Summary
Hier wird ein Protokoll zur Formulierung von Lipid-Nanopartikeln (LNPs) vorgestellt, die mRNA verkapseln, die für Glühwürmchen-Luziferase kodiert. Diese LNPs wurden in vitro in HepG2-Zellen und in vivo in C57BL/6-Mäusen auf ihre Wirksamkeit getestet.
Abstract
Lipid-Nanopartikel (LNPs) haben in jüngster Zeit mit der erfolgreichen Entwicklung der COVID-19-mRNA-Impfstoffe von Moderna und Pfizer/BioNTech große Aufmerksamkeit erregt. Diese Impfstoffe haben die Wirksamkeit von mRNA-LNP-Therapeutika nachgewiesen und die Tür für zukünftige klinische Anwendungen geöffnet. In mRNA-LNP-Systemen dienen die LNPs als Verabreichungsplattformen, die die mRNA-Fracht vor dem Abbau durch Nukleasen schützen und ihre intrazelluläre Verabreichung vermitteln. Die LNPs bestehen in der Regel aus vier Komponenten: einem ionisierbaren Lipid, einem Phospholipid, Cholesterin und einem lipidverankerten Polyethylenglykol (PEG)-Konjugat (Lipid-PEG). Hier werden LNPs, die mRNA verkapseln, die für die Glühwürmchen-Luciferase kodieren, durch mikrofluidisches Mischen der organischen Phase, die LNP-Lipidkomponenten enthält, und der wässrigen Phase, die mRNA enthält, formuliert. Diese mRNA-LNPs werden dann in vitro getestet, um ihre Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen mit einem biolumineszierenden plattenbasierten Assay zu bewerten. Zusätzlich werden mRNA-LNPs in vivo in C57BL /6-Mäusen nach intravenöser Injektion über die laterale Schwanzvene untersucht. Die Ganzkörper-Biolumineszenz-Bildgebung wird mit einem In-vivo-Bildgebungssystem durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse wurden für die mRNA-LNP-Eigenschaften, ihre Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen und den gesamten lumineszenten Fluss in C57BL/6-Mäusen gezeigt.
Introduction
Lipid-Nanopartikel (LNPs) haben sich in den letzten Jahren im Bereich der nicht-viralen Gentherapie als vielversprechend erwiesen. Im Jahr 2018 hat die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) das allererste RNA-Interferenz-Therapeutikum (RNAi), Onpattro von Alnylam, zur Behandlung der hereditären Transthyretin-Amyloidosezugelassen 1,2,3,4. Dies war ein wichtiger Schritt vorwärts für Lipid-Nanopartikel und RNA-basierte Therapien. Kürzlich erhielten Moderna und Pfizer/BioNTech FDA-Zulassungen für ihre mRNA-LNP-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 4,5. In jeder dieser LNP-basierten Nukleinsäuretherapien dient das LNP dazu, seine Fracht vor dem Abbau durch Nukleasen zu schützen und eine starke intrazelluläre Verabreichung zu erleichtern 6,7. Während LNPs in RNAi-Therapien und Impfstoffanwendungen erfolgreich sind, wurden mRNA-LNPs auch für den Einsatz in Proteinersatztherapien8 sowie für die gleichzeitige Verabreichung von Cas9-mRNA und Leit-RNA für die Verabreichung des CRISPR-Cas9-Systems für dieGeneditierung 9 untersucht. Es gibt jedoch nicht die eine spezifische Formulierung, die für alle Anwendungen gut geeignet ist, und subtile Änderungen der LNP-Formulierungsparameter können die Wirksamkeit und Bioverteilung in vivo stark beeinflussen 8,10,11. Daher müssen individuelle mRNA-LNPs entwickelt und evaluiert werden, um die optimale Formulierung für jede LNP-basierte Therapie zu bestimmen.
LNPs werden üblicherweise mit vier Lipidkomponenten formuliert: einem ionisierbaren Lipid, einem Phospholipid, Cholesterin und einem lipidverankerten Polyethylenglykol (PEG)-Konjugat (Lipid-PEG)11,12,13. Die potente intrazelluläre Verabreichung, die durch LNPs ermöglicht wird, beruht zum Teil auf der ionisierbaren Lipidkomponente12. Diese Komponente ist bei physiologischem pH-Wert neutral, wird aber im sauren Milieu des Endosoms11 positiv geladen. Es wird angenommen, dass diese Änderung der Ionenladung einen wichtigen Beitrag zur endosomalen Flucht leistet12,14,15. Zusätzlich zum ionisierbaren Lipid verbessert die Phospholipidkomponente (Helferlipid) die Verkapselung der Fracht und hilft bei der endosomalen Flucht, das Cholesterin bietet Stabilität und verbessert die Membranfusion, und das Lipid-PEG minimiert die LNP-Aggregation und Opsonisierung im Kreislauf10,11,14,16. Um das LNP zu formulieren, werden diese Lipidkomponenten in einer organischen Phase, typischerweise Ethanol, kombiniert und mit einer wässrigen Phase vermischt, die die Nukleinsäurefracht enthält. Das LNP-Formulierungsverfahren ist sehr vielseitig, da es ermöglicht, verschiedene Komponenten leicht zu substituieren und mit unterschiedlichen Molverhältnissen zu kombinieren, um viele LNP-Formulierungen mit einer Vielzahl von physikalisch-chemischen Eigenschaften zu formulieren10,17. Bei der Erforschung dieser großen Vielfalt von LNPs ist es jedoch entscheidend, dass jede Formulierung mit einem standardisierten Verfahren bewertet wird, um die Unterschiede in der Charakterisierung und Leistung genau zu messen.
