Summary
Представлен протокол разработки липидных наночастиц (ЛНЧ), инкапсулирующих мРНК, кодирующую люциферазу светлячка. Эти LNP были протестированы на их активность in vitro в клетках HepG2 и in vivo на мышах C57BL/6.
Abstract
Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последнее время привлекли широкое внимание в связи с успешной разработкой мРНК-вакцин против COVID-19 компаниями Moderna и Pfizer/BioNTech. Эти вакцины продемонстрировали эффективность терапии на основе мРНК-ЛЯП и открыли двери для будущих клинических применений. В системах мРНК-ЛЯП ЛЯП служат платформами доставки, которые защищают груз мРНК от деградации нуклеазами и опосредуют их внутриклеточную доставку. LNP обычно состоят из четырех компонентов: ионизируемого липида, фосфолипида, холестерина и конъюгата полиэтиленгликоля (ПЭГ) с липидной привязкой (липид-ПЭГ). Здесь ЛЯП, инкапсулирующие мРНК, кодирующую люциферазу светлячка, образуются путем микрофлюидного смешивания органической фазы, содержащей липидные компоненты LNP, и водной фазы, содержащей мРНК. Затем эти мРНК-ЛНЧ тестируются in vitro для оценки эффективности их трансфекции в клетках HepG2 с помощью анализа на основе биолюминесцентной пластины. Кроме того, мРНК-LNP оценивают in vivo у мышей C57BL/6 после внутривенной инъекции через боковую хвостовую вену. Биолюминесцентная визуализация всего тела выполняется с помощью системы визуализации in vivo . Приведены репрезентативные результаты для характеристик мРНК-ЛЯП, эффективности их трансфекции в клетках HepG2 и общего люминесцентного потока у мышей линии C57BL/6.
Introduction
Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последние годы продемонстрировали большие перспективы в области невирусной генной терапии. В 2018 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило первый в мире препарат для лечения наследственного транстиретинового амилоидоза 1,2,3,4 на основе РНК-интерференции (РНК-интерференции) Onpattro от Alnylam. Это был важный шаг вперед для липидных наночастиц и терапии на основе РНК. Совсем недавно компании Moderna и Pfizer/BioNTech получили одобрение FDA на свои вакцины мРНК-LNP против SARS-CoV-2 4,5. В каждой из этих терапий на основе ЛЯП нуклеиновых кислот ЛЯП служит для защиты груза от деградации нуклеазами и облегчения мощной внутриклеточной доставки 6,7. В то время как LNP успешно применяются в РНК-интерференционной терапии и применении вакцин, мРНК-LNP также были исследованы для использования в белковозаместительной терапии8, а также для совместной доставки мРНК Cas9 и направляющей РНК для доставки системы CRISPR-Cas9 для редактирования генов9. Тем не менее, не существует какой-то одной конкретной формулы, которая хорошо подходила бы для всех применений, и незначительные изменения в параметрах рецептуры LNP могут сильно повлиять на эффективность и биораспределение in vivo 8,10,11. Таким образом, для определения оптимальной рецептуры для каждой терапии на основе ЛНЧ необходимо разработать и оценить отдельные мРНК-ЛНЧ.
В состав LNP обычно входят четыре липидных компонента: ионизируемый липид, фосфолипид, холестерин и липидно-закрепленный конъюгат полиэтиленгликоля (ПЭГ) (липид-ПЭГ)11,12,13. Мощная внутриклеточная доставка, обеспечиваемая ЛНЧ, частично зависит от ионизируемого липидного компонента12. Этот компонент нейтрален при физиологическом рН, но становится положительно заряженным в кислой среде эндосомы11. Считается, что это изменение ионного заряда является ключевым фактором эндосомального побега12,14,15. В дополнение к ионизируемому липиду, фосфолипидный компонент (липид-хелпер) улучшает инкапсуляцию груза и способствует эндосомальному побегу, холестерин обеспечивает стабильность и усиливает слияние мембран, а липид-ПЭГ сводит к минимуму агрегацию и опсонизацию LNP в кровотоке10,11,14,16. Для создания LNP эти липидные компоненты объединяются в органическую фазу, как правило, этанол, и смешиваются с водной фазой, содержащей груз нуклеиновых кислот. Процесс разработки LNP очень универсален в том смысле, что он позволяет легко заменять и комбинировать различные компоненты при различных молярных соотношениях для создания множества рецептур LNP с множеством физико-химических свойств10,17. Тем не менее, при изучении этого огромного разнообразия LNP крайне важно, чтобы каждая рецептура оценивалась с использованием стандартизированной процедуры для точного измерения различий в характеристиках и эксплуатационных характеристиках.
