Summary
Her presenteres en protokoll for formulering av lipid nanopartikler (LNP) som innkapsler mRNA som koder for firefly luciferase. Disse LNP-ene ble testet for deres styrke in vitro i HepG2-celler og in vivo i C57BL/6-mus.
Abstract
Lipid nanopartikler (LNP) har tiltrukket seg stor oppmerksomhet nylig med den vellykkede utviklingen av COVID-19 mRNA-vaksinene av Moderna og Pfizer / BioNTech. Disse vaksinene har demonstrert effekten av mRNA-LNP-terapeutika og åpnet døren for fremtidige kliniske applikasjoner. I mRNA-LNP-systemer fungerer LNP-ene som leveringsplattformer som beskytter mRNA-lasten mot nedbrytning av nukleaser og medierer deres intracellulære levering. LNPene består vanligvis av fire komponenter: et ioniserbart lipid, et fosfolipid, kolesterol og et lipidforankret polyetylenglykol (PEG) konjugat (lipid-PEG). Her formuleres LNP-er som innkapsler mRNA-kodende for firefly luciferase ved mikrofluidisk blanding av den organiske fasen som inneholder LNP-lipidkomponenter og den vandige fasen som inneholder mRNA. Disse mRNA-LNP-ene testes deretter in vitro for å evaluere deres transfeksjonseffektivitet i HepG2-celler ved hjelp av en bioluminescerende platebasert analyse. I tillegg evalueres mRNA-LNP in vivo hos C57BL/6-mus etter en intravenøs injeksjon via den laterale halevenen. Helkroppsbioluminescensavbildning utføres ved bruk av et in vivo bildesystem. Representative resultater er vist for mRNA-LNP-egenskapene, deres transfeksjonseffektivitet i HepG2-celler og den totale luminescerende fluksen i C57BL/6-mus.
Introduction
Lipid nanopartikler (LNP) har vist stort løfte de siste årene innen ikke-viral genterapi. I 2018 godkjente USAs Food and Drug Administration (FDA) den aller første RNA-interferens (RNAi) terapeutisk, Onpattro by Alnylam, for behandling av arvelig transtyretinamyloidose 1,2,3,4. Dette var et viktig skritt fremover for lipid nanopartikler og RNA-baserte terapier. Nylig mottok Moderna og Pfizer/BioNTech FDA-godkjenninger for sine mRNA-LNP-vaksiner mot SARS-CoV-2 4,5. I hver av disse LNP-baserte nukleinsyreterapiene tjener LNP til å beskytte lasten mot nedbrytning av nukleaser og legge til rette for potent intracellulær levering 6,7. Mens LNP har sett suksess i RNAi-terapier og vaksineapplikasjoner, har mRNA-LNP også blitt utforsket for bruk i proteinutskiftningsterapier8, samt for samlevering av Cas9 mRNA og veiledende RNA for levering av CRISPR-Cas9-systemet for genredigering9. Det finnes imidlertid ingen spesifikk formulering som er velegnet for alle anvendelser, og subtile endringer i LNP-formuleringsparametrene kan i stor grad påvirke potens og biodistribusjon in vivo 8,10,11. Dermed må individuelle mRNA-LNP utvikles og evalueres for å bestemme den optimale formuleringen for hver LNP-basert terapi.
