een nieuwe strategie voor de wetenschappelijke identificatie van authentieke rassen en vervalsingen van Chinese medicinale materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Methoden voor chemische vingerafdrukdetectie
- Chromatografische omstandigheden
- Bereid de mobiele fase van acetonitril (A) / water (B) voor. Stel een gradiëntprogramma in als volgt in de HPLC-software: 0-20 min, 3% A-10% A; 20-25 min, 10% A-13% A; 25-65 min, 13% A-25% A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
- Houd het debiet van de mobiele fase op 1,0 ml/min.
- Voer de chromatografische scheiding uit op een C18-kolom (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) die op 30 °C wordt gehouden.
- Stel het injectievolume in op 10 μL.
- Detecteer de monsters op een golflengte van 205 nm.
OPMERKING: Voor de specifieke instellingen van chromatografische omstandigheden, raadpleegt u de operationele procedures van de werksoftware van hoogwaardige vloeistofchromatografie (Materiaaltabel).
- Bereiding van de monsteroplossing
- Maal de grondstoffen tot een uniforme deeltjesgrootte door ze door een nylon gaas met een binnendiameter van 850 μm ± 29 μm te laten gaan.
- Breng 2 g van de gemalen grondstof (nauwkeurig gewogen) in een erlenmeyer van 50 ml met een stop en voeg 50 ml methanol toe. Plaats de stop op de kolf en ultrasoon (600 W, 40 kHz) gedurende 30 minuten.
- Koel vervolgens de kolf af tot kamertemperatuur (RT). Weeg de monsters opnieuw en compenseer het oorspronkelijke gewicht door het verloren extract te vervangen.
- Giet 4 ml van de methanoloplossing die de medicinale extracten bevat in een maatkolf van 10 ml. Voeg 6 ml H2O toe, meng en laat het 10 minuten bezinken.
- Filter ten slotte het supernatant door een filtermembraan van 0,45 μm en plaats het op stand-by.
- Validatie van vingerafdrukdetectiemethoden
- Bereid het monster voor zoals hierboven beschreven (stap 1.2) en onderwerp het zes keer per dag aan een HPLC-analyse (stap 1.1). Om de precisie te evalueren, berekent u de relatieve standaarddeviatie (RSD) van de relatieve retentietijd en relatieve piekgebieden zoals beschreven in stap 1.3.5.
- Evalueer de stabiliteit van de monsteroplossing door dezelfde monsteroplossing te analyseren die is opgeslagen bij RT gedurende 0, 2, 4, 6, 8, 12 en 24 uur, en bereken de RSD van de relatieve retentietijd en relatieve piekgebieden zoals beschreven in stap 1.3.5.
- Neem zes replica's van hetzelfde monster (CMT-4), bereid de monsteroplossing volgens de bovenstaande procedure (stap 1.2) en detecteer de vingerafdruk in HPLC volgens stap 1.1. Bereken de RSD van de relatieve retentietijd en relatieve piekgebieden en evalueer de herhaalbaarheid ervan zoals beschreven in stap 1.3.5.
- Gebruik vervolgens piekgetal 10 in figuur 1B als referentiepiek en bereken de RSD van de relatieve retentietijd en het relatieve piekgebied van elke gemeenschappelijke piek zoals beschreven in stap 1.3.5.
- Gebruik de onderstaande formules om de relatieve retentietijd en het relatieve piekoppervlak van elke gemeenschappelijke piek te berekenen:
Tre = Tkarakteristiek/Treferentie
Eenre = Eenkenmerk/Eenreferentie
Waarbij Tre = relatieve retentietijd, T-kenmerk = karakteristieke piekretentietijd, T-referentie = referentiepiekretentietijd, Are = relatief piekgebied, Akarakteristiek = karakteristiek piekgebied en A-referentie = referentiepiekgebied.
OPMERKING: De vaststelling van vingerafdrukken van traditionele Chinese geneeskunde vereist over het algemeen het selecteren van een chromatografische piek die gemakkelijk te verkrijgen is en een hoge resolutie heeft. Dit wordt gebruikt als referentiepiek om de vingerafdrukken te identificeren en hun stabiliteit en reproduceerbaarheid te onderzoeken.
2. Vaststelling van Chuanmutong vingerafdruk- en gelijkenisanalyse
- Gebruik 10 partijen authentieke monsters en vijf partijen overspelige stoffen zoals Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. en Wils. (DC), Clematis Peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils (XS), en Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) als monsters voor vingerafdrukanalyse.
