Summary
Ici, un protocole de formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) qui encapsulent l’ARNm codant pour la luciférase lucifly est présenté. Ces LNP ont été testés pour leur puissance in vitro dans des cellules HepG2 et in vivo chez des souris C57BL/6.
Abstract
Les nanoparticules lipidiques (LNP) ont récemment attiré l’attention avec le développement réussi des vaccins à ARNm contre la COVID-19 par Moderna et Pfizer/BioNTech. Ces vaccins ont démontré l’efficacité des thérapies à base d’ARNm-LNP et ont ouvert la voie à de futures applications cliniques. Dans les systèmes ARNm-LNP, les LNP servent de plates-formes d’administration qui protègent la cargaison d’ARNm de la dégradation par les nucléases et interviennent dans leur livraison intracellulaire. Les LNP sont généralement composés de quatre composants : un lipide ionisable, un phospholipide, du cholestérol et un conjugué de polyéthylène glycol (PEG) ancré dans les lipides (lipide-PEG). Ici, les LNP encapsulant l’ARNm codant pour la luciférase luciole sont formulés par mélange microfluidique de la phase organique contenant les composants lipidiques du LNP et de la phase aqueuse contenant l’ARNm. Ces ARNm-LNP sont ensuite testés in vitro pour évaluer leur efficacité de transfection dans les cellules HepG2 à l’aide d’un test bioluminescent sur plaque. De plus, les ARNm-LNP sont évalués in vivo chez des souris C57BL/6 à la suite d’une injection intraveineuse via la veine caudale latérale. L’imagerie par bioluminescence du corps entier est réalisée à l’aide d’un système d’imagerie in vivo . Des résultats représentatifs sont présentés pour les caractéristiques de l’ARNm-LNP, leur efficacité de transfection dans les cellules HepG2 et le flux luminescent total chez les souris C57BL/6.
Introduction
Les nanoparticules lipidiques (LNP) se sont révélées très prometteuses ces dernières années dans le domaine de la thérapie génique non virale. En 2018, la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a approuvé le tout premier traitement d’interférence ARN (ARNi), Onpattro d’Alnylam, pour le traitement de l’amylose héréditaire à transthyrétine 1,2,3,4. Il s’agit d’une avancée importante pour les nanoparticules lipidiques et les thérapies à base d’ARN. Plus récemment, Moderna et Pfizer/BioNTech ont reçu l’approbation de la FDA pour leurs vaccins à ARNm-LNP contre le SRAS-CoV-2 4,5. Dans chacune de ces thérapies à base d’acides nucléiques à base de LNP, le LNP sert à protéger sa cargaison de la dégradation par les nucléases et à faciliter une administration intracellulaire puissante 6,7. Alors que les LNP ont connu du succès dans les thérapies à base d’ARNi et les applications vaccinales, les ARNm-LNP ont également été explorés pour une utilisation dans les thérapies de remplacement des protéines8 ainsi que pour la co-livraison de l’ARNm Cas9 et de l’ARN guide pour l’administration du système CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes9. Cependant, il n’existe pas de formulation spécifique qui convienne à toutes les applications, et des changements subtils dans les paramètres de formulation du LNP peuvent grandement affecter la puissance et la biodistribution in vivo 8,10,11. Ainsi, des ARNm-LNP individuels doivent être développés et évalués afin de déterminer la formulation optimale pour chaque thérapie à base de LNP.
Les LNP sont généralement formulés avec quatre composants lipidiques : un lipide ionisable, un phospholipide, du cholestérol et un conjugué polyéthylène-glycol (PEG) ancré dans les lipides (lipide-PEG)11,12,13. La puissante délivrance intracellulaire facilitée par les LNP repose, en partie, sur le composant lipidique ionisable12. Ce composant est neutre au pH physiologique mais se charge positivement dans l’environnement acide de l’endosome11. On pense que ce changement de charge ionique est un contributeur clé à l’échappement endosomal12,14,15. En plus du lipide ionisable, le composant phospholipide (lipide auxiliaire) améliore l’encapsulation de la cargaison et aide à l’échappement endosomal, le cholestérol offre une stabilité et améliore la fusion membranaire, et le lipide-PEG minimise l’agrégation et l’opsonisation du LNP dans la circulation10,11,14,16. Pour formuler le LNP, ces composants lipidiques sont combinés dans une phase organique, généralement de l’éthanol, et mélangés à une phase aqueuse contenant la cargaison d’acide nucléique. Le procédé de formulation du LNP est très polyvalent en ce sens qu’il permet de substituer et de combiner facilement différents composants à différents rapports molaires afin de formuler de nombreuses formulations de LNP avec une multitude de propriétés physico-chimiques10,17. Cependant, lors de l’exploration de cette grande variété de LNP, il est crucial que chaque formulation soit évaluée à l’aide d’une procédure standardisée pour mesurer avec précision les différences de caractérisation et de performance.