Hier wird der komplette Workflow für die Formulierung von mRNA-LNPs und die Bewertung ihrer Leistung in Zellen und Tieren skizziert.
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Protocol
HINWEIS: Halten Sie bei der Formulierung von mRNA-LNPs immer RNase-freie Bedingungen aufrecht, indem Sie die Oberflächen und Geräte mit einem Oberflächendekontaminationsmittel für RNasen und DNA abwischen. Verwenden Sie nur RNase-freie Spitzen und Reagenzien.
Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren an der University of Pennsylvania und einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Pennsylvania genehmigt wurde.
1. Vorbereitung der Vorformulierung
- Füllen Sie ein sauberes 4-Liter-Becherglas mit 200-300 ml frischer 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Verdünnen Sie das 10-fache PBS im Becherglas 10-fach mit Reinstwasser, um ein Becherglas mit 1x PBS zu erhalten. Achten Sie darauf, dass das Endvolumen des 1x PBS zwischen 2-3 L liegt.
- Dialysekassetten (20 kDa Molekulargewichts-Cutoff [MWCO]) mit der für die LNP-Formulierung geeigneten Kapazität in das gefüllte Becherglas geben, um sie zu hydratisieren.
HINWEIS: Dialysekassetten benötigen mindestens 2 Minuten, um vor dem Gebrauch zu hydratisieren. - Legen Sie einen Rührstab in das Becherglas und decken Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie ab.
- Stellen Sie das abgedeckte Becherglas auf eine magnetische Rührplatte. Schalten Sie die Rührplatte ein und stellen Sie sie auf 300-400 Umdrehungen pro Minute ein.
- Verdünnen Sie einen 100 mM Zitronensäure-Pufferstock (pH 3) 10-fach mit Reinstwasser, um den 10 mM Zitronensäurepuffer zu erzeugen, der für die mRNA-Verdünnung verwendet wird.
- Stellen Sie ionisierbare C12-200-Lipid-, Hilfslipid-, Cholesterin- und lipidverankerte PEG-Stammlösungen her, indem Sie jedes Lipid in 100%igem Ethanol auflösen. Die Konzentrationen der Lipidkomponenten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Die Stammlösungen werden bei 37 °C erhitzt und gemischt, um sicherzustellen, dass sie vollständig aufgelöst sind.
2. Herstellung der Lipid- und Nukleinsäuremischungen
- Berechnen Sie die erforderlichen Volumina von ionisierbarem Lipid, Helferlipid, Cholesterin und Lipid-PEG basierend auf dem gewünschten molaren Verhältnis und dem Verhältnis von ionisierbarem Lipid zu mRNA-Gewicht (Tabelle 1). Bereiten Sie 10 % zusätzliches Volumen der organischen Phase vor, um das Totvolumen in den Spritzen während der Formulierung zu berücksichtigen.
- Kombinieren Sie die berechneten Volumina der verschiedenen Lipidkomponenten in einem konischen Röhrchen.
- Verdünnen Sie die Lipide mit 100 % Ethanol auf ein Endvolumen V, das 25 % des Endvolumens von LNP ausmacht.
- Berechnen Sie die Menge an mRNA, die für die Formulierung erforderlich ist, basierend auf dem Verhältnis von ionisierbarem Lipid zu mRNA-Gewicht und dem Gesamtvolumen des benötigten mRNA-LNP (Tabelle 1).
- Tauen Sie die Glühwürmchen-Luciferase-kodierende mRNA auf Eis auf.
- Die mRNA wird in 10 mM Zitronensäurepuffer auf ein Endvolumen von 3V, das Dreifache des Volumens der organischen Phase, verdünnt.
HINWEIS: Jedes Lipidvolumen, V, muss genügend ionisierbares Lipid für die in 3V verdünnte mRNA enthalten. Dies entspricht dem gewünschten Verhältnis von ionisierbarem Lipid zu mRNA-Gewicht.
