هنا ، يتم تقديم بروتوكول لصياغة الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) التي تغلف mRNA الذي يشفر لوسيفيراز اليراعات. تم اختبار هذه LNPs لفعاليتها في المختبر في خلايا HepG2 وفي الجسم الحي في الفئران C57BL / 6.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اختبار الكفاءة في المختبر وفي الجسم الحي للجسيمات النانوية mRNA-Lipid التي تمت صياغتها عن طريق خلط الموائع الدقيقة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
جذبت الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) اهتماما واسع النطاق مؤخرا مع التطوير الناجح للقاحات COVID-19 mRNA بواسطة Moderna و Pfizer / BioNTech. أثبتت هذه اللقاحات فعالية علاجات mRNA-LNP وفتحت الباب أمام التطبيقات السريرية المستقبلية. في أنظمة mRNA-LNP ، تعمل LNPs كمنصات توصيل تحمي شحنة mRNA من التدهور بواسطة النيوكليازات وتتوسط في توصيلها داخل الخلايا. تتكون LNPs عادة من أربعة مكونات: الدهون المؤينة ، والفوسفوليبيد ، والكوليسترول ، واقتران البولي إيثيلين جلايكول (PEG) المرتبط بالدهون (lipid-PEG). هنا ، يتم صياغة LNPs التي تغلف mRNA بتشفير لوسيفيراز اليراع عن طريق خلط الموائع الدقيقة للمرحلة العضوية التي تحتوي على مكونات الدهون LNP والمرحلة المائية التي تحتوي على mRNA. ثم يتم اختبار mRNA-LNPs في المختبر لتقييم كفاءة نقلها في خلايا HepG2 باستخدام مقايسة قائمة على لوحة التوهج الحيوي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييم mRNA-LNPs في الجسم الحي في الفئران C57BL / 6 بعد الحقن في الوريد عبر الوريد الجانبي الذيل. يتم إجراء تصوير التلألؤ الحيوي لكامل الجسم باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي . تم عرض النتائج التمثيلية لخصائص mRNA-LNP ، وكفاءة نقلها في خلايا HepG2 ، والتدفق الكلي للإنارة في الفئران C57BL / 6.
المقدمة
أظهرت الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) وعدا كبيرا في السنوات الأخيرة في مجال العلاج الجيني غير الفيروسي. في عام 2018 ، وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على أول علاج على الإطلاق لتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، Onpattro by Alnylam ، لعلاج الداء النشواني الوراثي transthyretin1،2،3،4. كانت هذه خطوة مهمة إلى الأمام للجسيمات النانوية الدهنية والعلاجات القائمة على الحمض النووي الريبي. في الآونة الأخيرة ، حصلت Moderna و Pfizer / BioNTech على موافقات إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على لقاحات mRNA-LNP ضد SARS-CoV-2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: حافظ دائما على ظروف خالية من RNase عند صياغة mRNA-LNPs عن طريق مسح الأسطح والمعدات بمطهر سطحي ل RNases و DNA. استخدم فقط النصائح والكواشف الخالية من RNase.
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر في جامعة بنسلفانيا وبروتوكول معتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في جامعة بنسلفانيا.
1. إعداد ما قبل الصياغة
- املأ دورقا نظيفا سعة 4 لتر ب 200-300 مل من محلول ملحي طازج 10x مخزن بالفوسفات (PBS).
- قم بتخفيف 10x PBS في الدورق 10 أضعاف بالماء عالي النقاء للحصول على دورق من 1x PBS. تأكد من أن الحجم النهائي ل 1x PBS يتراوح بين 2-....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تمت صياغة mRNA-LNPs باستخدام أداة الموائع الدقيقة التي تمتلك متوسط قطر هيدروديناميكي يبلغ 76.16 نانومتر ومؤشر تشتت متعدد يبلغ 0.098. تم العثور على pKa من mRNA-LNPs ليكون 5.75 عن طريق إجراء مقايسة TNS18. تم حساب كفاءة التغليف لهذه mRNA-LNPs لتكون 92.3٪ باستخدام مقايسة التألق المعدلة والمعادلة 4.4. كان تركيز الحمض النووي الريبي الكلي الذي تم استخدامه لعلاج الخلايا والجرعات الحيوانية 40.24 نانوغرام / ميكرولتر. تم الحصول على هذه القيمة من مقايسة التألق المعدلة 19 ،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
باستخدام سير العمل هذا ، يمكن صياغة مجموعة متنوعة من mRNA-LNPs واختبارها من حيث كفاءتها في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن تبديل الدهون والسواغات المؤينة ودمجها بنسب مولية مختلفة ونسب مختلفة من الدهون المؤينة إلى mRNA لإنتاج mRNA-LNPs بخصائص فيزيائية كيميائية مختلفة22. هنا ، قمنا بصياغة C12-200 mRNA-LNPs بنسبة مولية تبلغ 35/16 / 46.5 / 2.5 (الدهون المؤينة: الدهون المساعدة: الكوليسترول: الدهون-PEG) بنسبة 10: 1 من الدهون المؤينة إلى وزن mRNA. تم اختبار هذه LNPs لكفاءتها في النقل في
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد تضارب في المصالح للإعلان.