LNP er vanligvis formulert med fire lipidkomponenter: et ioniserbart lipid, et fosfolipid, kolesterol og et lipidforankret polyetylenglykol (PEG) konjugat (lipid-PEG)11,12,13. Den potente intracellulære leveransen tilrettelagt av LNP er delvis avhengig av den ioniserbare lipidkomponenten12. Denne komponenten er nøytral ved fysiologisk pH, men blir positivt ladet i det sure miljøet til endosomet11. Denne endringen i ionisk ladning antas å være en viktig bidragsyter til endosomal flukt12,14,15. I tillegg til det ioniserbare lipidet forbedrer fosfolipidkomponenten (hjelperlipid) innkapslingen av lasten og hjelpemidler i endosomal flukt, kolesterolet gir stabilitet og forbedrer membranfusjon, og lipid-PEG minimerer LNP-aggregering og opsonisering i omløp10,11,14,16. For å formulere LNP kombineres disse lipidkomponentene i en organisk fase, typisk etanol, og blandes med en vandig fase som inneholder nukleinsyrelasten. LNP-formuleringsprosessen er svært allsidig ved at den gjør det mulig for forskjellige komponenter å enkelt substitueres og kombineres ved forskjellige molforhold for å formulere mange LNP-formuleringer med en rekke fysisk-kjemiske egenskaper10,17. Men når du utforsker dette store utvalget av LNP-er, er det avgjørende at hver formulering evalueres ved hjelp av en standardisert prosedyre for nøyaktig å måle forskjellene i karakterisering og ytelse.
Her er den komplette arbeidsflyten for formulering av mRNA-LNP og vurdering av deres ytelse i celler og dyr skissert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Oppretthold alltid RNase-frie forhold når du formulerer mRNA-LNP ved å tørke overflatene og utstyret med en overflatedekontaminant for RNaser og DNA. Bruk bare RNase-frie tips og reagenser.
Alle dyreprosedyrene ble utført i samsvar med retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr ved University of Pennsylvania og en protokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pennsylvania.
1. Forberedelse før formulering
- Fyll et rent 4 l beger med 200-300 ml fersk 10x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Fortynn 10x PBS i begeret 10 ganger med ultrarent vann for å oppnå et beger på 1x PBS. Forsikre deg om at det endelige volumet av 1x PBS er mellom 2-3 L.
- Plasser dialysekassetter (20 kDa molekylvektgrense [MWCO]) med passende kapasitet for LNP-formuleringen i det fylte begeret for å hydrere dem.
MERK: Dialysekassetter krever minst 2 minutter for å hydrere før bruk. - Legg en rørestang i begeret, og dekk begeret med aluminiumsfolie.
- Plasser det dekkede begeret på en magnetisk røreplate. Slå på røreplaten, og sett den til å spinne ved 300-400 o / min.
- Fortynn en 100 mM sitronsyrebufferstokk (pH 3) 10 ganger med ultrarent vann for å lage 10 mM sitronsyrebufferen som brukes til mRNA-fortynning.
- Lag C12-200 ioniserbare lipid-, hjelperlipid-, kolesterol- og lipidforankrede PEG (lipid-PEG) stamløsninger ved å oppløse hvert lipid i 100% etanol. Konsentrasjonene av lipidkomponentene er beskrevet i tabell 1.
- Varm opp og bland stamoppløsningene ved 37 °C for å sikre at de er fullstendig oppløst.
2. Fremstilling av lipid- og nukleinsyreblandingene
- Beregn de nødvendige volumene av ioniserbar lipid, hjelperlipid, kolesterol og lipid-PEG basert på ønsket molforhold og ioniserbart lipid til mRNA-vektforhold (tabell 1). Klargjør 10 % ekstra volum av den organiske fasen for å ta hensyn til dødt volum i sprøytene under formuleringen.
- Kombiner de beregnede volumene av de forskjellige lipidkomponentene i et konisk rør.
- Fortynn lipidene med 100% etanol til et endelig volum, V, som representerer 25% av det endelige volumet av LNP.
- Beregn mengden mRNA som kreves for formulering basert på det ioniserbare lipid til mRNA-vektforholdet og det totale volumet av mRNA-LNP som trengs (tabell 1).
- Tine ildfluen luciferase-kodende mRNA på is.
- Fortynn mRNA til et endelig volum, 3V, tre ganger volumet av den organiske fasen, i 10 mM sitronsyrebuffer.
MERK: Hvert lipidvolum, V, må inneholde nok ioniserbart lipid til mRNA fortynnet i 3V. Dette tilsvarer det ønskede ioniserbare lipid til mRNA-vektforholdet.
3. Mikrofluidisk formulering av mRNA-LNP
- Spray en delikat arbeidsserviett med en overflatedekontaminant for RNaser og DNA, og tørk grundig av det mikrofluidiske instrumentet.