- Bereid de monsteroplossingen voor zoals beschreven in stap 1.2. Voer een vingerafdrukanalyse uit van alle monsteroplossingen door HPLC volgens de voorwaarden die worden beschreven in stap 1.1.
- Importeer de relevante gegevens in het gelijkenisbeoordelingssysteem van chromatografische vingerafdrukken van de traditionele Chinese geneeskunde (SESCF-TCM, versie 2012). Het systeem zal de pieken met een redelijke hoogte en een goede resolutie in de chromatogrammen van alle monsters aanwijzen als gemeenschappelijke pieken.
OPMERKING: De SESCF-TCM-software kan worden gedownload na registratie op de website van de Chinese Pharmacopoeia Commission (http://114.247.108.158:8888/login).- Klik in de software op de knop Referentiespectrum instellen in het menu.
- Stel vervolgens in het venster Parameterinstellingen de breedte van het tijdvenster in op 0,5 en selecteer Methode voor het genereren van spectrum regelen als de mediane methode.
- Klik op Multi-point Calibration in het hoofdmenu en selecteer vervolgens Peak Matching als Full Spectrum Peak Matching.
- Klik ten slotte op Generate Control om de referentiechromatografische vingerafdruk van de authentieke soort Chuanmutong te genereren.
- Importeer de retentietijd en het piekgebied van 10 partijen authentieke Chuanmutong-monsters en vijf partijen vervalsingen in SESCF-TCM voor analyse. De specifieke bewerkingen zijn als volgt:
- Klik in de software op de knop Referentiespectrum instellen in het hoofdmenu.
- Stel in het venster Parameterinstellingen de referentiechromatografische vingerafdruk van de authentieke soort Chuanmutong in als referentie, selecteer de Control Spectrum Generation Method als de mediane methode en stel de tijdvensterbreedte in op 0,5.
- Klik op Multi-point Calibration in het hoofdmenu en selecteer vervolgens Peak Matching als Full Spectrum Peak Matching.
- Klik ten slotte op Gelijkenis berekenen om de gelijkenis te berekenen op basis van de referentiechromatogramafdrukken van Chuanmutong. Bereken ten slotte de gelijkenis van vingerafdrukken met behulp van het Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System (2012-versie).
OPMERKING: Voor de specifieke bewerkingen raadpleegt u de operationele specificaties voor het Chromatographic Fingerprint Evaluation System (2012-versie).
3. Multi-patroon herkenningsanalyse van Chuanmutong-vingerafdruk
- Clusteranalyse (CA)
- Gebruik de piekgebieden van 12 gemeenschappelijke pieken in de vingerafdrukken van 10 batches authentieke Chuanmutong-monsters en hun vijf batches overspelige stoffen als variabelen en voer ze in statistische analysesoftware in voor systematische clusteranalyse (CA).
- Kies de tussengroepenmethode en gebruik de Pearson-correlatiecoëfficiënt als classificatiebasis om een clusteranalysediagram van Chuanmutong en zijn overspeligen te tekenen. De specifieke bewerkingen zijn als volgt:
- Klik in de statistische analysesoftware op Bestand om gegevens te importeren.
- Klik op Analyse in het menu en klik vervolgens op Systeemclustering in Classificatie.
- Selecteer het gemeenschappelijke piekgebied als variabele en stel het aantal clusters in op vier.
- Klik op Methode, selecteer de clustermethode als Intergroepsverbinding, selecteer het meetinterval als Pearson-correlatie en klik op OK om de CA-kaart te tekenen.
- Analyse van de belangrijkste componenten (PCA)
- Importeer het relatieve gemeenschappelijke piekgebied van de authentieke variëteiten en hun overspeligen in de analysesoftware voor PCA-analyse en gebruik de PCA-scorekaart om de scorematrixkaart van steekproefverschillen te evalueren. De specifieke bewerkingen zijn als volgt:
- Open de data-analysesoftware, klik op Bestand in het menu en maak een nieuw regulier project. Importeer het piekgebied van 12 algemene pieken in een spreadsheet (bijvoorbeeld Excel-indeling) uit het HPLC-systeem. Klik vervolgens op Voltooien om de gegevensimport te voltooien.