3. Mikrofluidische Formulierung von mRNA-LNPs
- Besprühen Sie ein empfindliches Tuch mit einem Oberflächendekontaminationsmittel für RNasen und DNA und wischen Sie das Innere des mikrofluidischen Instruments gründlich ab.
- Öffnen Sie eine neue mikrofluidische Kartusche und setzen Sie sie mit den Einlasskanälen nach unten und weg ein.
- Stellen Sie sicher, dass der konische Röhrchenarm zwei konische 15-ml-Röhrchen hält und sich in der Position befindet, die am weitesten rechts liegt.
- Konfigurieren Sie zwei sterile konische 15-ml-Röhrchen auf dem Halter mit abgenommenen Kappen.
- Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit der mRNA-Lösung, die mRNA enthält, die in 10 mM Zitronensäurepuffer verdünnt ist.
- Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit der Lipidlösung, die die Lipide enthält, die in reinem 100%igem Ethanol verdünnt sind.
- Klappen Sie den Kartuschenhalter am Mikrofluidik-Gerät hoch.
- Führen Sie die 5-ml-Spritze ohne die Nadel, die mRNA enthält, in den linken Einlass der Kartusche ein.
- Führen Sie die 3-ml-Spritze ohne die Nadel, die Lipide enthält, in den rechten Einlass der Kartusche ein.
- Klappen Sie den Kartuschenhalter wieder nach unten und schließen Sie den Deckel des mikrofluidischen Instruments.
- Schalten Sie das Mikrofluidik-Gerät mit dem Schalter auf der Rückseite des Geräts ein.
- Wählen Sie Schnellausführung aus.
- Wählen Sie die richtigen Spritzentypen für die eingesetzten 5-ml- und 3-ml-Spritzen aus.
- Geben Sie die Parameter für die mRNA-LNP-Formulierung mit einem wässrigen zu organischen Flussratenverhältnis von 3:1 ein, wie in Tabelle 2 beschrieben.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um zum nächsten Bildschirm zu gelangen.
- Vergewissern Sie sich, dass die richtigen Parameter eingegeben wurden.
- Drücken Sie die Start-Taste , um die mRNA-LNPs zu formulieren.
4. Post-Formulation-Prozessierung und Charakterisierung der mRNA-LNPs
- Laden Sie die mRNA-LNPs, die im rechten konischen Röhrchen gesammelt wurden, in die zuvor hydratisierten Dialysekassetten.
HINWEIS: Die Membran der Kassette darf beim Laden der mRNA-LNPs nicht durchstochen oder beschädigt werden. Wenn die Membran beschädigt ist, gehen mRNA-LNPs bei der Belastung verloren.- Die Dialysekassetten mit den mRNA-LNPs wieder in das Becherglas mit 1x PBS geben und mindestens 2 h dialysieren lassen.
- Nach der Dialyse werden die Dialysekassetten mit den mRNA-LNPs in eine sterile Biosicherheitswerkbank gebracht und die mRNA-LNPs mit einer Spritze mit einer Nadel entfernt.
- Sterilfiltrieren Sie die mRNA-LNPs mit einem 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter und sammeln Sie sie in einem sterilen konischen Röhrchen.
- Geben Sie 65 μl der mRNA-LNP-Lösung zur Charakterisierung in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen.
- Verdünnen Sie 10 μl mRNA-LNPs 1:100 in 990 μl 1x PBS in einer Küvette zur Messung der hydrodynamischen Größe und des Polydispersitätsindex mittels dynamischer Lichtstreuung.
- Beurteilen Sie die Konzentration und Verkapselungseffizienz der mRNA-LNPs mit einem Fluoreszenzassay (z. B. RiboGreen).
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 1x TE-Puffer vor, indem Sie 20x TE-Puffer mit molekularbiologischem Wasser verdünnen.
- Bereiten Sie eine Stammlösung aus 1%igem Triton X-100-Puffer vor, indem Sie Triton X-100 mit 1x TE-Puffer verdünnen.
- Bereiten Sie das fluoreszierende Reagenz vor, indem Sie das Reagenzmaterial 1:200 mit 1x TE-Puffer verdünnen.
- Verdünnen Sie die mRNA-LNPs 1:100 in 1x TE-Puffer und 1 % Triton X-100-Puffer in einer 96-Well-Platte mit schwarzer Wand und schwarzem Boden in 100 μl.
- Bereiten Sie eine Standardkurve für den unteren Bereich vor, indem Sie den RNA-Standard gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen, und legen Sie die Standardkurve in die 96-Well-Platte.
- Geben Sie 100 μl verdünntes fluoreszierendes Reagenz in jede Vertiefung, die verdünntes mRNA-LNP oder verdünnten Standard enthält.
- Legen Sie die 96-Well-Platte in ein Plattenlesegerät und schütteln Sie sie 1 Minute lang, gefolgt von einer Wartezeit von 4 Minuten.