Ici, le flux de travail complet pour la formulation des ARNm-LNP et l’évaluation de leurs performances dans les cellules et les animaux sont décrits.
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Protocol
REMARQUE : Maintenez toujours des conditions exemptes de RNase lors de la formulation de RNm-LNP en essuyant les surfaces et l’équipement avec un décontaminant de surface pour les RNases et l’ADN. N’utilisez que des embouts et des réactifs sans RNase.
Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Pennsylvanie et à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Pennsylvanie.
1. Préparation de la pré-formulation
- Remplissez un bécher propre de 4 L avec 200 à 300 ml de solution saline fraîche tamponnée au phosphate (PBS) 10x.
- Diluer 10 fois le 10x PBS dans le bécher avec de l’eau ultra-pure pour obtenir un bécher de 1x PBS. Assurez-vous que le volume final du PBS 1x est compris entre 2 et 3 L.
- Placer des cassettes de dialyse (seuil de poids moléculaire de 20 kDa [MWCO]) de la capacité appropriée pour la formulation de LNP dans le bécher rempli pour les hydrater.
REMARQUE : Les cassettes de dialyse nécessitent un minimum de 2 minutes pour s’hydrater avant utilisation. - Placez une barre de mélange dans le bécher et couvrez le bécher de papier d’aluminium.
- Placez le bécher couvert sur une plaque d’agitation magnétique. Allumez la plaque d’agitation et réglez-la pour qu’elle tourne à 300-400 tr/min.
- Diluer 10 fois un tampon d’acide citrique de 100 mM (pH 3) avec de l’eau ultrapure pour créer le tampon d’acide citrique de 10 mM utilisé pour la dilution de l’ARNm.
- Fabriquez des solutions mères de lipides ionisables C12-200, de lipides auxiliaires, de cholestérol et de PEG ancré dans les lipides (lipid-PEG) en dissolvant chaque lipide dans de l’éthanol à 100 %. Les concentrations des composants lipidiques sont détaillées dans le tableau 1.
- Chauffer et mélanger les solutions mères à 37 °C pour s’assurer qu’elles sont complètement dissoutes.
2. Préparation des mélanges de lipides et d’acides nucléiques
- Calculez les volumes requis de lipides ionisables, de lipides auxiliaires, de cholestérol et de lipides-PEG en fonction du rapport molaire souhaité et du rapport lipides/poids de l’ARNm ionisable (tableau 1). Préparer 10 % de volume supplémentaire de la phase organique pour tenir compte du volume mort dans les seringues pendant la formulation.
- Combinez les volumes calculés des différents composants lipidiques dans un tube conique.
- Diluer les lipides avec de l’éthanol à 100 % jusqu’à obtenir un volume final, V, qui représente 25 % du volume final de GNL.
- Calculez la quantité d’ARNm nécessaire à la formulation en fonction du rapport lipide/poids de l’ARNm ionisable et du volume total d’ARNm-LNP nécessaire (tableau 1).
- Décongeler l’ARNm codant pour la luciférase des lucioles sur de la glace.
- Diluer l’ARNm à un volume final, 3V, trois fois le volume de la phase organique, dans un tampon d’acide citrique de 10 mM.
REMARQUE : Chaque volume lipidique, V, doit contenir suffisamment de lipides ionisables pour l’ARNm dilué dans 3V. Cela correspond au rapport lipide ionisable/poids de l’ARNm souhaité.