- Klik op Nieuw om een nieuw model te maken om het modeltype met PCA in te stellen. Klik op Autofit en Toevoegen om in de gegevens te passen en klik vervolgens op Scores om de PCA-scorekaart te krijgen.
- Importeer het relatieve gemeenschappelijke piekgebied van de authentieke variëteiten en hun overspeligen in de analysesoftware voor PCA-analyse en gebruik de PCA-scorekaart om de scorematrixkaart van steekproefverschillen te evalueren. De specifieke bewerkingen zijn als volgt:
- Orthogonale partiële kleinste-kwadraten discriminatie analyse (OPLS-DA)
- Gebruik de orthogonale partiële kleinste-kwadraten discriminatie analysemethode met supervisiemodus om de relatieve gemeenschappelijke piekoppervlaktepieken van de authentieke Chuanmutong-variëteiten en overspeligen verder te analyseren en een OPLS-DA-classificatiescorekaart van alle monsters te tekenen. De specifieke bewerkingen zijn als volgt:
- Klik in data-analysesoftware in het menu op Bestand om een bestand te importeren en een nieuw regulier project te maken. Importeer het piekgebied van 12 algemene pieken in een spreadsheet vanuit het HPLC-systeem en klik vervolgens op Voltooien om de gegevensimport te voltooien.
- Klik op Nieuw om een nieuw model te maken om het modeltype met PCA in te stellen. Klik op Autofit en Toevoegen om in de gegevens te passen. Klik vervolgens op Scores om de PCA-scorekaart te krijgen.
- Klik op Nieuw en kies Nieuw als Model One om het modeltype in te stellen met OPLS-DA.
- Klik op Schaal en stel type in met Par voor iedereen. Klik eerst op Autofit en klik vervolgens op Scores om de OPLS-DA scorekaart te krijgen.
- Om de invloed van elke gemeenschappelijke piek in Chuanmutong op de classificatieresultaten en het verschil tussen authentieke Chuanmutong-materialen en gerelateerde overspeligen te bepalen, gebruikt u het variabele belang in de projectie (VIP) voor analyse.
- Teken de VIP-kaart van de verschillende componenten van Chuanmutong. Gebruik de resulterende VIP-kaart om de impact van elke variabele op de classificatie te beoordelen en om componenten af te schermen die aanzienlijk bijdragen aan de verschillen tussen groepen. De specifieke bewerkingen zijn als volgt:
- Klik in de data-analysesoftware op Analyseren in het menu en klik op Permutaties, stel het aantal permutaties in op 200 en krijg de R2 en Q2 van de OPLS-DA scorekaart.
- Klik op VIP en kies VIP Predictive om de VIP-kaart te krijgen.
- Gebruik de orthogonale partiële kleinste-kwadraten discriminatie analysemethode met supervisiemodus om de relatieve gemeenschappelijke piekoppervlaktepieken van de authentieke Chuanmutong-variëteiten en overspeligen verder te analyseren en een OPLS-DA-classificatiescorekaart van alle monsters te tekenen. De specifieke bewerkingen zijn als volgt:
4. Bepaling van β-sitosterol in Chuanmutong door HPLC
- Chromatografische omstandigheden (zie stap 1.1)
- Bereid de mobiele fase voor: methanol-water (97:3).
- Stel het debiet van de mobiele fase in op 1,0 ml/min.
- Voer de chromatografische scheiding uit op een C18-kolom (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) die op 30 °C wordt gehouden.
- Stel het injectievolume in op 10 μL.
- Detecteer de component op een golflengte van 204 nm.
- Bereiding van de monsteroplossing
- Bereid de standaard standaardoplossing van β-sitosterol (0,1 mg/ml) door een nauwkeurig gewogen hoeveelheid van de overeenkomstige referentienorm in methanol op te lossen.
- Maal het analysemonster van de grondstof tot een uniforme deeltjesgrootte door het monster door het nylongaas met een binnendiameter van 180 μm ± 7,6 μm te laten lopen.
- Breng 2 g van de gemalen grondstof (nauwkeurig gewogen) in een kolf met ronde bodem en voeg er 50 ml chloroform aan toe.
- Sluit de kolf aan op een refluxcondensor en verwarm deze gedurende 60 minuten in een kokend waterbad (matig koken). Filtreer de extractieoplossing met een filterpapier van 15-20 μm.
- Verdamp het filtraat tot bijna droogheid op een kokend waterbad (matig kokend) gedurende ongeveer 10 minuten.