- Åpne en ny mikrofluidisk patron, og sett den inn med innløpskanalene vendt ned og bort.
- Sørg for at den koniske rørarmen rommer to koniske rør på 15 ml og er lengst til høyre.
- Konfigurer to sterile 15 ml koniske rør på holderen med lokkene av.
- Fyll en 5 ml sprøyte med mRNA-oppløsningen som inneholder mRNA fortynnet i 10 mM sitronsyrebuffer.
- Fyll en 3 ml sprøyte med lipidoppløsningen som inneholder lipidene fortynnet i ren 100% etanol.
- Vipp opp sylinderampulleholderen på den mikrofluidiske enheten.
- Sett sprøyten på 5 ml uten kanylen som inneholder mRNA, inn i venstre innløp på sylinderampullen.
- Stikk inn sprøyten på 3 ml uten kanylen som inneholder lipider, inn i det høyre innløpet på sylinderampullen.
- Vri sylinderampulleholderen ned igjen, og lukk lokket på det mikrofluidiske instrumentet.
- Slå på det mikrofluidiske instrumentet ved å bruke bryteren på baksiden av instrumentet.
- Velg Quick Run.
- Velg riktige sprøytetyper for sprøytene på 5 ml og 3 ml som er satt inn.
- Legg inn parametrene for mRNA-LNP-formulering ved et vandig til organisk strømningshastighetsforhold på 3: 1 som beskrevet i tabell 2.
- Trykk på Neste-knappen for å gå til neste skjermbilde.
- Bekreft at de riktige parameterne er lagt inn.
- Trykk på Start-knappen for å formulere mRNA-LNP-ene.
4. Post-formulering prosessering og karakterisering av mRNA-LNPene
- Legg mRNA-LNP-ene samlet i det høyre koniske røret inn i de tidligere hydrerte dialysekassettene.
MERK: Ikke punkter eller skad membranen på kassetten når du legger i mRNA-LNP-ene. Hvis membranen er skadet, vil mRNA-LNP gå tapt ved lasting.- Plasser dialysekassettene som inneholder mRNA-LNP-ene tilbake i begeret som inneholder 1x PBS, og la dem dialysere i minst 2 timer.
- Etter dialyse, ta dialysekassettene som inneholder mRNA-LNPs inn i et sterilt biosikkerhetsskap, og fjern mRNA-LNPs ved hjelp av en sprøyte med en nål.
- Sterilfiltrer mRNA-LNPene ved hjelp av et 0,22 μm sprøytefilter, og samle dem i et sterilt konisk rør.
- Plasser 65 μL av mRNA-LNP-løsningen i et 1,5 ml mikrorør for karakteriseringsformål.
- Fortynn 10 μL mRNA-LNP 1:100 i 990 μL 1x PBS i en kyvette for måling av hydrodynamisk størrelse og polydispersitetsindeks ved bruk av dynamisk lysspredning.
- Vurder konsentrasjonen og innkapslingseffektiviteten til mRNA-LNPene ved hjelp av en fluorescensanalyse (dvs. RiboGreen).
- Forbered en stamløsning med 1x TE-buffer ved å fortynne 20x TE-buffer med molekylærbiologisk vann.
- Forbered en stamløsning på 1% Triton X-100 buffer ved å fortynne Triton X-100 med 1x TE buffer.
- Forbered det fluorescerende reagenset ved å fortynne reagenslageret 1:200 med 1x TE-buffer.
- Fortynn mRNA-LNPene 1:100 i 1x TE-buffer og 1 % Triton X-100-buffer i en svartvegget 96-brønnsplate med svart bunn i 100 μL.
- Forbered en lavområdestandardkurve ved å fortynne RNA-standarden i henhold til produsentens instruksjoner, og plate standardkurven i 96-brønnplaten.
- Tilsett 100 μL fortynnet fluorescerende reagens til hver brønn som inneholder fortynnet mRNA-LNP eller fortynnet standard.