3. Formulation microfluidique des ARNm-LNP
- Vaporisez une lingette délicate avec un décontaminant de surface pour les RNases et l’ADN, et essuyez soigneusement l’intérieur de l’instrument microfluidique.
- Ouvrez une nouvelle cartouche microfluidique et insérez-la avec les canaux d’entrée vers le bas et vers l’extérieur.
- Assurez-vous que le bras du tube conique contient deux tubes coniques de 15 ml et qu’il est dans la position la plus à droite.
- Configurez deux tubes coniques stériles de 15 ml sur le support sans les bouchons.
- Remplissez une seringue de 5 mL avec la solution d’ARNm qui contient de l’ARNm dilué dans un tampon d’acide citrique de 10 mM.
- Remplir une seringue de 3 mL avec la solution lipidique qui contient les lipides dilués dans de l’éthanol pur à 100 %.
- Relevez le porte-cartouche sur le dispositif microfluidique.
- Insérez la seringue de 5 ml, sans l’aiguille, qui contient l’ARNm dans l’entrée gauche de la cartouche.
- Insérez la seringue de 3 ml, sans l’aiguille, qui contient les lipides dans l’entrée droite de la cartouche.
- Retournez le porte-cartouche vers le bas et fermez le couvercle de l’instrument microfluidique.
- Allumez l’instrument microfluidique à l’aide de l’interrupteur situé à l’arrière de l’instrument.
- Sélectionnez Exécution rapide.
- Sélectionnez les types de seringues appropriés pour les seringues de 5 ml et de 3 ml insérées.
- Entrez les paramètres de formulation de l’ARNm-LNP à un rapport de débit aqueux/organique de 3 :1, comme décrit dans le tableau 2.
- Appuyez sur le bouton Suivant pour passer à l’écran suivant.
- Vérifiez que les paramètres corrects ont été saisis.
- Appuyez sur le bouton Start pour formuler les ARNm-LNP.
4. Traitement post-formulation et caractérisation des ARNm-LNP
- Chargez les ARNm-LNP collectés dans le tube conique droit dans les cassettes de dialyse préalablement hydratées.
REMARQUE : Ne percez pas ou n’endommagez pas la membrane de la cassette lors du chargement des ARNm-LNP. Si la membrane est endommagée, les ARNm-LNP seront perdus lors du chargement.- Replacer les cassettes de dialyse contenant les ARNm-LNP dans le bécher contenant 1x PBS, et les laisser se dialyser pendant au moins 2 h.
- Après la dialyse, amenez les cassettes de dialyse contenant les ARNm-LNP dans une enceinte de sécurité biologique stérile et retirez les ARNm-LNP à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille.
- Filtrer stérilement les ARNm-LNP à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm et les recueillir dans un tube conique stérile.
- Placer 65 μL de la solution d’ARNm-LNP dans un microtube de 1,5 mL à des fins de caractérisation.
- Diluer 10 μL d’ARNm-LNP 1 :100 dans 990 μL de PBS 1x dans une cuvette pour la mesure de la taille hydrodynamique et de l’indice de polydispersité par diffusion dynamique de la lumière.
- Évaluer la concentration et l’efficacité d’encapsulation des ARNm-LNP à l’aide d’un test de fluorescence (c.-à-d. RiboGreen).
- Préparer une solution mère de 1x tampon TE en diluant 20x tampon TE avec de l’eau de biologie moléculaire.
- Préparez une solution mère de tampon Triton X-100 à 1 % en diluant Triton X-100 avec 1 tampon TE.
- Préparez le réactif fluorescent en diluant le stock de réactifs 1 :200 avec 1x tampon TE.
- Diluer les ARNm-LNP 1 :100 dans 1x tampon TE et 1% de tampon Triton X-100 dans une plaque à 96 puits à paroi noire et à 100 μL.
- Préparez une courbe standard de plage inférieure en diluant l’étalon d’ARN conformément aux instructions du fabricant et plaquez la courbe standard dans la plaque à 96 puits.
- Ajouter 100 μL de réactif fluorescent dilué dans chaque puits contenant de l’ARNm-LNP dilué ou un étalon dilué.
- Placez la plaque à 96 puits à l’intérieur d’un lecteur de plaques et secouez pendant 1 minute, suivie d’une attente de 4 minutes.