شكر وتقدير
تعترف M.J.M. بالدعم المقدم من جائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH) (DP2 TR002776) ، وجائزة Burroughs Wellcome Fund Career في الواجهة العلمية (CASI) ، وجائزة CAREER لمؤسسة العلوم الوطنية الأمريكية (CBET-2145491) ، وتمويل إضافي من المعاهد الوطنية للصحة (NCI R01 CA241661 و NCI R37 CA244911 و NIDDK R01 DK123049).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.1 م حمض الهيدروكلوريك | سيجما | 7647-01-0 | |
| 0.22 & م مرشحات الحقنة | جينيسي | 25-243 | |
| 1 مل BD ذو طرف الانزلاق حقنة | BD | 309659 | |
| 1،2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [ميثوكسي (بولي إيثيلين جلايكول) -2000] (ملح الأمونيوم) (C14-PEG2000) Avanti | Polar Lipids | 880150P | |
| 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)Avanti | Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 مل أنابيب Eppendorf | فيشر Scientific | 05-408-129 | |
| 15 مل أنابيب مخروطية | فيشر Scientific | 14-959-70C | |
| 200 دليل على مختبرات الإيثانول | Decon | 2716 | |
| 23G إبر | فيشر Scientific | 14-826-6C | |
| 3 مل BD محاقن يمكن التخلص منها مع نصائح Luer-Lok | فيشر Scientific | 14-823-435 | |
| 3 مل غسيل الكلى كاسيت | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 بئر أسود الجدار أسود صفيحة | سفلية فيشر Scientific | 07-000-135 | |
| 96 لوحة سفلية بيضاء / شفافة ، TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| أسيتات الأمونيوم ، 1 كيلوغرام | منتجات أبحاث دولية | ؛ 631-61-8 | |
| أمونيوم سترات ثنائي القاعدة | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok حقنة معقمة ، تستخدم مرة واحدة ، 5 مل | BD | 309646 | |
| C12-200 دهون | كايمان | المؤينة 36699 | |
| C57BL / 6 مختبر الفئران | جاكسون | 000664 | |
| الكوليسترول | سيجما | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| كوفيت يمكن التخلص | منه فيشر | 14955129 | |
| D-Luciferin ، ملح البوتاسيوم | الحراري العلمي | L2916 | |
| DMEM ، ارتفاع نسبة الجلوكوز | Thermofisher Scientific | Scientific 11965-084 | |
| محاقن الأنسولين Exel - 0.5 مل | 1484132 | ||
| فيشر العلميمصل الأبقار الجنيني | Corning 35-010-CV | ||
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology الصف Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N / A | |
| IVIS SPECTRUM IN VIVO Imaging | System Perkin Elmer | N / A | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr خراطيش إشعال - كلاسيكي - 100 عبوة | النانو الدقيقة | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10x) درجة الحموضة 7.4 ، خال من RNase | Thermo Scientific | AM9624 | |
| البنسلين الستربتومايسين | ثيرموفيشر العلمي | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer ، (السترات 100 مليمتر) درجة الحموضة 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase بعيدا عن السطح المزيل | للتلوث Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| كلوريد الصوديوم | سيجما | 7647-14-5 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيجما | 1310-73-2 | |
| فوسفات الصوديوم | سيجما | 7601-54-9 | |
| كاشف TNS (6- (p-Toluidino) -2-ملح الصوديوم بحمض النفثالين سلفونيك) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | مالفيرن التحليلية | NanoZS |
المراجع
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