- Plasser tallerkenen med 96 brønner inne i en plateleser, og rist i 1 min, etterfulgt av en ventetid på 4 minutter.
- Mål fluorescensintensiteten til hver brønn i henhold til produsentens protokoll ved en eksitasjon / utslipp på 480 nm / 520 nm.
- Bruk standardkurven til å konvertere fluorescensverdiene til konsentrasjoner.
- Beregn innkapslingseffektiviteten ved å trekke verdien oppnådd fra fortynning av LNP i TE-buffer (uinnkapslet mRNA) fra verdien oppnådd ved fortynning av LNP i 1% Triton X-100 (totalt mRNA) og dividere med verdien oppnådd ved fortynning av LNP i 1% Triton X-100, i henhold til ligning 4.4.
- Beregn mRNA-LNP-konsentrasjonen som brukes til celle- og dyreforsøk ved å trekke verdien oppnådd fra fortynning av LNP i TE-buffer (uinnkapslet mRNA) fra verdien oppnådd ved fortynning av LNP i 1% Triton X-100 (totalt mRNA).
- Mål pKa av mRNA-LNPene ved å utføre en 6-(p-toluidino)-2-naftalensulfonylklorid (TNS) analyse.
- Forbered TNS-reagenset ved å lage en 0,16 mM løsning av TNS i ultrarent vann.
MERK: Når du bruker reagenset, må du huske å holde det på is og borte fra lys for å unngå nedbrytning. - Forbered bufrede løsninger av 150 mM natriumklorid, 20 mM natriumfosfat, 25 mM ammoniumcitrat og 20 mM ammoniumacetat justert til forskjellige pH-verdier fra 2 til 12 i trinn på 0,5.
- Tilsett 2,5 μL av LNP til hver pH-justert bufferløsning i en svartvegget 96-brønnsplate med svart bunn.
- Tilsett TNS-reagens til hver brønn slik at den endelige TNS-konsentrasjonen er 6 μM.
- Inkuber platen med 96 brønner på et mørkt sted i 5 minutter.
- Mål fluorescensen ved en eksitasjon / utslipp på 322 nm / 431 nm ved hjelp av en fluorescensplateleser.
- Tilpass dataene til en sigmoidal kurve, og beregne pKa ved å bruke den tilpassede ligningen for å finne pH der 50% av maksimal intensitet ble observert.
- Forbered TNS-reagenset ved å lage en 0,16 mM løsning av TNS i ultrarent vann.
- Representative resultater for mRNA-LNP hydrodynamisk størrelse, PDI, innkapslingseffektivitet og pKa er vist i tabell 3.
5. In vitro transfeksjon av HepG2-celler
MERK: Ulike andre cellelinjer, som HeLa-celler eller HEK-293T-celler, kan brukes til å vurdere transfeksjonseffektiviteten til LNP in vitro. Alle celler bør teste negativt for mykoplasma før LNP-transfeksjonsstudiene.
- Plate 5000 HepG2-celler i hver brønn av en hvitveggs klar bunn 96-brønnplate i 100 μL komplett cellekulturmedium (DMEM supplert med 10% føtal bovint serum og 1% penicillin-streptomycin)
- La cellene feste seg over natten i en kontrollert CO 2 -inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fortynn mRNA-LNPene i komplett cellekulturmedium slik at totaldosen leveres i 100 μL.
- Fjern hele mediet fra brønnene.
- Behandle cellene med enten mRNA-LNP fortynnet i komplett cellekulturmedium ved ønskede doser eller komplett medium (kontroll).
- Plasser 96-brønnplaten som inneholder de behandlede cellene tilbake i den kontrollerte CO2 -inkubatoren i 24 timer.
- Vurder transfeksjonseffektiviteten ved å utføre en luciferase-analyse.
- Klargjør luciferase-reagenset og 1x cellelysebuffer i henhold til produsentens instruksjoner.
- Ta ut 96-brønnplaten som inneholder cellene fra inkubatoren, og ta den inn i et biosikkerhetsskap.