- Mesurer l’intensité de fluorescence de chaque puits selon le protocole du fabricant à une excitation/émission de 480 nm/520 nm.
- Utilisez la courbe standard pour convertir les valeurs de fluorescence en concentrations.
- Calculer l’efficacité d’encapsulation en soustrayant la valeur obtenue en diluant les LNP dans un tampon TE (ARNm non encapsulé) de la valeur obtenue en diluant les LNP dans 1 % de Triton X-100 (ARNm total) et en divisant par la valeur obtenue en diluant les LNP dans 1 % de Triton X-100, conformément à l’équation 4.4.
- Calculer la concentration d’ARNm-LNP utilisée pour les études cellulaires et animales en soustrayant la valeur obtenue en diluant les LNP dans un tampon TE (ARNm non encapsulé) de la valeur obtenue en diluant les LNP dans 1 % de Triton X-100 (ARNm total).
- Mesurer le pKa des ARNm-LNP en effectuant un dosage du chlorure de 6-(p-toluidino)-2-naphtalènesulfonyle (TNS).
- Préparez le réactif TNS en créant une solution de TNS à 0,16 mM dans de l’eau ultra-pure.
REMARQUE : Lorsque vous utilisez le réactif, assurez-vous de le conserver sur de la glace et à l’abri de la lumière pour éviter toute dégradation. - Préparez des solutions tamponnées de 150 mM de chlorure de sodium, 20 mM de phosphate de sodium, 25 mM de citrate d’ammonium et 20 mM d’acétate d’ammonium ajustées à différentes valeurs de pH allant de 2 à 12 par incréments de 0,5.
- Ajouter 2,5 μL de LNP à chaque solution tampon à pH ajusté dans une plaque à 96 puits à paroi noire et à fond noir.
- Ajouter le réactif TNS dans chaque puits de manière à ce que la concentration finale de TNS soit de 6 μM.
- Incuber la plaque à 96 puits dans un endroit sombre pendant 5 min.
- Mesurez la fluorescence à une excitation/émission de 322 nm/431 nm à l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence.
- Ajustez les données à une courbe sigmoïdale et calculez le pK a à l’aide de l’équation ajustée pour trouver le pH auquel 50 % de l’intensité maximale a été observée.
- Préparez le réactif TNS en créant une solution de TNS à 0,16 mM dans de l’eau ultra-pure.
- Le tableau 3 présente des résultats représentatifs de la taille hydrodynamique de l’ARNm-LNP, de la PDI, de l’efficacité d’encapsulation et du pK a.
5. Transfection in vitro de cellules HepG2
REMARQUE : Diverses autres lignées cellulaires, telles que les cellules HeLa ou les cellules HEK-293T, peuvent être utilisées pour évaluer l’efficacité de la transfection des LNP in vitro. Toutes les cellules doivent être testées négatives pour les mycoplasmes avant les études de transfection de LNP.
- Plaquer 5 000 cellules HepG2 dans chaque puits d’une plaque à fond transparent à 96 puits à paroi blanche dans 100 μL de milieu de culture cellulaire complet (DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine)
- Laisser les cellules adhérer toute la nuit dans un incubateur contrôlé de CO 2 à 37 °C et 5 % de CO2.
- Diluer les ARNm-LNP dans un milieu de culture cellulaire complet afin que la dose totale soit délivrée dans 100 μL.
- Retirez le milieu complet des puits.
- Traiter les cellules avec des ARNm-LNP dilués dans un milieu de culture cellulaire complet aux doses désirées ou un milieu complet (témoin).
- Replacez la plaque à 96 puits contenant les cellules traitées dans l’incubateur contrôlé de CO2 pendant 24 heures.
- Évaluez l’efficacité de la transfection en effectuant un dosage de la luciférase.
- Préparez le réactif de luciférase et 1x tampon de lyse cellulaire selon les instructions du fabricant.
- Sortez la plaque de 96 puits contenant les cellules de l’incubateur et apportez-la dans une enceinte de sécurité biologique.
- Retirez le milieu de culture cellulaire de chaque puits de la plaque à 96 puits.