В этой статье описывается полный рабочий процесс по составлению мРНК-ЛНЧ и оценке их эффективности в клетках и на животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда поддерживайте условия, свободные от РНКазы при составлении мРНК-LNP, протирая поверхности и оборудование дезинфицирующим средством для РНКаз и ДНК. Используйте только наконечники и реагенты, не содержащие РНКазы.
Все процедуры с животными проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных в Университете Пенсильвании и протоколом, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) при Университете Пенсильвании.
1. Подготовка предварительной рецептуры
- Наполните чистый стакан объемом 4 л 200-300 мл свежего 10-кратного фосфатно-солевого буфера (PBS).
- Разбавьте 10x PBS в стакане в 10 раз сверхчистой водой, чтобы получить стакан 1x PBS. Убедитесь, что окончательный объем 1x PBS составляет 2-3 л.
- Поместите диализные кассеты (20 кДа молекулярной массы [MWCO]) соответствующей емкости для состава LNP в заполненный стакан для их гидратации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диализные кассеты требуют не менее 2 минут для гидратации перед использованием. - Поместите перемешиватель в стакан и накройте стакан алюминиевой фольгой.
- Поместите накрытый стакан на магнитную пластину для перемешивания. Включите пластину для перемешивания и установите ее на вращение со скоростью 300-400 оборотов в минуту.
- Разбавьте 100 мМ лимонной кислоты (рН 3) в 10 раз сверхчистой водой, чтобы создать 10 мМ буфера лимонной кислоты, используемого для разведения мРНК.
- Приготовьте исходные растворы ионизируемых липидов, хелперных липидов, холестерина и липид-якорных ПЭГ (липид-ПЭГ) C12-200, растворив каждый липид в 100% этаноле. Концентрации липидных компонентов подробно описаны в таблице 1.
- Нагрейте и перемешайте исходные растворы при температуре 37 °C, чтобы обеспечить их полное растворение.
2. Приготовление смесей липидов и нуклеиновых кислот
- Рассчитайте необходимые объемы ионизируемых липидов, хелперных липидов, холестерина и липид-ПЭГ на основе желаемого молярного соотношения и массового отношения ионизируемого липида к массе мРНК (табл. 1). Приготовьте 10% дополнительного объема органической фазы, чтобы учесть мертвый объем в шприцах во время составления рецептуры.
- Объедините рассчитанные объемы различных липидных компонентов в конической пробирке.
- Разбавьте липиды 100% этанолом до конечного объема V, который составляет 25% от конечного объема LNP.
- Рассчитайте количество мРНК, необходимое для составления препарата, исходя из весового соотношения ионизируемых липидов и мРНК и общего объема необходимой мРНК-ЛЯП (таблица 1).
- Разморозьте мРНК, кодирующую люциферазу, на льду.
- Разбавьте мРНК до конечного объема, 3В, в три раза превышающего объем органической фазы, в буфере лимонной кислоты 10 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый объем липидов, V, должен содержать достаточное количество ионизируемого липида для мРНК, разбавленной в 3В. Это соответствует желаемому массовому соотношению ионизируемых липидов и мРНК.