- Fjern cellekulturmediet fra hver brønn på 96-brønnplaten.
- Tilsett 20 μL 1x lysisbuffer til hver brønn, etterfulgt av 100 μL av det tidligere preparerte luciferaseanalysereagenset.
- Beskytt platen mot lys, og plasser platen i en plateleser for å måle det bioluminescerende signalet til hver brønn.
MERK: Representative resultater som viser behandling av HepG2-celler med tidligere formulerte C12-200 mRNA-LNP er vist i figur 1.
6. In vivo evaluering av mRNA-LNP hos mus etter injeksjon i halevene
- Fortynn mRNA-LNP-løsningen med steril 1x PBS slik at 2 μg totalt mRNA er tilstede i et 100 μL injeksjonsvolum i halevene, noe som tilsvarer en kroppsvektdose på ca. 0,1 mg/kg for en 20 g mus.
- Begrens hver mus ved hjelp av en godkjent metode, og tørk halen med en pute fuktet med 70% alkohol.
- Fyll en 29 G insulinsprøyte med enten 100 μL mRNA-LNP (2 μg) eller 100 μL 1x PBS. Fjern eventuelle bobler fra sprøyten.
- Sett nålen med skråkanten vendt opp i musens laterale halevene, og injiser sakte 100 μL mRNA-LNP eller 1x PBS.
- Fjern nålen og trykk til hemostase oppnås.
- Tilbered en stamoppløsning med 15 mg/ml d-luciferin kaliumsalt i steril 1x PBS 6 timer etter injeksjon.
- Slå på in vivo imaging system (IVIS), og åpne bildebehandlingsprogramvaren.
- Trykk på Initialiser for å klargjøre instrumentet for datainnsamling.
- Merk av i boksen ved siden av luminescens, og sett eksponeringstiden til auto. Kontroller at riktig synsfelt er valgt for antall mus som avbildes.
- Administrer 200 mikrol d-luciferin intraperitonealt (150 mg luciferin per kg kroppsvekt) til tidligere behandlede mus.
- Plasser musene i et anestesikammer satt til 2,5% isofluran og en oksygenstrømningshastighet på 2,0 l / min.
- Vent 10 minutter til luciferase-signalet stabiliserer seg før du avbilder mRNA-LNP-behandlede mus.
- Sørg for at musene er fullt bedøvet, og omdiriger bedøvelseslinjen for å administrere isofluran via nesekegler inne i bildekammeret.
- Overfør musene til nesekeglene, og sørg for at de er på ryggen med magen utsatt.
- Lukk kammerdøren, og klikk på Hent-knappen i programvaren for å få bioluminescensbilder.
MERK: Representative resultater for helkroppsavbildning av mus etter mRNA-LNP eller 1X PBS-behandling er vist i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mRNA-LNP ble formulert ved hjelp av et mikrofluidisk instrument som hadde en gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter på 76,16 nm og en polydispersitetsindeks på 0,098. p Ka av mRNA-LNPene ble funnet å være 5,75 ved å utføre en TNS-analyse18. Innkapslingseffektiviteten for disse mRNA-LNPene ble beregnet til å være 92,3% ved å bruke den modifiserte fluorescensanalysen og ligningen 4,4. Den totale RNA-konsentrasjonen som ble brukt til cellebehandling og dyredosering var 40,24 ng / μL. Denne verdien ble oppnådd fra den modifiserte fluorescensanalysen 19, spesielt fra å konvertere fluorescensen oppnådd ved å fortynne LNP-ene med 1% Triton X-100 og1x TE-buffer til visse konsentrasjoner og beregne mengden innkapslet mRNA.
Ligning 4.4
CTX = Konsentrasjon av mRNA fra LNP fortynnet i 1% Triton X-100
C TE = Konsentrasjon av mRNA fra LNP fortynnet i 1x TE-buffer
Økende bioluminescens ble observert med økende doser ved behandling av 5000 HepG2-celler per brønn med forskjellige doser mRNA-LNP. Luciferase-uttrykk ble lett påvist ved laveste dose (5 ng/brønn) som ble brukt i denne studien. Imidlertid kan andre cellelinjer kreve forskjellige mengder mRNA-LNP for lett å se forskjeller i luminescens over doser.