- Los het residu op en vul het volume aan tot 5 ml met methanol. Laat het supernatant ten slotte door een filtermembraan van 0,45 μm lopen en zet het op stand-by.
- Validatie van de methode
- Neem de stamoplossing van β-sitosterol bereid in substap 4.2.1, verdun deze met 100% methanol en bereid oplossingen met 100 μg/ml, 80 μg/ml, 60 μg/ml, 50 μg/ml, 40 μg/ml, 30 μg/ml en 20 μg/ml.
- Injecteer de monsters onder de chromatografische omstandigheden beschreven in stap 4.1 om het piekgebied te bepalen, voer een regressieanalyse uit met het piekgebied tot het injectievolume en verkrijg de regressievergelijking en correlatiecoëfficiënt om de lineariteit ervan te evalueren.
- Bereid de monsters voor zoals hierboven beschreven (stap 4.2) en onderwerp ze zes keer op dezelfde dag aan een HPLC-analyse (stap 4.1). Bereken vervolgens de RSD van piekgebieden om de precisie te evalueren.
- Evalueer de stabiliteit van de monsteroplossing door dezelfde monsteroplossingen te analyseren die gedurende 0, 2, 4, 6, 8, 12 en 24 uur bij RT zijn opgeslagen, zoals beschreven in stap 4.1. Bereken vervolgens de RSD van piekgebieden zoals beschreven in stap 1.3.5.
- Onderzoek de herhaalbaarheid door hetzelfde monster (CMT-4) op te lossen in sextuplicaat, bereid zoals beschreven in stap 4.2, en het te onderwerpen aan HPLC-analyse zoals beschreven in stap 4.1. Bereken vervolgens de RSD van β-sitosterolgehalte in zes monsters.
- Beoordeel de nauwkeurigheid van de methode door de standaardtoevoegingsmethode te gebruiken. Voeg hiervoor β-sitosterolreferentieoplossingen toe aan de monsters bij 80%, 100% en 120% van het β-sitosterolgehalte en herhaal elke voorwaarde drie keer zoals beschreven in stap 4.1. Evalueer de nauwkeurigheid van de methode door het gemiddelde herstel en de RSD te berekenen.
OPMERKING: De berekeningsformule van de herstelsnelheid (RR) is als volgt:
RR % = [(Mt - M0) / Ms] × 100
Waarbij Mt = de kwaliteit van β-sitosterol na toevoeging van de norm, M0 = de kwaliteit van de monsteroplossing en Ms = de kwaliteit van β-sitosterol toegevoegd.
- Bepaling van het β-sitosterolgehalte van monsters
- Neem 10 partijen authentiek Chinees geneesmiddel en vijf partijen verwante vervalsingen om monsteroplossingen te bereiden volgens stap 4.2.
- Injecteer vervolgens elke monsteroplossing en β-sitosterolreferentieoplossing om het piekgebied te bepalen onder de in stap 4.1 beschreven omstandigheden, en bereken het β-sitosterolgehalte van elk monster met behulp van de externe standaard éénpuntsmethode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chromatografische vingerafdruk van Chuanmutong en gelijkenisanalyse (SA)
De RSD-waarden van de relatieve retentietijd van precisie, herhaalbaarheid en stabiliteit lagen respectievelijk onder 0,46%, 1,65% en 0,53%; de RSD-waarden van het relatieve piekgebied lagen respectievelijk onder de 4,23%, 3,56% en 3,96%. Zoals te zien is in figuur 1A,B, waren er 12 verschillende gemeenschappelijke pieken (van piek 1 tot piek 12) in de HPLC-vingerafdrukken in de 10 authentieke Chuanmutong-monsters. Omdat het piekgebied van nr. 10 relatief groot was, was de resolutie goed; omdat het een component was die in elk monster aanwezig was, werd het gebruikt als referentiepiek om de stabiliteit en reproduceerbaarheid van de vingerafdruk te onderzoeken. Vervolgens werd piek nr. 10 genomen als de referentiepiek (S) en werd de relatieve retentietijd van de resterende 11 pieken berekend.