3. Микрофлюидная рецептура мРНК-ЛЯП
- Распылите на деликатную салфетку дезинфицирующее средство для РНКаз и ДНК и тщательно протрите внутреннюю часть микрофлюидного прибора.
- Откройте новый микрофлюидный картридж и вставьте его впускными каналами вниз и в сторону.
- Убедитесь, что кронштейн конической пробирки удерживает две конические пробирки объемом 15 мл и находится в крайнем правом положении.
- Установите две стерильные конические пробирки объемом 15 мл на держателе со снятыми крышками.
- Наполните шприц объемом 5 мл раствором мРНК, содержащим мРНК, разведенную в 10 мМ буфере лимонной кислоты.
- Наполните шприц объемом 3 мл липидным раствором, содержащим липиды, разведенные в чистом 100% этаноле.
- Откиньте держатель картриджа на микрофлюидном устройстве.
- Вставьте шприц объемом 5 мл без иглы, содержащий мРНК, в левое входное отверстие картриджа.
- Вставьте шприц объемом 3 мл без иглы, содержащий липиды, в правое входное отверстие картриджа.
- Переверните держатель картриджа вниз и закройте крышку микрофлюидного прибора.
- Включите микрофлюидный прибор с помощью переключателя, расположенного на задней панели прибора.
- Выберите Быстрый запуск.
- Выберите правильные типы шприцев для вставленных шприцев объемом 5 мл и 3 мл.
- Введите параметры для рецептуры мРНК-ЛЯП при соотношении водного и органического потока 3:1, как описано в таблице 2.
- Нажмите кнопку «Далее », чтобы перейти к следующему экрану.
- Убедитесь, что введены правильные параметры.
- Нажмите кнопку «Пуск », чтобы сформулировать мРНК-ЛЯП.
4. Пострецептурная обработка и характеризация мРНК-ЛЯП
- Загрузите мРНК-ЛЯП, собранные в правую коническую пробирку, в предварительно гидратированные диализные кассеты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прокалывайте и не повреждайте мембрану кассеты при загрузке мРНК-ЛЯП. Если мембрана повреждена, мРНК-ЛЯП будут потеряны при нагрузке.- Поместите диализные кассеты, содержащие мРНК-LNP, обратно в стакан, содержащий 1x PBS, и оставьте их для диализа минимум на 2 часа.
- После диализа диализные кассеты, содержащие мРНК-ЛЯП, поместить в стерильный шкаф биобезопасности и удалить мРНК-ЛЯП с помощью шприца с иглой.
- Стерильно отфильтруйте мРНК-ЛЯП с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм и соберите их в стерильную коническую пробирку.
- Поместите 65 мкл раствора мРНК-ЛЯП в микропробирку объемом 1,5 мл для характеризации.
- Развести 10 мкл мРНК-ЛЯП 1:100 в 990 мкл 1x PBS в кювете для измерения гидродинамического размера и показателя полидисперсности с использованием динамического рассеяния света.
- Оцените концентрацию и эффективность инкапсуляции мРНК-ЛЯП с помощью флуоресцентного анализа (например, RiboGreen).
- Приготовьте исходный раствор 1x TE буфера, разбавив 20x TE буфер молекулярно-биологической водой.
- Приготовьте исходный раствор 1% буфера Triton X-100, разбавив Triton X-100 буфером 1x TE.
- Приготовьте флуоресцентный реагент, разбавив запас реагента 1:200 буфером 1x TE.
- Разбавляют мРНК-LNP в соотношении 1:100 в 1x TE буфере и 1% буфере Triton X-100 в 96-луночном планшете с черными стенками и черным дном в 100 мкл.
- Подготовьте стандартную кривую низкого диапазона, разбавив стандарт РНК в соответствии с инструкциями производителя, и поместите стандартную кривую в 96-луночный планшет.
- Добавьте 100 мкл разбавленного флуоресцентного реагента в каждую лунку, содержащую разбавленную мРНК-LNP или разбавленный стандарт.
- Поместите 96-луночный планшет в устройство для чтения пластин и встряхивайте в течение 1 минуты, а затем подождите 4 минуты.