Mus ble behandlet med 2 μg mRNA-LNP og vurdert 6 timer senere for helkroppsbioluminescens. Da C12-200 mRNA-LNP hovedsakelig transfekterer leveren20, ble det observert et sterkt bioluminescerende signal i overlivet til musene behandlet med våre formulerte LNP-er. Ved hjelp av bildebehandlingsprogramvaren ble interesseområder trukket rundt leversignalene for å beregne den totale luminescerende fluksen. I dette eksperimentet var den totale luminescerende fluksen ca. 5 x 109, noe som stemmer overens med andre studier utført med denne LNP-formuleringen 4,21.
Tabell 1: Organisk fasesammensetning. Konsentrasjoner av de enkelte lipidstamløsningene og volumene som hver komponent bidrar til den organiske fasen på 1,3 ml er beskrevet. Lipider kombineres i et molforhold på 35/16/46,5 / 2,5 (C12-200: DOPE: Kolesterol: C14-PEG2000). Et 10 % ekstra volum ble klargjort for å ta hensyn til sprøytedødt volum under formulering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Mikrofluidiske instrumentinnstillinger for mRNA-LNP-formulering ved et vandig til organisk strømningshastighetsforhold på 3:1. 5 ml sprøyten inneholdende mRNA fortynnet i 10 mM sitronsyrebuffer ble satt inn i senterkanalen, mens 3 ml sprøyten inneholdende lipider ble satt inn i høyre kanal. LNP ble formulert ved et 10: 1 vektforhold mellom ioniserbar lipid: mRNA. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: mRNA-LNP-karakteriseringsdata bestemt ved dynamisk lysspredning, en modifisert fluorescenceassay og en 2-(p-toluidino) naftalen-6-sulfonsyre (TNS) analyse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Figur 1: HepG2-celler behandlet med firefly luciferase mRNA-LNP. Totalt ble 5000 HepG2-celler sådd per brønn i en 96-brønnsplate og tillatt å feste seg over natten. Cellene ble dyrket i DMEM supplert med 10% føtal bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Cellekulturmediet ble fjernet før cellene ble behandlet med 5 ng, 10 ng og 20 ng doser av en C12-200-inneholdende LNP-formulering som innkapsler firefly luciferase-kodende mRNA (i 100 μL cellekulturmedium). Ved 24 timer etter behandling ble cellekulturmediet fjernet, og 20 μL 1x lysisbuffer ble tilsatt cellene før tilsetning av 100 μL luciferaseanalysereagens. Bioluminescensen fra hver brønn ble målt med en plateleser etter en inkubasjonsperiode på 5 minutter. Foldøkningene er plottet i forhold til kontrollbrønner som besto av ubehandlede HepG2-celler. Den statistiske signifikansen ble evaluert ved hjelp av en enveis ANOVA med post-hoc Tukeys test. ns, ikke signifikant; , p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: C57BL/6 mus behandlet med firefly luciferase mRNA-LNP. I dette arbeidet ble 2 μg total mRNA-LNP i 100 μL eller 100 μL 1x PBS administrert til C57BL/6-mus via lateral halevene. (A) Helkroppsbioluminescens av musene behandlet med enten mRNA-LNP eller 1X PBS ble målt ved bruk av in vivo imaging system (IVIS) 6 timer etter administrering. IVIS Spectrum Living Image-programvaren ble brukt til å analysere og skaffe bilder av hele kroppen. N = 3. (B) Den totale luminescerende fluksen ble kvantifisert og plottet. Den statistiske signifikansen ble evaluert ved hjelp av en tosidig Student t-test. **, p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med denne arbeidsflyten kan en rekke mRNA-LNP-er formuleres og testes for in vitro og in vivo-effektivitet. Ioniserbare lipider og hjelpestoffer kan byttes ut og kombineres ved forskjellige molare forhold og forskjellige ioniserbare lipid til mRNA-vektforhold for å produsere mRNA-LNP med forskjellige fysisk-kjemiske egenskaper22. Her formulerte vi C12-200 mRNA-LNP med et molforhold på 35/16/46.5/2.5 (ioniserbart lipid: hjelper lipid: kolesterol: lipid-PEG) ved et 10: 1 ioniserbart lipid til mRNA vektforhold. Disse LNP-ene ble testet for deres transfeksjonseffektivitet in vitro i HepG2-celler og in vivo i C57BL/6-mus. C12-200 mRNA-LNPene ble syntetisert ved mikrofluidisk blanding ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig mikrofluidisk instrument. Selv om andre formuleringsmetoder kan brukes til å formulere LNP, for eksempel pipetteblanding eller T-kryssblanding 4, formulerer mikrofluidisk blanding mRNA-LNP som generelt er mindre, mindre polydispergert og har høyere innkapslingseffektivitet 4,13,23,24.