- Messen Sie die Fluoreszenzintensität jedes Wells gemäß dem Protokoll des Herstellers bei einer Anregung/Emission von 480 nm/520 nm.
- Verwenden Sie die Standardkurve, um die Fluoreszenzwerte in Konzentrationen umzurechnen.
- Berechnen Sie die Verkapselungseffizienz, indem Sie den Wert, der durch die Verdünnung von LNPs in TE-Puffer (nicht verkapselte mRNA) erhalten wird, von dem Wert subtrahieren, der durch die Verdünnung von LNPs in 1 % Triton X-100 (Gesamt-mRNA) erhalten wird, und durch den Wert dividieren, der durch die Verdünnung von LNPs in 1 % Triton X-100 gemäß Gleichung 4.4 erhalten wird.
- Berechnen Sie die mRNA-LNP-Konzentration, die für Zell- und Tierstudien verwendet wird, indem Sie den Wert, der durch die Verdünnung von LNPs im TE-Puffer (nicht verkapselte mRNA) erhalten wird, von dem Wert subtrahieren, der durch die Verdünnung von LNPs in 1 % Triton X-100 (Gesamt-mRNA) erhalten wird.
- Messen Sie den pKa der mRNA-LNPs durch einen 6-(p-Toluidino)-2-Naphthalinsulfonylchlorid (TNS)-Assay.
- Bereiten Sie das TNS-Reagenz vor, indem Sie eine 0,16 mM TNS-Lösung in Reinstwasser herstellen.
HINWEIS: Wenn Sie das Reagenz verwenden, achten Sie darauf, es auf Eis und vor Licht geschützt aufzubewahren, um eine Verschlechterung zu vermeiden. - Es werden gepufferte Lösungen von 150 mM Natriumchlorid, 20 mM Natriumphosphat, 25 mM Ammoniumcitrat und 20 mM Ammoniumacetat hergestellt, die auf verschiedene pH-Werte von 2 bis 12 in Schritten von 0,5 eingestellt sind.
- Geben Sie 2,5 μl LNP zu jeder pH-angepassten Pufferlösung in eine 96-Well-Platte mit schwarzer Wand, schwarzem Boden.
- Geben Sie das TNS-Reagenz in jede Vertiefung, so dass die endgültige TNS-Konzentration 6 μM beträgt.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Platte 5 Minuten lang an einem dunklen Ort.
- Messen Sie die Fluoreszenz bei einer Anregung/Emission von 322 nm/431 nm mit einem Fluoreszenzplatten-Reader.
- Passen Sie die Daten an eine sigmoidale Kurve an und berechnen Sie pKa , indem Sie die angepasste Gleichung verwenden, um den pH-Wert zu ermitteln, bei dem 50 % der maximalen Intensität beobachtet wurden.
- Bereiten Sie das TNS-Reagenz vor, indem Sie eine 0,16 mM TNS-Lösung in Reinstwasser herstellen.
- Repräsentative Ergebnisse für die hydrodynamische mRNA-LNP-Größe, PDI, Verkapselungseffizienz und pKa sind in Tabelle 3 dargestellt.
5. In-vitro-Transfektion von HepG2-Zellen
HINWEIS: Verschiedene andere Zelllinien, wie z. B. HeLa-Zellen oder HEK-293T-Zellen, können zur Beurteilung der Transfektionseffizienz von LNPs in vitro verwendet werden. Alle Zellen sollten vor den LNP-Transfektionsstudien negativ auf Mykoplasmen getestet werden.
- Platte mit 5.000 HepG2-Zellen in jeder Vertiefung einer weißwandigen 96-Well-Platte mit klarem Boden in 100 μl vollständigem Zellkulturmedium (DMEM ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin)
- Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem kontrollierten CO 2- Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 anhaften.
- Verdünnen Sie die mRNA-LNPs in vollständigem Zellkulturmedium, so dass die Gesamtdosis in 100 μl abgegeben wird.
- Entnehmen Sie das komplette Medium aus den Vertiefungen.
- Behandeln Sie die Zellen entweder mit mRNA-LNPs, die in vollständigem Zellkulturmedium in den gewünschten Dosen verdünnt sind, oder mit vollständigem Medium (Kontrolle).
- Legen Sie die 96-Well-Platte mit den behandelten Zellen für 24 Stunden zurück in den kontrollierten CO2 - Inkubator.
- Beurteilen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie einen Luciferase-Assay durchführen.
- Bereiten Sie das Luciferase-Reagenz und 1x Zelllysepuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Nehmen Sie die 96-Well-Platte mit den Zellen aus dem Inkubator und bringen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank.
- Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte.
- Geben Sie 20 μl 1x Lysepuffer in jede Vertiefung, gefolgt von 100 μl des zuvor hergestellten Luciferase-Assay-Reagenz.