- Ajouter 20 μL de tampon de lyse 1x dans chaque puits, puis 100 μL du réactif de dosage de la luciférase préalablement préparé.
- Protégez la plaque de la lumière et placez-la dans un lecteur de plaques pour mesurer le signal bioluminescent de chaque puits.
NOTA : La figure 1 présente des résultats représentatifs démontrant le traitement des cellules HepG2 avec des ARNm-LNP C12-200 formulés antérieurement.
6. Évaluation in vivo des ARNm-LNP chez la souris après injection dans la veine caudale
- Diluer la solution d’ARNm-LNP avec 1x PBS stérile de manière à ce que 2 μg d’ARNm total soient présents dans un volume d’injection de 100 μL dans la veine de la queue, ce qui correspond à une dose de poids corporel d’environ 0,1 mg/kg pour une souris de 20 g.
- Immobilisez chaque souris à l’aide d’une méthode approuvée et essuyez la queue avec un tampon imbibé d’alcool à 70 %.
- Remplissez une seringue à insuline de 29 G avec 100 μL d’ARNm-LNP (2 μg) ou 100 μL de PBS 1x. Retirez toutes les bulles de la seringue.
- Insérez l’aiguille avec le biseau vers le haut dans la veine caudale latérale de la souris et injectez lentement les 100 μL d’ARNm-LNP ou 1x PBS.
- Retirez l’aiguille et appliquez une pression jusqu’à ce que l’hémostase soit atteinte.
- Préparer une solution mère de 15 mg/mL de sel de potassium de d-luciférine dans 1x PBS stérile 6 heures après l’injection.
- Allumez le système d’imagerie in vivo (IVIS) et ouvrez le logiciel d’imagerie.
- Appuyez sur Initialiser pour préparer l’instrument à l’acquisition de données.
- Cochez la case à côté de la luminescence et réglez le temps d’exposition sur auto. Assurez-vous que le champ de vision correct est sélectionné pour le nombre de souris photographiées.
- Administrer 200 μL de d-luciférine par voie intrapéritonéale (150 mg de luciférine par kg de poids corporel) aux souris précédemment traitées.
- Placez les souris dans une chambre d’anesthésie réglée à 2,5 % d’isoflurane et à un débit d’oxygène de 2,0 L/min.
- Attendez 10 min que le signal de la luciférase se stabilise avant d’imager les souris traitées à l’ARNm-LNP.
- Assurez-vous que les souris sont complètement anesthésiées et redirigez la ligne d’anesthésie pour administrer l’isoflurane via des cônes nasaux à l’intérieur de la chambre d’imagerie.
- Transférez les souris sur les cônes nasaux et assurez-vous qu’elles sont sur le dos avec leur abdomen exposé.
- Fermez la porte de la chambre et cliquez sur le bouton Acquérir dans le logiciel pour obtenir des images de bioluminescence.
REMARQUE : Des résultats représentatifs de l’imagerie du corps entier de souris après un traitement par ARNm-LNP ou PBS 1X sont présentés à la figure 2.
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Representative Results
Les ARNm-LNP ont été formulés à l’aide d’un instrument microfluidique possédant un diamètre hydrodynamique moyen de 76,16 nm et un indice de polydispersité de 0,098. Le pKa des ARNm-LNP s’est avéré être de 5,75 en effectuant un test TNS18. L’efficacité d’encapsulation de ces ARNm-LNP a été calculée à 92,3 % en utilisant le test de fluorescence modifié et l’équation 4.4. La concentration globale d’ARN utilisée pour le traitement cellulaire et le dosage chez l’animal était de 40,24 ng/μL. Cette valeur a été obtenue à partir du test de fluorescence modifié19, en particulier en convertissant la fluorescence obtenue en diluant les LNP avec 1 % de Triton X-100 et 1 tampon TE à certaines concentrations et en calculant la quantité d’ARNm encapsulé.
Équation 4.4
CTX = Concentration d’ARNm des LNP dilués dans 1 % de Triton X-100
C TE = Concentration d’ARNm des LNP dilués dans 1x tampon TE
Une augmentation de la bioluminescence a été observée avec des doses croissantes lors du traitement de 5 000 cellules HepG2 par puits avec différentes doses d’ARNm-LNP. L’expression de la luciférase a été facilement détectée à la dose la plus faible (5 ng / puits) utilisée dans cette étude. Cependant, d’autres lignées cellulaires peuvent nécessiter des quantités différentes d’ARNm-LNP pour voir facilement les différences de luminescence entre les doses.