- Измерьте интенсивность флуоресценции каждой лунки в соответствии с протоколом производителя при возбуждении/излучении 480 нм/520 нм.
- Используйте стандартную кривую для преобразования значений флуоресценции в концентрации.
- Рассчитайте эффективность инкапсуляции путем вычитания значения, полученного при разбавлении LNP в TE-буфере (неинкапсулированная мРНК), из значения, полученного при разбавлении LNP в 1% Triton X-100 (общая мРНК) и деления на значение, полученное при разбавлении LNP в 1% Triton X-100, согласно уравнению 4.4.
- Рассчитайте концентрацию мРНК-LNP, используемую для исследований на клетках и животных, путем вычитания значения, полученного при разбавлении LNP в TE-буфере (неинкапсулированная мРНК), из значения, полученного при разбавлении LNP в 1% Triton X-100 (общее количество мРНК).
- Измерьте pKa мРНК-LNP, выполнив анализ 6-(p-толуидино)-2-нафталинсульфонилхлорида (TNS).
- Приготовьте реагент TNS, создав 0,16 мМ раствор TNS в сверхчистой воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании реагента обязательно держите его на льду и вдали от света, чтобы избежать разложения. - Готовят буферные растворы 150 мМ хлорида натрия, 20 мМ фосфата натрия, 25 мМ цитрата аммония и 20 мМ ацетата аммония, адаптированные к различным значениям рН в диапазоне от 2 до 12 с шагом 0,5.
- Добавьте 2,5 мкл LNP в каждый буферный раствор с регулируемым pH в 96-луночном планшете с черными стенками и черным дном.
- Добавьте реагент TNS в каждую лунку так, чтобы конечная концентрация TNS составляла 6 мкМ.
- Инкубируйте 96-луночную пластину в темном месте в течение 5 минут.
- Измерьте флуоресценцию при возбуждении/излучении 322 нм/431 нм с помощью флуоресцентного планшетного ридера.
- Подгоните данные к сигмоидальной кривой и вычислитеpKa с помощью подогнанного уравнения, чтобы найти pH, при котором наблюдалось 50% максимальной интенсивности.
- Приготовьте реагент TNS, создав 0,16 мМ раствор TNS в сверхчистой воде.
- Репрезентативные результаты для гидродинамического размера мРНК-ЛЯП, PDI, эффективности инкапсуляции и pKa приведены в таблице 3.
5. Трансфекция клеток HepG2 in vitro
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные другие клеточные линии, такие как клетки HeLa или клетки HEK-293T, могут быть использованы для оценки эффективности трансфекции LNP in vitro. Все клетки должны получить отрицательный результат на микоплазму перед исследованиями трансфекции LNP.
- Планшет по 5 000 клеток HepG2 в каждой лунке 96-луночного планшета с белым дном и прозрачным дном в 100 мкл полной питательной среды клеток (DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина)
- Оставьте клетки на ночь в контролируемом инкубаторе СО2 при температуре 37 °C и 5%СО2.
- Разбавляют мРНК-ЛНЧ в полной питательной среде клеток так, чтобы общая доза составляла 100 мкл.
- Удалите всю среду из лунок.
- Обрабатывают клетки либо мРНК-ЛНЧ, разведенными в полной питательной среде клеток в желаемых дозах, либо полной средой (контроль).
- Поместите 96-луночную пластину, содержащую обработанные клетки, обратно в контролируемый инкубаторCO2 на 24 часа.
- Оцените эффективность трансфекции, выполнив люциферазный анализ.
- Приготовьте реагент люциферазы и 1x буфер для лизиса клеток в соответствии с инструкциями производителя.
- Выньте из инкубатора 96-луночную пластину, содержащую клетки, и отнесите ее в шкаф биобезопасности.
- Удалите питательную среду из каждой лунки 96-луночного планшета.