- Schützen Sie die Platte vor Licht und legen Sie die Platte in ein Plattenlesegerät, um das biolumineszierende Signal jeder Vertiefung zu messen.
HINWEIS: Repräsentative Ergebnisse, die die Behandlung von HepG2-Zellen mit zuvor formulierten C12-200 mRNA-LNPs zeigen, sind in Abbildung 1 dargestellt.
6. In-vivo-Evaluierung von mRNA-LNPs in Mäusen nach Schwanzveneninjektion
- Verdünnen Sie die mRNA-LNP-Lösung mit sterilem 1x PBS, so dass 2 μg Gesamt-mRNA in einem 100-μl-Schwanzvenen-Injektionsvolumen vorhanden sind, was einer Körpergewichtsdosis von etwa 0,1 mg/kg für eine 20-g-Maus entspricht.
- Halten Sie jede Maus mit einer zugelassenen Methode zurück und wischen Sie den Schwanz mit einem Pad ab, das mit 70%igem Alkohol angefeuchtet ist.
- Füllen Sie eine 29-g-Insulinspritze entweder mit 100 μl mRNA-LNP (2 μg) oder 100 μl 1x PBS. Entfernen Sie alle Blasen aus der Spritze.
- Führen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in die seitliche Schwanzvene der Maus ein und injizieren Sie langsam die 100 μl mRNA-LNP oder 1x PBS.
- Entfernen Sie die Nadel und üben Sie Druck aus, bis die Hämostase erreicht ist.
- Bereiten Sie 6 Stunden nach der Injektion eine Stammlösung von 15 mg/ml d-Luciferin-Kaliumsalz in sterilem 1x PBS vor.
- Schalten Sie das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) ein und öffnen Sie die Bildgebungssoftware.
- Drücken Sie auf Initialisieren , um das Gerät für die Datenerfassung vorzubereiten.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Lumineszenz und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto ein. Stellen Sie sicher, dass das richtige Sichtfeld für die Anzahl der Mäuse ausgewählt ist, die abgebildet werden.
- Den zuvor behandelten Mäusen werden 200 μl d-Luciferin intraperitoneal (150 mg Luciferin pro kg Körpergewicht) verabreicht.
- Legen Sie die Mäuse in eine Anästhesiekammer, die auf 2,5 % Isofluran und eine Sauerstoffflussrate von 2,0 l/min eingestellt ist.
- Warten Sie 10 Minuten, bis sich das Luciferase-Signal stabilisiert hat, bevor Sie die mit mRNA-LNP behandelten Mäuse abbilden.
- Stellen Sie sicher, dass die Mäuse vollständig betäubt sind, und leiten Sie die Anästhesieleitung um, um Isofluran über Nasenkegel in der Bildgebungskammer zu verabreichen.
- Setzen Sie die Mäuse auf die Nasenkegel und stellen Sie sicher, dass sie auf dem Rücken liegen und ihr Hinterleib freiliegt.
- Schließen Sie die Kammertür und klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Erfassen , um Biolumineszenzbilder zu erhalten.
HINWEIS: Repräsentative Ergebnisse für die Ganzkörperbildgebung von Mäusen nach mRNA-LNP- oder 1X-PBS-Behandlung sind in Abbildung 2 dargestellt.
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Representative Results
mRNA-LNPs wurden mit einem mikrofluidischen Instrument formuliert, das einen durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 76,16 nm und einen Polydispersitätsindex von 0,098 besaß. Der pKa der mRNA-LNPs wurde durch Durchführung eines TNS-Assays18 auf 5,75 ermittelt. Die Verkapselungseffizienz für diese mRNA-LNPs wurde unter Verwendung des modifizierten Fluoreszenzassays und Gleichung 4.4 mit 92,3 % berechnet. Die Gesamt-RNA-Konzentration, die für die Zellbehandlung und die Tierdosierung verwendet wurde, betrug 40,24 ng/μl. Dieser Wert wurde aus dem modifizierten Fluoreszenzassay19 erhalten, insbesondere aus der Umwandlung der Fluoreszenz, die durch Verdünnen der LNPs mit 1% Triton X-100 und 1x TE-Puffer auf bestimmte Konzentrationen und Berechnen der Menge an verkapselter mRNA erhalten wurde.
Gleichung 4.4
CTX = Konzentration der mRNA aus LNPs, verdünnt in 1% Triton X-100
C TE = Konzentration von mRNA aus LNPs, verdünnt in 1x TE-Puffer
Eine zunehmende Biolumineszenz wurde mit steigenden Dosen bei der Behandlung von 5.000 HepG2-Zellen pro Well mit unterschiedlichen Dosen von mRNA-LNP beobachtet. Die Luciferase-Expression konnte bei der niedrigsten Dosis (5 ng/Well), die in dieser Studie verwendet wurde, leicht nachgewiesen werden. Andere Zelllinien können jedoch unterschiedliche Mengen an mRNA-LNP benötigen, um Unterschiede in der Lumineszenz zwischen den Dosen leicht zu erkennen.