Formuleringen av mRNA-LNP med det kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske instrumentet muliggjør enkel og fleksibel formulering av LNP. Strømningshastigheten i begynnelsen av en løpetur varierer fra målstrømningshastigheten som er angitt når sprøyteskyverne akselererer til full hastighet. Dette kan føre til variable partikkelegenskaper og inkonsistente resultater. For å overvinne dette ble det mikrofluidiske instrumentet designet for å samle LNP-ene formulert ved begynnelsen og slutten av en formulering som avfall separat fra LNP-ene formulert ved stabile forhold. Dette kan redusere polydispersjonen og føre til mer konsistente partikkelegenskaper. Startavfallet kan beregnes ut fra kombinasjonen av sprøyter som brukes til formulering i henhold til produsentens håndbok. Sluttavfallet opplever imidlertid ikke samme grad av ikke-stabile strømningsforhold, så volumet settes ofte til 0,05 ml for alle sprøytekombinasjoner i henhold til produsentens anbefaling.
Det er viktig å ta hensyn til dødt volum i sprøyter og rør når du forbereder de riktige volumene av de organiske og vandige fasene. Forberedelse av 10% ekstra volum av hver fase sikrer at minimumsvolumet av LNP ønsket kan formuleres. I denne protokollen ble et totalt formuleringsvolum på 4,7 ml tilført 0,7 ml avfall, noe som resulterte i 4 ml LNP samlet under stabile forhold. Imidlertid ble 1, 3 ml av den organiske fase og 3, 9 ml av den vandige fase fremstilt for formulering. Dette sikrer at sprøyten på 5 ml kan fylles opp til 3,6 ml merket og 3 ml sprøyten kan fylles opp til 1,2 ml merket. Hvis volumet når merkene på sprøytene, er volumspesifikasjonene som brukes på det mikrofluidiske instrumentet sikre innganger. Det siste skjermbildet før du trykker på "START" -knappen er avgjørende for å sikre at alle parametrene er riktige. Det er viktig å foreta en siste sjekk av sprøytetypene, volumene i sprøytene, volumene som skal utdeles, sprøytens plassering og strømningshastigheten.
Etter formuleringen av mRNA-LNP har dialysetrinnet noen viktige hensyn å huske på. Dialysekassettene som brukes krever en minimum hydreringstid på 2 minutter før LNP-ene kan lastes. Dette øker membranfleksibiliteten og gjør at membranen lettere kan justeres etter hvert som prøven tilsettes. I tillegg må det tas hensyn til ikke å skade eller punktere membranene til dialysekassettene mens du laster dem med mRNA-LNP. Hvis membranene blir punktert eller skadet, kan de formulerte mRNA-LNP-ene lett gå tapt ved lasting.