- Добавьте 20 мкл 1x лизисного буфера в каждую лунку, а затем 100 мкл ранее приготовленного реагента для анализа люциферазы.
- Защитите планшет от света и поместите планшет в считыватель пластин для измерения биолюминесцентного сигнала каждой лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты, демонстрирующие лечение клеток HepG2 ранее разработанными мРНК-ЛНП C12-200, показаны на рисунке 1.
6. Оценка in vivo мРНК-ЛЯП у мышей после инъекции в хвостовую вену
- Разбавляют раствор мРНК-ЛНП стерильным 1x PBS таким образом, чтобы в объеме 100 мкл для инъекции в хвостовую вену присутствовало 2 мкг общей мРНК, что соответствует дозе массы тела примерно 0,1 мг/кг для мыши весом 20 г.
- Удерживайте каждую мышь утвержденным методом, а хвост протирайте подушечкой, смоченной 70% спиртом.
- Наполните инсулиновый шприц 29 г либо 100 мкл мРНК-ЛНП (2 мкг), либо 100 мкл 1x PBS. Удалите пузырьки из шприца.
- Введите иглу скосом вверх в боковую хвостовую вену мыши и медленно введите 100 мкл мРНК-LNP или 1x PBS.
- Извлеките иглу и надавливайте до достижения гемостаза.
- Приготовьте исходный раствор 15 мг/мл д-люцифериновой калиевой соли в стерильном 1x PBS через 6 часов после инъекции.
- Включите систему визуализации in vivo (IVIS) и откройте программное обеспечение для обработки изображений.
- Нажмите кнопку Инициализировать, чтобы подготовить прибор к сбору данных.
- Установите флажок рядом с люминесценцией и установите время экспозиции на авто. Убедитесь, что выбрано правильное поле зрения для количества мышей, которые получают изображение.
- Вводят 200 мкл d-люциферина внутрибрюшинно (150 мг люциферина на кг массы тела) мышам, ранее получавшим лечение.
- Поместите мышей в наркозную камеру с содержанием изофлурана 2,5% и расходом кислорода 2,0 л/мин.
- Подождите 10 минут, пока сигнал люциферазы стабилизируется, прежде чем визуализировать мышей, обработанных мРНК-LNP.
- Убедитесь, что мыши полностью обезболены, и перенаправьте анестезиологическую линию для введения изофлурана через носовые конусы внутри камеры визуализации.
- Перенесите мышей на носовые конусы и убедитесь, что они лежат на спине с открытым животом.
- Закройте дверцу камеры и нажмите кнопку «Получить » в программном обеспечении, чтобы получить изображения биолюминесценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты визуализации всего тела мышей после лечения мРНК-LNP или 1X PBS показаны на рисунке 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
мРНК-ЛЯП были созданы с помощью микрофлюидного прибора, обладающего средним гидродинамическим диаметром 76,16 нм и индексом полидисперсности 0,098. При проведении анализа TNS18 было установлено, что p K a мРНК-LNP составляет 5,75. Эффективность инкапсуляции этих мРНК-ЛЯП была рассчитана на уровне 92,3% с использованием модифицированного флуоресцентного анализа и уравнения 4.4. Общая концентрация РНК, которая использовалась для лечения клеток и дозирования животных, составила 40,24 нг/мкл. Это значение было получено из модифицированного флуоресцентного анализа 19, в частности, путем преобразования флуоресценции, полученной путем разбавления ЛЯП 1% буфером Triton X-100 и1x TE в определенные концентрации и расчета количества инкапсулированной мРНК.
Уравнение 4.4
CTX = Концентрация мРНК из LNP, разбавленная в 1% Triton X-100
C TE = концентрация мРНК из LNP, разбавленных в 1x TE буфере
Увеличение биолюминесценции наблюдалось при увеличении дозы при обработке 5000 клеток HepG2 на лунку различными дозами мРНК-ЛЯП. Экспрессия люциферазы была легко обнаружена при самой низкой дозе (5 нг/лунку), использованной в этом исследовании. Тем не менее, другим клеточным линиям может потребоваться разное количество мРНК-ЛЯП, чтобы легко увидеть различия в люминесценции в разных дозах.