Die Mäuse wurden mit 2 μg mRNA-LNP behandelt und 6 h später auf Ganzkörper-Biolumineszenz untersucht. Da C12-200 mRNA-LNPs überwiegend die Lebertransfizieren 20, wurde ein starkes biolumineszierendes Signal im Oberbauch der Mäuse beobachtet, die mit unseren formulierten LNPs behandelt wurden. Mit Hilfe der Bildgebungssoftware wurden interessante Regionen um die Lebersignale herum gezeichnet, um den gesamten lumineszierenden Fluss zu berechnen. In diesem Experiment betrug der gesamte Lumineszenzfluss etwa 5 x 109, was mit anderen Studien übereinstimmt, die mit dieser LNP-Formulierung durchgeführt wurden 4,21.
Tabelle 1: Zusammensetzung der organischen Phase. Die Konzentrationen der einzelnen Lipidstammlösungen und die Volumina, die jede Komponente zur organischen 1,3-ml-Phase beiträgt, werden beschrieben. Die Lipide werden in einem molaren Verhältnis von 35/16/46,5/2,5 (C12-200: DOPE: Cholesterin:C14-PEG2000) kombiniert. Ein zusätzliches Volumen von 10 % wurde hergestellt, um das Totvolumen der Spritze während der Formulierung zu berücksichtigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Einstellungen des mikrofluidischen Instruments für die mRNA-LNP-Formulierung bei einem wässrigen zu organischen Flussratenverhältnis von 3:1. Die 5-ml-Spritze, die in 10 mM Zitronensäurepuffer verdünnte mRNA enthielt, wurde in den mittleren Kanal eingeführt, während die 3-ml-Spritze, die Lipide enthielt, in den rechten Kanal eingeführt wurde. LNPs wurden mit einem Gewichtsverhältnis von 10:1 ionisierbarer Lipide zu mRNA formuliert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: mRNA-LNP-Charakterisierungsdaten, die durch dynamische Lichtstreuung, einen modifizierten Fluoreszenzassay und einen 2-(p-Toluidino)naphthalin-6-sulfonsäure (TNS)-Assay bestimmt wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Abbildung 1: HepG2-Zellen, die mit Glühwürmchen-Luciferase-mRNA-LNP behandelt wurden. Insgesamt wurden 5.000 HepG2-Zellen pro Well in eine 96-Well-Platte gesät und über Nacht anhaften gelassen. Die Zellen wurden in DMEM kultiviert und mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt. Das Zellkulturmedium wurde entfernt, bevor die Zellen mit 5 ng, 10 ng und 20 ng Dosen einer C12-200-haltigen LNP-Formulierung behandelt wurden, die Glühwürmchen-Luciferase-kodierende mRNA (in 100 μl Zellkulturmedium) verkapselt. 24 Stunden nach der Behandlung wurde das Zellkulturmedium entfernt und 20 μl 1x Lysepuffer wurden den Zellen zugesetzt, bevor 100 μl Luciferase-Assay-Reagenz hinzugefügt wurden. Die Biolumineszenz aus jedem Well wurde nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten mit einem Plattenleser gemessen. Die Faltungszunahmen sind relativ zu Kontrollvertiefungen aufgetragen, die aus unbehandelten HepG2-Zellen bestanden. Die statistische Signifikanz wurde mittels einer unidirektionalen ANOVA mit post-hoc Tukey-Test evaluiert. ns, nicht signifikant; , p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: C57BL/6-Mäuse, die mit Glühwürmchen-Luciferase-mRNA-LNP behandelt wurden. In dieser Arbeit wurden C57BL/6-Mäusen 2 μg Gesamt-mRNA-LNP in 100 μL oder 100 μL 1x PBS über die laterale Schwanzvene verabreicht. (A) Die Ganzkörper-Biolumineszenz der Mäuse, die entweder mit mRNA-LNP oder 1X PBS behandelt wurden, wurde 6 Stunden nach der Verabreichung mit dem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) gemessen. Die IVIS Spectrum Living Image Software wurde verwendet, um die Ganzkörperbilder zu analysieren und zu erfassen. N = 3. (B) Der gesamte Lumineszenzfluss wurde quantifiziert und aufgetragen. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen Student's t-Test evaluiert. **, p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Mit diesem Arbeitsablauf kann eine Vielzahl von mRNA-LNPs formuliert und auf ihre In-vitro- und In-vivo-Effizienz getestet werden. Ionisierbare Lipide und Hilfsstoffe können ausgetauscht und mit unterschiedlichen molaren Verhältnissen und unterschiedlichen Gewichten von ionisierbaren Lipiden zu mRNA kombiniert werden, um mRNA-LNPs mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften herzustellen22. Hier formulierten wir C12-200 mRNA-LNPs mit einem molaren Verhältnis von 35/16/46,5/2,5 (ionisierbares Lipid:Helferlipid:Cholesterin:Lipid-PEG) bei einem Verhältnis von 10:1 ionisierbarem Lipid zu mRNA. Diese LNPs wurden in vitro in HepG2-Zellen und in vivo in C57BL/6-Mäusen auf ihre Transfektionseffizienz getestet. Die C12-200 mRNA-LNPs wurden durch mikrofluidisches Mischen mit einem kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Instrument synthetisiert. Obwohl andere Formulierungsmethoden zur Formulierung von LNPs verwendet werden können, wie z. B. das Mischen von Pipetten oder T-Junctions 4, formuliert das mikrofluidische Mischen mRNA-LNPs, die im Allgemeinen kleiner und weniger polydispers sind und eine höhere Verkapselungseffizienz aufweisen 4,13,23,24.