I denne protokollen testet vi in vitro-effektiviteten til mRNA-LNP i HepG2-celler. Imidlertid kan andre celletyper testes for mRNA-LNP transfeksjonseffektivitet. Hvis ikke-adherente celler brukes, krever 96-brønnplaten sentrifugering ved 500 g i 5 minutter før fjerning av cellekulturmediet25. Dette minimerer tap av celler under mediet fjerning. Cellene bør også testes for tilstedeværelse av mykoplasma før eventuelle LNP-transfeksjonsstudier. Det vil være vanskelig å oppnå konsistente resultater og sammenligne ulike LNP-formuleringer hvis cellene tester positivt for mykoplasma. I tillegg kan primære celler kreve høyere doser LNP for å måle transfeksjon uten toksisitet sammenlignet med cellelinjer. En luciferasebasert levedyktighetsanalyse kan brukes til å evaluere mRNA-LNP-toksisiteten in vitro ved varierende doser i både primære celler og cellelinjer18.
Et av de viktigste trinnene for å oppnå konsistente bioluminescensmålinger på tvers av forskjellige mus etter behandling med samme mRNA-LNP-formulering, er å sikre at tiden mellom intraperitoneal injeksjon av d-luciferin og IVIS-måling er konsistent26. Dette tidsintervallet påvirker stabiliteten til det bioluminescerende signalet som er oppnådd. Tidsintervallet må være langt nok til at eventuelle svingninger i signalet minimeres. Et foreløpig eksperiment kan kjøres der musene avbildes hvert minutt etter d-luciferininjeksjonen. Tidsintervallet når signalet begynner å platå er det som passer best for transfeksjonseksperimentet. I denne protokollen tillot et intervall på 10 minutter stabile luminescenssignaler etter injeksjonen med 150 mg d-luciferin/kg kroppsvekt, som vanligvis utføres for avbildning27,28.
I tillegg er mRNA-LNP-dosen som brukes i denne protokollen (0,1 mg mRNA / kg kroppsvekt) liten sammenlignet med dosene som brukes til å vurdere toksisitet og terapeutisk effekt29,30. Disse mindre dosene bidrar til å evaluere forskjeller i potensene til unike mRNA-LNP-formuleringer, mens de ikke overmetter det luminescerende signalet som er oppnådd. Imidlertid kan denne dosen økes for å måle potensiell mRNA-LNP-toksisitet. For eksempel kan levertoksisitet evalueres ved å kvantifisere nivåene av alanintransaminase, aspartattransaminase og alkalisk fosfatase i serum på forskjellige tidspunkter etter mRNA-LNP-injeksjon31,32,33. Disse enzymene finnes normalt i lave nivåer i serum, men økes som følge av leverskade. Kommersielt tilgjengelige sett kan brukes til å kvantifisere mengden av disse enzymene i serumet.
I dette eksemplet brukte vi firefly luciferase-kodende mRNA, men andre reporter-mRNA kan formuleres i LNP for å vurdere potens. mRNA som koder for grønt fluorescerende protein (GFP) eller mCherry kan brukes til å undersøke cellespesifikk levering etter mRNA-LNP-behandling34,35. En encellesuspensjon kan produseres fra vev av interesse, og GFP+- eller mCherry+-celler kan vurderes ved flowcytometrianalyse. I tillegg kan mRNA-LNP formuleres med mRNA-koding for erytropoietin for å måle levertransfeksjon gjennom sekresjon av erytropoietin i serum 8,36,37. I Ai9-mus induserer levering av mRNA-koding av Cre recombinase robust tdTomatfluorescens, som kan tjene som en annen metode for å undersøke mRNA-LNP-levering til forskjellige cellepopulasjoner38,39,40. Gjennom demonstrasjonen av denne arbeidsflyten er det vårt håp at mRNA-LNP-formulering slutter å være en barriere for etterforskere når de utforsker nye ideer og muligheter for mRNA-terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
MJM anerkjenner støtte fra en US National Institutes of Health (NIH) direktørens New Innovator Award (DP2 TR002776), en Burroughs Wellcome Fund Career Award ved Scientific Interface (CASI), en US National Science Foundation CAREER-pris (CBET-2145491), og tilleggsfinansiering fra National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 og NIDDK R01 DK123049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