In de gelijkenisanalyse geldt dat hoe dichter de correlatiecoëfficiënt bij 1 ligt, hoe hoger de gelijkenis tussen de monsters. Zoals weergegeven in tabel 1, waren de gelijkenisgraden van 10 partijen Chuanmutong 0,910-0,989. Deze resultaten toonden aan dat de 10 partijen Chuanmutong een hoge gelijkenis en goede consistentie hadden, die kan worden gebruikt om de algehele kwaliteit van Chuanmutong te evalueren. Zoals te zien is in figuur 1C, werden de vingerafdrukken van vijf partijen van zijn overspeligen verkregen. De overeenkomst tussen de vingerafdrukken van vijf partijen overspeligen en de controlevingerafdrukken van Chuanmutong was slechts 0,133-0,720 (tabel 1), wat aangeeft dat er duidelijke verschillen zijn tussen de authentieke monsters en de gerelateerde overspeligen. De verschillen concentreerden zich vooral in de chromatografische piekgetallen op het chromatogram na 28-55 min. Zo kunnen de controle-vingerafdrukken van Chuanmutong de authentieke monsters effectief onderscheiden van de verwante overspeligen.
SPSS 26 statistische software werd gebruikt voor CA-analyse in dit experiment (figuur 2A); 15 partijen monsters werden verdeeld in twee categorieën wanneer de classificatieafstand 20 was. De eerste categorie was 10 partijen Chuanmutong en zijn gebruikelijke overspeligen (CC). De tweede categorie waren de overspeligen van Chuanmutong, waaronder DC, DE, XS en SMT. Wanneer de classificatieafstand vier was, werden alle monsters in vier categorieën verdeeld. De eerste categorie was 10 partijen Chuanmutong, de tweede categorie was CC, de derde categorie was SMT en XS en de vierde categorie was DC en DE. De classificatieresultaten toonden aan dat de kwaliteit van de authentieke variëteiten van Chuanmutong in principe hetzelfde was en dat er duidelijke verschillen waren met alle overspelige stoffen. Tegelijkertijd was CC, in vergelijking met andere overspeligen, dichter bij de authentieke variëteit van Chuanmutong, maar het kan nog steeds worden onderscheiden wanneer de classificatieafstand wordt verkleind.
De gemeenschappelijke piekgebieden van de 15 batches monsters werden geïmporteerd in data-analysesoftware voor PCA-analyse en de scorematrix (R2x = 0,994, Q2 = 0,961) (figuur 2B) toonde aan dat het clustereffect van de 15 batches monsters uitgesproken was. Aan de rechterkant van de Y-as bevonden zich 10 partijen Chuanmutong en CC. Onder hen bevond CC zich in het eerste kwadrant, dat verschilt van de authentieke variëteiten van Chuanmutong. De linkerkant van de Y-as waren de overspeligen, waaronder SMT, XS, DE en DC. Onder hen bevonden SMT en XS zich in het tweede kwadrant en DE en DC bevonden zich in het derde kwadrant. Bij het vergelijken van de authentieke variëteiten van Chuanmutong en de conventionele overspelige stoffen, is het verschil tussen CC en authentieke variëteiten relatief klein, terwijl het verschil tussen de authentieke en andere overspelige stoffen duidelijk is.
Het gemeenschappelijke piekgebied van Chuanmutong en zijn overspeligen werd gebruikt als variabele, geïmporteerd in de data-analysesoftware voor OPLS-DA, en vervolgens werd de scorematrix getekend (figuur 3A). De R2x [1] van het OPLS-DA-model was 0,695 en de R2x [2] was 0,605, die beide groter zijn dan 0,5, wat aangeeft dat het model stabiel en betrouwbaar is en kan worden gebruikt om authentieke monsters van overspeligen te onderscheiden.
Uit figuur 3A blijkt dat de monsterpunten van de authentieke en andere overspeligen volledig gescheiden waren en dat er geen kruising was tussen de bemonsteringspunten. Alle monsters werden verdeeld in drie delen. De authentieke variëteiten van Chuanmutong en CC waren vergelijkbaar. De monsters van XS, DC en DE werden gegroepeerd in één klasse en de steekproef van SMT was de laatste klasse. Verder werd de beoordelingsmethode van variabel belang in de projectie (VIP) (figuur 3B) gebruikt om de pieken van verschillende componenten in de vingerafdruk van elk monster te screenen. VIP-> 1.0 werd als standaard gebruikt om seveb-variabelen te screenen die sterk bijdragen aan de classificatie tussen de steekproefgroepen. Volgens de screeningsresultaten waren de belangrijkste markercomponenten die het verschil in samenstelling tussen authentieke monsters en de overspeligen veroorzaakten pieken nr. 9, nr. 5, nr. 7, nr. 6, nr. 10, nr. 3 en nr. 2. De VIP-waarde van de resterende pieken was minder dan 1, wat weinig effect had op de discriminatie van monsters.