Les souris ont été traitées avec 2 μg d’ARNm-LNP et évaluées 6 h plus tard pour la bioluminescence du corps entier. Comme les ARNm-LNP C12-200 transfectent principalement le foie20, un fort signal bioluminescent a été observé dans la partie supérieure de l’abdomen des souris traitées avec nos LNP formulés. À l’aide du logiciel d’imagerie, des régions d’intérêt ont été dessinées autour des signaux hépatiques pour calculer le flux luminescent total. Dans cette expérience, le flux luminescent total était d’environ 5 x 109, ce qui est cohérent avec d’autres études menées avec cette formulation de LNP 4,21.
Tableau 1 : Composition de la phase organique. Les concentrations des différentes solutions mères lipidiques et les volumes que chaque composant contribue à la phase organique de 1,3 mL sont décrits. Les lipides sont combinés à un rapport molaire de 35/16/46,5/2,5 (C12-200 :DOPE :Cholestérol :C14-PEG2000). Un volume supplémentaire de 10 % a été préparé pour tenir compte des volumes morts de seringues pendant la formulation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Réglages des instruments microfluidiques pour la formulation d’ARNm-LNP à un rapport de débit aqueux/organique de 3 :1. La seringue de 5 mL contenant de l’ARNm dilué dans un tampon d’acide citrique de 10 mM a été insérée dans le canal central, tandis que la seringue de 3 mL contenant des lipides a été insérée dans le canal droit. Les LNP ont été formulés à un rapport pondéral de 10 :1 entre lipides ionisables et ARNm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Données de caractérisation de l’ARNm-LNP déterminées par diffusion dynamique de la lumière, un test de fluorescence modifié et un test de l’acide 2-(p-toluidino) naphtalène-6-sulfonique (TNS). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Figure 1 : Cellules HepG2 traitées avec l’ARNm-LNP luciférase luciférase de luciole. Dans l’ensemble, 5 000 cellules HepG2 ont été ensemencées par puits dans une plaque de 96 puits et laissées adhérer pendant la nuit. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine. Le milieu de culture cellulaire a été retiré avant que les cellules ne soient traitées avec des doses de 5 ng, 10 ng et 20 ng d’une formulation de LNP contenant du C12-200 encapsulant l’ARNm codant pour la luciférase des lucioles (dans 100 μL de milieu de culture cellulaire). À 24 h après le traitement, le milieu de culture cellulaire a été retiré et 20 μL de tampon de lyse 1x ont été ajoutés aux cellules avant l’ajout de 100 μL de réactif de dosage de la luciférase. La bioluminescence de chaque puits a été mesurée à l’aide d’un lecteur de plaques après une période d’incubation de 5 minutes. Les augmentations de plis sont tracées par rapport aux puits témoins constitués de cellules HepG2 non traitées. La signification statistique a été évaluée à l’aide d’une ANOVA à un facteur avec le test de Tukey post-hoc. ns, non significatif ; , p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Souris C57BL/6 traitées avec l’ARNm-LNP luciférase luciférase. Dans ce travail, 2 μg d’ARNm-LNP total dans 100 μL ou 100 μL de PBS 1x ont été administrés à des souris C57BL/6 via la veine caudale latérale. (A) La bioluminescence du corps entier des souris traitées avec de l’ARNm-LNP ou du PBS 1X a été mesurée à l’aide du système d’imagerie in vivo (IVIS) 6 h après l’administration. Le logiciel IVIS Spectrum Living Image a été utilisé pour analyser et acquérir les images du corps entier. N = 3. (B) Le flux luminescent total a été quantifié et tracé. La signification statistique a été évaluée à l’aide d’un test t bilatéral de Student. **, p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Grâce à ce flux de travail, une variété d’ARNm-LNP peuvent être formulés et testés pour leur efficacité in vitro et in vivo. Les lipides et les excipients ionisables peuvent être échangés et combinés à différents rapports molaires et à différents rapports de poids lipides/ARNm ionisables pour produire des ARNm-LNP ayant des propriétés physico-chimiques différentes22. Ici, nous avons formulé des ARNm-LNP C12-200 avec un rapport molaire de 35/16/46,5/2,5 (lipide ionisable :lipide auxiliaire :cholestérol :lipide-PEG) à un rapport lipide/poids ARNm ionisable de 10 :1. Ces LNP ont été testés pour leur efficacité de transfection in vitro dans des cellules HepG2 et in vivo chez des souris C57BL/6. Les ARNm-LNP C12-200 ont été synthétisés par mélange microfluidique à l’aide d’un instrument microfluidique disponible dans le commerce. Bien que d’autres méthodes de formulation puissent être utilisées pour formuler des LNP, telles que le mélange à la pipette ou le mélange à jonction en T 4, le mélange microfluidique formule des ARNm-LNP qui sont généralement plus petits, moins polydispersés et ont des efficacités d’encapsulation plus élevées 4,13,23,24.