Die Formulierung von mRNA-LNPs mit dem kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Instrument ermöglicht die einfache und flexible Formulierung von LNPs. Die Durchflussrate zu Beginn eines Laufs weicht von der eingestellten Zieldurchflussrate ab, wenn die Spritzenschieber auf volle Geschwindigkeit beschleunigen. Dies kann zu unterschiedlichen Partikeleigenschaften und inkonsistenten Ergebnissen führen. Um dieses Problem zu lösen, wurde das mikrofluidische Instrument so konzipiert, dass es die LNPs, die zu Beginn und am Ende einer Formulierung formuliert wurden, getrennt von den LNPs, die unter stationären Bedingungen formuliert wurden, als Abfall sammelt. Dies kann die Polydispersität verringern und zu gleichmäßigeren Partikeleigenschaften führen. Der Startabfall kann auf der Grundlage der Kombination von Spritzen berechnet werden, die für die Formulierung gemäß dem Handbuch des Herstellers verwendet werden. Der Endabfall erfährt jedoch nicht den gleichen Grad an nichtstationären Flussbedingungen, so dass das Volumen für alle Spritzenkombinationen gemäß der Empfehlung des Herstellers häufig auf 0,05 ml eingestellt wird.
Es ist wichtig, das Totvolumen in Spritzen und Röhrchen zu berücksichtigen, wenn die richtigen Volumina der organischen und wässrigen Phasen hergestellt werden. Die Herstellung von 10 % zusätzlichem Volumen jeder Phase stellt sicher, dass das gewünschte Mindestvolumen an LNP formuliert werden kann. In diesem Protokoll wurde ein Gesamtformulierungsvolumen von 4,7 ml mit 0,7 ml Abfall eingegeben, was zu 4 ml LNP führte, die unter stationären Bedingungen gesammelt wurden. Es wurden jedoch 1,3 ml der organischen Phase und 3,9 ml der wässrigen Phase für die Formulierung hergestellt. Dadurch wird sichergestellt, dass die 5-ml-Spritze bis zur 3,6-ml-Markierung und die 3-ml-Spritze bis zur 1,2-ml-Markierung befüllt werden kann. Wenn das Volumen die Markierungen auf den Spritzen erreicht, sind die auf dem mikrofluidischen Gerät verwendeten Volumenangaben sichere Eingaben. Der letzte Bildschirm vor dem Drücken der "START"-Taste ist entscheidend, um sicherzustellen, dass alle Parameter korrekt sind. Es ist wichtig, eine abschließende Kontrolle der Spritzentypen, der Volumina in den Spritzen, der zu dosierenden Volumina, der Spritzenplatzierung und der Durchflussraten durchzuführen.
Nach der Formulierung von mRNA-LNPs sind im Dialyseschritt einige wichtige Überlegungen zu beachten. Die verwendeten Dialysekassetten benötigen eine Mindesthydratationszeit von 2 min, bevor die LNPs geladen werden können. Dies erhöht die Flexibilität der Membran und ermöglicht es der Membran, sich bei der Zugabe der Probe leichter anzupassen. Darüber hinaus muss darauf geachtet werden, dass die Membranen der Dialysekassetten beim Beladen mit mRNA-LNPs nicht beschädigt oder durchstochen werden. Wenn die Membranen durchstochen oder beschädigt werden, können die formulierten mRNA-LNPs beim Laden leicht verloren gehen.