Мышей обрабатывали 2 мкг мРНК-ЛНП и через 6 ч оценивали биолюминесценцию всего тела. Поскольку C12-200 мРНК-LNP преимущественно трансфицируют печень20, сильный биолюминесцентный сигнал наблюдался в верхней части брюшной полости мышей, получавших разработанные нами LNP. С помощью программного обеспечения для визуализации вокруг печеночных сигналов были нарисованы интересующие области, чтобы рассчитать общий люминесцентный поток. В этом эксперименте суммарный люминесцентный поток составил приблизительно 5 x 109, что согласуется с другими исследованиями, проведенными с этой формулировкой LNP 4,21.
Таблица 1: Органический фазовый состав. Описаны концентрации отдельных исходных растворов липидов и объемы, которые каждый компонент вносит в органическую фазу объемом 1,3 мл. Липиды объединяются при молярном соотношении 35/16/46,5/2,5 (C12-200:DOPE:Холестерин:C14-PEG2000). Был подготовлен дополнительный объем на 10% для учета мертвых объемов шприца во время составления рецептуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Настройки микрофлюидных приборов для рецептуры мРНК-ЛЯП при соотношении водного и органического потока 3:1. Шприц объемом 5 мл, содержащий мРНК, разведенную в 10 мМ буфере лимонной кислоты, вводили в центральный канал, а шприц объемом 3 мл, содержащий липиды, вводили в правый канал. LNP были разработаны в весовом соотношении ионизируемый липид:мРНК 10:1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 3: Данные характеризации мРНК-ЛЯП, определенные методом динамического рассеяния света, модифицированного флуоресцентного анализа и анализа 2-(-толуидино) нафталин-6-сульфоновой кислоты (TNS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Рисунок 1: Клетки HepG2, обработанные мРНК-ЛЯП люциферазы светлячков. В целом, 5000 клеток HepG2 были высеяны на лунку в 96-луночную пластину и приклеивались в течение ночи. Клетки культивировали в ДМЕМ с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина. Питательную среду для клеток удаляли до обработки клеток дозами 5, 10 нг и 20 нг препарата LNP, содержащего C12-200, инкапсулирующего мРНК, кодирующую люциферазу светлячка (в 100 мкл питательной среды клеток). Через 24 ч после обработки клеточную культуральную среду удаляли и добавляли 20 мкл 1-лизисного буфера на клетки перед добавлением 100 мкл реагента для анализа люциферазы. Биолюминесценцию из каждой лунки измеряли с помощью планшетного ридера после 5-минутного инкубационного периода. Увеличение складок построено относительно контрольных скважин, которые состояли из необработанных клеток HepG2. Статистическую значимость оценивали с помощью одностороннего ANOVA с post-hoc критерием Тьюки. нс, не значимый; , стр < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Мыши C57BL/6, обработанные мРНК-LNP люциферазы светлячков. В этой работе мышам C57BL/6 через боковую хвостовую вену вводили 2 мкг общей мРНК-ЛНП в 100 мкл или 100 мкл 1x PBS. (A) Биолюминесценцию всего тела мышей, получавших мРНК-ЛЯП или 1X PBS, измеряли с помощью системы визуализации in vivo (IVIS) через 6 ч после введения. Для анализа и получения изображений всего тела использовалось программное обеспечение IVIS Spectrum Living Image. N = 3. (B) Общий люминесцентный поток был количественно определен и построен на графике. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента. **, стр < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С помощью этого рабочего процесса можно сформулировать и протестировать различные мРНК-ЛЯП на предмет их эффективности in vitro и in vivo. Ионизируемые липиды и вспомогательные вещества могут быть заменены и комбинированы при различных молярных соотношениях и различном массовом соотношении ионизируемых липидов и мРНК для получения мРНК-LNP с различными физико-химическими свойствами22. Здесь мы разработали мРНК-LNP C12-200 с молярным отношением 35/16/46,5/2,5 (ионизируемый липид:липид-хелпер:холестерин:липид-ПЭГ) при массовом соотношении ионизируемых липидов и мРНК 10:1. Эти LNP были протестированы на эффективность трансфекции in vitro в клетках HepG2 и in vivo на мышах C57BL/6. МРНК-LNP C12-200 были синтезированы путем микрофлюидного смешивания с использованием коммерчески доступного микрофлюидного прибора. Несмотря на то, что для составления ЛНЧ можно использовать и другие методы составления рецептуры, такие как пипетное смешивание или смешиваниес Т-переходом 4, микрофлюидное смешивание позволяет получить мРНК-ЛНЧ, которые, как правило, меньшего размера, менее полидисперсны и обладают более высокой эффективностью инкапсуляции 4,13,23,24.