De lineaire relatie tussen het piekgebied van de β-sitosterol en de oplossingsconcentratie werd gevonden met behulp van regressieanalyse. Deze afhankelijkheid gehoorzaamde aan een vergelijking Y = 5,4918 X-4,5563, waarbij Y het piekgebied van de β-sitosterol is en X het β-sitosterolgehalte in μg / ml. Tegelijkertijd is de correlatiecoëfficiënt r = 0,9995, die aan de vereisten voldoet. De RSD van de precisietest, de stabiliteitstest en de herhaalbaarheidstest waren respectievelijk 1,76%, 4,22% en 3,85%. De resultaten tonen aan dat de bepalingsmethode van β-sitosterolgehalte een goede lineariteit, precisie en herhaalbaarheid had en dat de monsteroplossing binnen 24 uur stabiel was. Het gemiddelde procentuele herstel op drie niveaus was 101,50 %, 101,90 % en 100,72 %; de overeenkomstige RSD was respectievelijk 2,56%, 1,56% en 1,68%. Goede afspraken tussen theoretische en werkelijk vastgestelde waarden bevestigden de nauwkeurigheid en toepasbaarheid van de analysemethode. Het vloeistofchromatogram van β-sitosterol is weergegeven in figuur 4 en het gehalte aan β-sitosterol in 15 partijen monsters werd bepaald (tabel 2). De resultaten toonden aan dat de concentratie van β-sitosterol in 10 partijen authentieke monsters in het bereik van 97,53-161,56 μg / g lag (relatief stabiel). Deze component werd gedetecteerd in alle vijf batches van overspelige stoffen, maar de inhoud varieerde sterk.
Figuur 1: Vingerafdrukken van Chuanmutong en hun overspeligen. (A) Vingerafdrukken van 10 partijen authentieke Chuanmutong-monsters (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). B) de vingerafdrukken van referentiechromatogramen van authentieke Chuanmutong-monsters; relatieve retentietijden waren 0,18 (Piek nr. 1), 0,22 (Piek nr. 2), 0,29 (Piek nr. 3), 0,72 (Piek nr. 4), 0,75 (Piek nr. 5), 0,82 (Piek nr. 6), 0,86 (Piek nr. 7), 0,92 (Piek nr. 8), 0,96 (Piek nr. 9), 1,00 (Piek nr. 10), 1,02 (Piek nr. 11), 1,37 (Piek nr. 12). C) Vingerafdrukken van vijf partijen Chuanmutong-overspeligen (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). (D) Vergelijking tussen referentiechromatogramafdrukken van authentieke Chuanmutong-monsters en de vijf partijen van hun overspelige stoffen (S1: referentiechromatogramafdrukken, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: CA- en PCA-analyse van 10 partijen authentieke Chuanmutong-monsters en vijf partijen overspelige stoffen. (A) CA-analyse. B) PSO-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: OPLS-DA scorekaart en VIP-scorekaart van 10 batches authentieke Chuanmutong-monsters en vijf partijen overspelige stoffen. (A) OPLS-DA-scorekaart. (B) VIP score kaart. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het vloeistofchromatogram van β-sitosterol. S1: β-sitosterol, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Monsters | Naam | Gelijkenis |
| de echte variëteiten van Chuanmutong | Cmt-1 | 0.947 |
| Cmt-2 | 0.910 | |
| Cmt-3 | 0.989 | |
| Cmt-4 | 0.937 | |
| Cmt-5 | 0.989 | |
| Cmt-6 | 0.988 | |
| Cmt-7 | 0.956 | |
| Cmt-8 | 0.959 | |
| Cmt-9 | 0.939 | |
| Cmt-10 | 0.966 | |
| overspelige stoffen | CC | 0.599 |
| DC | 0.720 | |
| DE | 0.133 | |
| XS | 0.694 | |
| SMT | 0.180 |
Tabel 1: Resultaten van gelijkenis van 10 partijen authentieke Chuanmutong-monsters en hun overspelige stoffen. Door de relevante gegevens te importeren in het Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System, werd de gelijkenis van 10 partijen authentieke Chuanmutong-monsters en vijf partijen overspelige stoffen berekend.