La formulation des ARNm-LNP avec l’instrument microfluidique disponible dans le commerce permet une formulation simple et flexible des LNP. Le débit au début d’un cycle varie par rapport au débit cible défini lorsque les poussoirs de seringue accélèrent à pleine vitesse. Cela peut conduire à des caractéristiques de particules variables et à des résultats incohérents. Pour y remédier, l’instrument microfluidique a été conçu pour collecter les LNP formulés au début et à la fin d’une formulation en tant que déchets séparément des LNP formulés en régime permanent. Cela peut diminuer la polydispersité et conduire à des propriétés de particules plus cohérentes. Les déchets de départ peuvent être calculés en fonction de la combinaison de seringues utilisées pour la formulation, conformément au manuel du fabricant. Cependant, les déchets finaux ne subissent pas le même degré de conditions d’écoulement non stationnaires, de sorte que le volume est souvent réglé à 0,05 mL pour toutes les combinaisons de seringues, conformément à la recommandation du fabricant.
Il est essentiel de tenir compte du volume mort dans les seringues et les tubes lors de la préparation des volumes corrects des phases organique et aqueuse. La préparation de 10 % de volume supplémentaire de chaque phase permet de formuler le volume minimum de GNL souhaité. Dans ce protocole, un volume total de formulation de 4,7 mL a été introduit avec 0,7 mL de déchets, ce qui a permis de collecter 4 mL de GNL dans des conditions d’équilibre. Cependant, 1,3 mL de la phase organique et 3,9 mL de la phase aqueuse ont été préparés pour la formulation. Cela garantit que la seringue de 5 ml peut être remplie jusqu’à la marque de 3,6 ml et que la seringue de 3 ml peut être remplie jusqu’à la marque de 1,2 ml. Si le volume atteint les repères sur les seringues, les spécifications de volume utilisées sur l’instrument microfluidique sont des entrées sûres. L’écran final avant d’appuyer sur le bouton « START » est crucial pour s’assurer que tous les paramètres sont corrects. Il est important de faire une dernière vérification sur les types de seringues, les volumes dans les seringues, les volumes à distribuer, l’emplacement des seringues et les débits.
Après la formulation des ARNm-LNP, l’étape de dialyse comporte quelques considérations importantes à garder à l’esprit. Les cassettes de dialyse utilisées nécessitent un temps d’hydratation minimum de 2 min avant que les LNP puissent être chargés. Cela augmente la flexibilité de la membrane et permet à la membrane de s’ajuster plus facilement au fur et à mesure que l’échantillon est ajouté. De plus, il faut veiller à ne pas endommager ou percer les membranes des cassettes de dialyse lors de leur chargement d’ARNm-LNP. Si les membranes sont perforées ou endommagées, les ARNm-LNP formulés peuvent être facilement perdus lors du chargement.