Составление мРНК-ЛНЧ с помощью коммерчески доступного микрофлюидного прибора позволяет создавать простые и гибкие ЛНЧ. Расход в начале цикла изменяется от заданного заданного расхода, когда толкатели шприцев разгоняются до полной скорости. Это может привести к изменению характеристик частиц и противоречивым результатам. Чтобы решить эту проблему, микрофлюидный прибор был разработан для сбора LNP, сформированных в начале и в конце рецептуры, в виде отходов отдельно от LNP, созданных в стационарных условиях. Это может уменьшить полидисперсность и привести к более стабильным свойствам частиц. Исходные отходы могут быть рассчитаны на основе комбинации шприцев, используемых для рецептуры, в соответствии с инструкцией производителя. Тем не менее, конечные отходы не испытывают одинаковой степени нестационарного потока, поэтому объем часто устанавливается равным 0,05 мл для всех комбинаций шприцев в соответствии с рекомендациями производителя.
Очень важно учитывать мертвый объем в шприцах и пробирках при приготовлении правильных объемов органической и водной фаз. Приготовление 10% дополнительного объема каждой фазы гарантирует, что может быть сформулирован минимальный требуемый объем LNP. В этот протокол был введен общий объем препарата 4,7 мл с 0,7 мл отходов, в результате чего было собрано 4 мл LNP в установившихся условиях. Однако для составления препарата было приготовлено 1,3 мл органической фазы и 3,9 мл водной фазы. Это гарантирует, что шприц объемом 5 мл может быть заполнен до отметки 3,6 мл, а шприц объемом 3 мл может быть заполнен до отметки 1,2 мл. Если объем достигает отметок на шприцах, то характеристики объема, используемые на микрофлюидном приборе, являются безопасными входными данными. Финальный экран перед нажатием кнопки «СТАРТ» имеет решающее значение для проверки правильности всех параметров. Важно провести окончательную проверку типов шприцев, объемов в шприцах, объемов, подлежащих выдаче, размещения шприца и скорости потока.
После разработки мРНК-ЛНЧ на этапе диализа следует помнить о нескольких важных моментах. Используемые диализные кассеты требуют минимального времени гидратации 2 минуты перед загрузкой LNP. Это повышает гибкость мембраны и позволяет мембране легче приспосабливаться по мере добавления образца. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить и не проколоть мембраны диализных кассет при загрузке их мРНК-ЛНЧ. Если мембраны проколоты или повреждены, разработанные мРНК-ЛЯП могут быть легко потеряны при нагрузке.