In diesem Protokoll haben wir die In-vitro-Effizienz von mRNA-LNPs in HepG2-Zellen getestet. Andere Zelltypen können jedoch auf die Effizienz der mRNA-LNP-Transfektion getestet werden. Wenn nicht-adhärente Zellen verwendet werden, muss die 96-Well-Platte bei 500 g für 5 Minuten zentrifugiert werden, bevor das Zellkulturmedium25 entfernt wird. Dadurch wird der Verlust von Zellen während der Mediumentfernung minimiert. Die Zellen sollten auch vor LNP-Transfektionsstudien auf das Vorhandensein von Mykoplasmen getestet werden. Es wird schwierig sein, konsistente Ergebnisse zu erhalten und verschiedene LNP-Formulierungen zu vergleichen, wenn die Zellen positiv auf Mykoplasmen getestet werden. Darüber hinaus benötigen Primärzellen möglicherweise höhere Dosen von LNP, um die Transfektion ohne Toxizität im Vergleich zu Zelllinien zu messen. Ein Luciferase-basierter Viabilitätsassay kann verwendet werden, um die mRNA-LNP-Toxizität in vitro bei unterschiedlichen Dosen sowohl in Primärzellen als auch in Zelllinien zu bewerten18.
Einer der wichtigsten Schritte, um konsistente Biolumineszenzmessungen bei verschiedenen Mäusen nach der Behandlung mit derselben mRNA-LNP-Formulierung zu erhalten, besteht darin, sicherzustellen, dass die Zeit zwischen der intraperitonealen Injektion von d-Luciferin und der IVIS-Messung konsistent ist26. Dieses Zeitintervall beeinflusst die Stabilität des erhaltenen Biolumineszenzsignals. Das Zeitintervall muss lang genug sein, damit Schwankungen im Signal minimiert werden. Es kann ein Vorversuch durchgeführt werden, bei dem die Mäuse im Minutentakt nach der D-Luciferin-Injektion abgebildet werden. Das Zeitintervall, in dem das Signal ein Plateau erreicht, ist für das Transfektionsexperiment am besten geeignet. In diesem Protokoll ermöglichte ein Intervall von 10 Minuten stabile Lumineszenzsignale nach der Injektion von 150 mg d-Luciferin/kg Körpergewicht, die üblicherweise für die Bildgebung durchgeführt wird27,28.
Darüber hinaus ist die in diesem Protokoll verwendete mRNA-LNP-Dosis (0,1 mg mRNA/kg Körpergewicht) im Vergleich zu den Dosen, die zur Beurteilung der Toxizität und der therapeutischen Wirksamkeit verwendet werden, gering29,30. Diese kleineren Dosen tragen dazu bei, Unterschiede in den Potenzen einzigartiger mRNA-LNP-Formulierungen zu bewerten, ohne das erhaltene Lumineszenzsignal zu übersättigen. Diese Dosis kann jedoch erhöht werden, um die potenzielle mRNA-LNP-Toxizität zu messen. Zum Beispiel kann die Lebertoxizität durch Quantifizierung der Spiegel von Alanin-Transaminase, Aspartat-Transaminase und alkalischer Phosphatase im Serum zu verschiedenen Zeitpunkten nach mRNA-LNP-Injektion bewertetwerden 31,32,33. Diese Enzyme sind normalerweise in geringen Mengen im Serum enthalten, werden aber infolge von Leberschäden erhöht. Kommerziell erhältliche Kits können verwendet werden, um die Menge dieser Enzyme im Serum zu quantifizieren.
In diesem Beispiel haben wir Glühwürmchen-Luciferase-kodierende mRNA verwendet, aber andere Reporter-mRNAs können in LNPs formuliert werden, um die Wirksamkeit zu bewerten. mRNAs, die für grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder mCherry kodieren, können verwendet werden, um die zellspezifische Verabreichung nach einer mRNA-LNP-Behandlung zu untersuchen34,35. Eine Einzelzellsuspension kann aus interessierenden Geweben hergestellt werden, und GFP+- oder mCherry+-Zellen können durch Durchflusszytometrie-Analyse beurteilt werden. Darüber hinaus können mRNA-LNPs mit mRNA formuliert werden, die für Erythropoietin kodiert, um die Lebertransfektion durch die Sekretion von Erythropoietin im Serum zu messen 8,36,37. In Ai9-Mäusen induziert die Verabreichung von mRNA, die für Cre-Rekombinase kodiert, eine robuste tdTomato-Fluoreszenz, die als eine weitere Methode zur Untersuchung der mRNA-LNP-Abgabe an verschiedene Zellpopulationen dienen kann38,39,40. Durch die Demonstration dieses Arbeitsablaufs hoffen wir, dass die mRNA-LNP-Formulierung kein Hindernis mehr für Forscher darstellt, wenn sie neue Ideen und Möglichkeiten für mRNA-Therapeutika erforschen.
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Disclosures
Es sind keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
M.J.M. bedankt sich für die Unterstützung durch einen New Innovator Award (DP2 TR002776 des Direktors der US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH), einen Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), einen CAREER-Preis der US-amerikanischen National Science Foundation (CBET-2145491) und zusätzliche Mittel der National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 und NIDDK R01 DK123049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
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