Dans ce protocole, nous avons testé l’efficacité in vitro des ARNm-LNP dans des cellules HepG2. Cependant, d’autres types de cellules peuvent être testés pour l’efficacité de la transfection ARNm-LNP. Si des cellules non adhérentes sont utilisées, la plaque à 96 puits nécessite une centrifugation à 500 g pendant 5 min avant tout retrait du milieu de culture cellulaire25. Cela minimise toute perte de cellules lors de l’élimination du milieu. Les cellules doivent également être testées pour détecter la présence de mycoplasmes avant toute étude de transfection de LNP. Il sera difficile d’obtenir des résultats cohérents et de comparer différentes formulations de LNP si les cellules sont testées positives pour les mycoplasmes. De plus, les cellules primaires peuvent nécessiter des doses plus élevées de LNP pour mesurer la transfection sans toxicité par rapport aux lignées cellulaires. Un test de viabilité basé sur la luciférase peut être utilisé pour évaluer la toxicité de l’ARNm-LNP in vitro à des doses variables dans les cellules primaires et les lignées cellulaires18.
L’une des étapes les plus importantes pour obtenir des mesures de bioluminescence cohérentes chez différentes souris après un traitement avec la même formulation d’ARNm-LNP consiste à s’assurer que le temps entre l’injection intrapéritonéale de d-luciférine et la mesure IVIS est cohérent26. Cet intervalle de temps influe sur la stabilité du signal bioluminescent obtenu. L’intervalle de temps doit être suffisamment long pour que les fluctuations du signal soient minimisées. Une expérience préliminaire peut être menée dans laquelle les souris sont imagées toutes les minutes suivant l’injection de d-luciférine. L’intervalle de temps où le signal commence à plafonner est celui qui convient le mieux à l’expérience de transfection. Dans ce protocole, un intervalle de 10 minutes a permis d’obtenir des signaux de luminescence stables après l’injection de 150 mg de d-luciférine/kg de poids corporel, qui est couramment réalisée pour l’imagerie27,28.
De plus, la dose d’ARNm-LNP utilisée dans ce protocole (0,1 mg d’ARNm/kg de poids corporel) est faible par rapport aux doses utilisées pour évaluer la toxicité et l’efficacité thérapeutique29,30. Ces doses plus faibles permettent d’évaluer les différences de puissance des formulations uniques d’ARNm-LNP tout en ne saturant pas le signal luminescent obtenu. Cependant, cette dose peut être augmentée pour mesurer la toxicité potentielle de l’ARNm-LNP. Par exemple, la toxicité hépatique peut être évaluée en quantifiant les taux d’alanine transaminase, d’aspartate transaminase et de phosphatase alcaline dans le sérum à différents moments après l’injection d’ARNm-LNP31,32,33. Ces enzymes se trouvent normalement à de faibles niveaux dans le sérum, mais sont augmentées à la suite de lésions hépatiques. Des kits disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour quantifier la quantité de ces enzymes dans le sérum.
Dans cet exemple, nous avons utilisé de l’ARNm codant pour la luciférase des lucioles, mais d’autres ARNm rapporteurs peuvent être formulés en LNP pour évaluer la puissance. Les ARNm codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) ou mCherry peuvent être utilisés pour étudier l’administration spécifique des cellules après un traitement ARNm-LNP34,35. Une suspension unicellulaire peut être produite à partir de tissus d’intérêt, et les cellules GFP+ ou mCherry+ peuvent être évaluées par analyse de cytométrie en flux. De plus, les ARNm-LNP peuvent être formulés avec de l’ARNm codant pour l’érythropoïétine afin de mesurer la transfection hépatique par la sécrétion d’érythropoïétine dans le sérum 8,36,37. Chez les souris Ai9, l’administration d’ARNm codant pour la Cre recombinase induit une fluorescence robuste de la tomate td, qui peut servir d’autre méthode pour étudier l’administration d’ARNm-LNP à différentes populations cellulaires38,39,40. Grâce à la démonstration de ce flux de travail, nous espérons que la formulation ARNm-LNP cessera d’être un obstacle pour les chercheurs alors qu’ils explorent de nouvelles idées et possibilités pour les thérapies à base d’ARNm.
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Disclosures
Il n’y a pas de conflits d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
M.J.M. reconnaît le soutien d’un prix du directeur des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis (DP2 TR002776), d’un Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), d’un prix CAREER de la National Science Foundation des États-Unis (CBET-2145491) et d’un financement supplémentaire des National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 et NIDDK R01 DK123049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
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