В этом протоколе мы проверили эффективность мРНК-ЛНЧ in vitro в клетках HepG2. Тем не менее, другие типы клеток могут быть протестированы на эффективность трансфекции мРНК-ЛЯП. Если используются неадгезивные клетки, 96-луночный планшет требует центрифугирования при 500 г в течение 5 мин перед любым удалением клеточной питательной среды25. Это сводит к минимуму потерю клеток во время удаления среды. Клетки также должны быть проверены на наличие микоплазмы перед проведением любых исследований по трансфекции ЛНЧ. Будет трудно получить последовательные результаты и сравнить различные составы LNP, если клетки дадут положительный результат на микоплазму. Кроме того, первичным клеткам могут потребоваться более высокие дозы LNP для измерения трансфекции без токсичности по сравнению с клеточными линиями. Анализ жизнеспособности на основе люциферазы может быть использован для оценки токсичности мРНК-ЛЯП in vitro в различных дозах как в первичных клетках, так и в клеточных линиях18.
Одним из наиболее важных шагов в получении последовательных измерений биолюминесценции у разных мышей после лечения одной и той же формулой мРНК-LNP является обеспечение того, чтобы время между внутрибрюшинной инъекцией d-люциферина и измерением IVIS было постоянным26. Этот интервал времени влияет на стабильность получаемого биолюминесцентного сигнала. Временной интервал должен быть достаточно длинным, чтобы любые колебания сигнала были сведены к минимуму. Можно провести предварительный эксперимент, в котором мышей будут визуализировать каждую минуту после инъекции d-люциферина. Интервал времени, когда сигнал начинает выходить на плато, является наиболее подходящим для эксперимента по трансфекции. В этом протоколе 10-минутный интервал позволял получать стабильные сигналы люминесценции после инъекции 150 мг d-люциферина/кг массы тела, которая обычно выполняется для визуализации27,28.
Кроме того, доза мРНК-ЛЯП, используемая в этом протоколе (0,1 мг мРНК/кг массы тела), мала по сравнению с дозами, используемыми для оценки токсичности и терапевтической эффективности29,30. Эти меньшие дозы помогают оценить различия в потенциях уникальных составов мРНК-ЛЯП, не перенасыщая при этом полученный люминесцентный сигнал. Однако эта доза может быть увеличена для измерения потенциальной токсичности мРНК-ЛЯП. Например, токсичность для печени может быть оценена путем количественного определения уровней аланинтрансаминазы, аспартаттрансаминазы и щелочной фосфатазы в сыворотке крови в разные моменты времени после инъекции мРНК-ЛЯП31,32,33. Эти ферменты обычно содержатся в сыворотке крови на низком уровне, но их количество увеличивается в результате повреждения печени. Коммерчески доступные наборы могут быть использованы для количественного определения количества этих ферментов в сыворотке.
В этом примере мы использовали мРНК, кодирующую люциферазу светлячков, но другие репортерные мРНК могут быть сформулированы в LNP для оценки эффективности. мРНК, кодирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP) или mCherry, могут быть использованы для исследования клеточно-специфической доставки после лечения мРНК-LNP34,35. Одноклеточная суспензия может быть получена из тканей, представляющих интерес, а клетки GFP+ или mCherry+ могут быть оценены с помощью анализа методом проточной цитометрии. Кроме того, мРНК-ЛНЧ могут быть составлены с мРНК, кодирующей эритропоэтин, для измерения трансфекции печени через секрецию эритропоэтина в сыворотке 8,36,37. У мышей Ai9 доставка мРНК, кодирующей Cre-рекомбиназу, индуцирует устойчивую флуоресценцию tdTomato, что может служить еще одним методом для исследования доставки мРНК-ЛЯП в различные клеточные популяции38,39,40. Мы надеемся, что благодаря демонстрации этого рабочего процесса формула мРНК-LNP перестанет быть препятствием для исследователей по мере того, как они будут изучать новые идеи и возможности для терапии мРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов, о котором можно было бы заявлять, отсутствует.
Acknowledgments
M.J.M. выражает признательность за поддержку со стороны премии директора Национального института здравоохранения США (NIH) «Новый новатор» (DP2 TR002776), премии Burroughs Wellcome Fund Career Award в Scientific Interface (CASI), премии CAREER Национального научного фонда США (CBET-2145491) и дополнительного финансирования от Национальных институтов здравоохранения (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 и NIDDK R01 DK123049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