| Monsters | Naam | Inhoud (μg/g) |
| de echte variëteiten van Chuanmutong | Cmt-1 | 103.5 |
| Cmt-2 | 124.6 | |
| Cmt-3 | 131 | |
| Cmt-4 | 121.1 | |
| Cmt-5 | 97.5 | |
| Cmt-6 | 113.8 | |
| Cmt-7 | 105.6 | |
| Cmt-8 | 161.6 | |
| Cmt-9 | 118 | |
| Cmt-10 | 123.5 | |
| overspelige stoffen | CC | 157.4 |
| DC | 165.6 | |
| DE | 32.9 | |
| XS | 69.7 | |
| SMT | 192.2 |
Tabel 2: Bepalingsresultaten van het β-sitosterolgehalte in de authentieke Chuanmutong-monsters en hun overspelige stoffen.
Aanvullende figuur 1: Vloeistofchromatografie onder verschillende monstervoorbereidingsomstandigheden en verschillende chromatografische omstandigheden. (A) De mobiele fasesystemen (S1: acetonitril-0,1% mierenzuuroplossing, S2: acetonitril-0,5% azijnzuuroplossing, S3: acetonitril-zuiver water, S4: acetonitril-0,05% fosforzuuroplossing, S5: methanol-zuiver water). (B) De detectiegolflengten (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). C) De kolomtemperaturen (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) De debieten (S1: 0,8 ml/min, S2: 0,9 ml/min, S3: 1,0 ml/min). (E) De extractiemethoden (S1: ultrasone extractie, S2: refluxextractie). (F) De extractiemiddelen (S1: ethylacetaat, S2: ethanol, S3: chloroform, S4: n-butanol, S5: methanol). (G) De extractietijd (S1: 15 min, S2: 30 min, S3: 60 min). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Het vloeistofchromatogram van ergosterol, stigmasterol en authentieke Chuanmutong. S1: stigmasterol, S2: ergosterol, S3: CMT-4. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De monsterverzameling voor onderzoek is de eerste belangrijke stap naar het construeren van multi-patroonherkenning bij het identificeren van de authenticiteit van Chinese medicinale materialen. Door marktonderzoek ontdekten we dat Sichuan Ya'an, Liangshan en Leshan de belangrijkste productiegebieden van wilde hulpbronnen van Chuanmutong zijn. De verwante rassen van hetzelfde geslacht hebben ook dezelfde geografische spreiding 6,20; CC, DC, DE, XS en SMT worden vaak misbruikt als Chuangmutong16,21; daarom werden in deze studie 10 partijen authentieke Chuanmutong en vijf partijen gemengde monsters verzameld op de bovengenoemde plaatsen van oorsprong, en de nauwkeurigheid van de variëteiten werd bevestigd.
De tweede belangrijke stap is het screenen van de detectieomstandigheden van de HPLC-vingerafdruk, die zoveel mogelijk informatie over de chemische componenten kan weergeven. In deze studie werden, zoals weergegeven in aanvullende figuur 1, het aantal en de oppervlakte van chromatografische pieken verkregen onder verschillende bereidingsomstandigheden, waaronder de extractiemethoden, extractiemiddelen en extractietijd. De optimale bereidingsmethode van de Chuanmutong-monsteroplossing werd bepaald. Aan de andere kant werden het aantal en de resolutie van chromatografische pieken van de monsters onder verschillende chromatografische omstandigheden vergeleken. De mobiele fasesystemen, zoals acetonitril-0,1% mierenzuuroplossing, acetonitril-0,5% azijnzuuroplossing, acetonitril-zuiver water, acetonitril-0,05% fosforzuuroplossing en methanol-zuiver water, de detectiegolflengten, zoals 205 nm, 230 nm, 250 nm en 300 nm, de kolomtemperaturen, zoals 20 °C, 30 °C en 40 °C, en de stroomsnelheden, zoals 0,8-1,0 ml/min, werden onderzocht. De optimale chromatografische omstandigheden voor het analyseren van de monsters van Chuanmutong werden bepaald. Verder werd de haalbaarheid ervan bevestigd door methodologische validatie en werd de detectiemethode van de HPLC-vingerafdruk van Chuanmutong met succes geconstrueerd.
De derde belangrijke stap is het analyseren en vinden van de informatie die anders is in de vingerafdrukken van authentieke Chinese geneeskunde en zijn overspeligen. In deze studie werd ten eerste de gelijkenis van vingerafdrukken geanalyseerd met behulp van SESCF-TCM (versie 2012). Er werd vastgesteld dat de gelijkenis tussen de vingerafdrukken van 10 partijen authentieke Chuanmutong-monsters en de controlekenmerkende vingerafdruk zeer hoog was. Ter vergelijking: de gelijkenis tussen de vingerafdrukken van vijf partijen overspelige stoffen en de controlekenmerkende vingerafdruk was significant lager dan die van authentieke monsters. CA, PCA en OPLS-DA werden vervolgens verder geïntroduceerd om de gemeenschappelijke piekinformatie van de chemische vingerafdrukken te analyseren. Zowel CA- als PCA-resultaten tonen aan dat de veelgebruikte overspelige CC onder verschillende overspeligen relatief dichter bij de authentieke ligt, wat moeilijk te onderscheiden is. Wanneer de classificatieafstand van CA echter wordt gewijzigd in vier, kan de effectieve identificatie tussen het authentieke en het overspelige worden bereikt. Op basis van de 12 gemeenschappelijke pieken van authentieke materialen werden de bijdragewaarden van differentiële pieken van overspelige stoffen kwantitatief geëvalueerd door OPLS-DA en verkregen zeven differentiële chromatografische pieken, namelijk piek nr. 9, piek nr. 5, piek nr. 7, piek nr. 6, piek nr. 10, piek nr. 3 en piek nr. 2. Deze kunnen worden gebruikt om de authentieke en nepmaterialen van Chuanmutong effectief te identificeren, die de belangrijkste gemarkeerde componenten zijn van het verschil tussen het authentieke en het overspelige.
De nieuwste editie van Chinese Farmacopee bevat nog niet de bepaling van de inhoud van de effectieve componenten van Chuanmutong. Om de kwaliteitscontrole te verbeteren, onderzocht deze studie methoden voor inhoudsbepaling van actieve componenten zoals β-sitosterol, ergosterol, sitosterol en oleanolic acid gerelateerd aan de diuretische werking in eerdere rapporten 22,23,24,25,26. Zoals te zien is in aanvullende figuur 2, werd ergosterol niet gedetecteerd in authentieke Chuanmutong, en stigmasterol was moeilijk te scheiden in het chromatogram en kon niet nauwkeurig worden gekwantificeerd. Ten slotte werd de methode voor de bepaling van het gehalte van β-sitosterol vastgesteld; de detectieresultaten toonden aan dat β-sitosterol werd aangetroffen in 10 partijen authentieke Chuanmutong-monsters en vijf partijen overspelige middelen. Daarom was β-sitosterol niet uniek voor echte medicinale materialen. Hoewel enige informatie over de kwaliteit van Chuanmutong kan worden verstrekt, is het nog steeds noodzakelijk om de differentiële chromatografische pieken in de vingerafdrukken in de toekomst verder te analyseren om te zien of de specifieke componenten gerelateerd aan de werkzaamheid van Chuanmutong kunnen worden gevonden.
Op dit moment worden traditionele Chinese geneesmiddelen vaak geïdentificeerd door de gelijkenis van het chemische vingerafdrukspectrum. Deze indicator is echter een parameter die is gebaseerd op de algemene informatie van de chromatografische pieken van het monster, die niet meer informatie kan geven over de identificatie en de belangrijkste verschillen van verschillende monsters. Daarom gebruikte deze studie verder CA, PCA en OPLS-DA om de gemeenschappelijke piekinformatie van chemische vingerafdrukken te identificeren, vond de belangrijkste differentiële chromatografische pieken tussen authentieke en vervalste monsters van Chuanmutong en identificeerde ze met succes. Ten slotte werd HPLC-gekoppelde chemische fingerprinting voor multi-patroonherkenning geconstrueerd.
Omdat het niet ongebruikelijk is om authentieke Chinese medicinale materialen en hun overspeligen, zoals Fritillaria thunbergii, Herba Asari en Lonicera japonica, te mengen, zal deze methode een nieuwe strategie bieden voor duidelijke en wetenschappelijke identificatie van authentieke Chinese medicinale materialen en hun overspelige stoffen. Deze strategie zal van groot belang zijn voor het waarborgen van de kwaliteit van Chinese medicinale materialen in klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het project van Sichuan Traditional Chinese Medicine Administration (nr. 2020JC0088, nr. 2021MS203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q.
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
