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Bioengineering

测试通过微流控混合配制的mRNA-脂质纳米颗粒的 体外 和 体内 效率

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64810
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

Summary

在这里，提出了一种用于配制脂质纳米颗粒（LNP）的方案，该脂质纳米颗粒封装编码萤火虫荧光素酶的mRNA。这些 LNP 在体外 HepG2 细胞和体内 C57BL/6 小鼠中测试 了它们的效力。

Abstract

最近，随着 Moderna 和辉瑞/BioNTech 成功开发 COVID-19 mRNA 疫苗，脂质纳米颗粒 （LNP） 引起了广泛关注。这些疫苗证明了mRNA-LNP疗法的疗效，并为未来的临床应用打开了大门。在 mRNA-LNP 系统中，LNP 作为递送平台，保护 mRNA 货物免受核酸酶降解并介导其细胞内递送。LNP 通常由四种组分组成：可电离脂质、磷脂、胆固醇和脂质锚定聚乙二醇 （PEG） 偶联物 （lipid-PEG）。在这里，通过微流控混合含有LNP脂质成分的有机相和含有mRNA的水相来制备封装编码萤火虫荧光素酶的mRNA的LNP。然后使用基于生物发光板的测定法在体外测试这些 mRNA-LNP，以评估它们在 HepG2 细胞中的转染效率。此外，在通过侧尾静脉静脉注射后，在C57BL / 6小鼠中在体内评估mRNA-LNP。全身生物发光成像是通过使用体内成像系统进行的。显示了 mRNA-LNP 特性、它们在 HepG2 细胞中的转染效率以及 C57BL/6 小鼠中的总发光通量的代表性结果。

Introduction

近年来，脂质纳米颗粒（LNPs）在非病毒基因治疗领域展现出巨大的前景。2018 年，美国食品和药物管理局 （FDA） 批准了有史以来第一个 RNA 干扰 （RNAi） 疗法 Onpattro by Alnylam，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性 1,2,3,4。这是脂质纳米颗粒和基于RNA的疗法向前迈出的重要一步。最近，Moderna 和辉瑞/BioNTech 的 mRNA-LNP 疫苗获得了 FDA 批准，用于对抗 SARS-CoV-2 4,5。在每一种基于 LNP 的核酸疗法中，LNP 都有助于保护其货物免受核酸酶降解，并促进有效的细胞内递送 6,7。虽然 LNP 在 RNAi 疗法和疫苗应用中取得了成功，但 mRNA-LNP 也被探索用于蛋白质替代疗法8 以及 Cas9 mRNA 的共同递送和引导 RNA 的递送，用于递送用于基因编辑的 CRISPR-Cas9 系统9。然而，没有一种特定的制剂适合所有应用，LNP制剂参数的细微变化会极大地影响体内的效力和生物分布8,10,11。因此，必须开发和评估单个 mRNA-LNP，以确定每种基于 LNP 的疗法的最佳配方。

LNP 通常由四种脂质成分配制而成：可电离脂质、磷脂、胆固醇和脂质锚定聚乙二醇 （PEG） 偶联物 （lipid-PEG）11,12,13。LNP促进的有效细胞内递送部分依赖于可电离脂质成分12。该成分在生理pH值下呈中性，但在内体11的酸性环境中带正电。离子电荷的这种变化被认为是内体逃逸的关键因素12,14,15。除了可电离脂质外，磷脂（辅助脂质）成分还改善了货物的包封并有助于内体逃逸，胆固醇提供稳定性并增强膜融合，脂质-PEG 最大限度地减少循环中 LNP 聚集和调理作用10,11,14,16.为了配制LNP，将这些脂质成分结合在有机相（通常是乙醇）中，并与含有核酸货物的水相混合。LNP配方工艺用途广泛，因为它允许以不同的摩尔比轻松替换和组合不同的组分，以配制许多具有多种物理化学性质的LNP配方10,17。然而，在探索种类繁多的LNP时，至关重要的是，必须使用标准化程序对每种配方进行评估，以准确测量表征和性能的差异。

本文概述了mRNA-LNP的配方及其在细胞和动物中性能评估的完整工作流程。

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Protocol

注意：在配制 mRNA-LNP 时，始终保持无 RNase 条件，方法是用 RNase 和 DNA 的表面去污剂擦拭表面和设备。仅使用不含 RNase 的吸头和试剂。

所有动物程序均按照宾夕法尼亚大学的《实验动物护理和使用指南》和宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行。

1.制剂前准备

  1. 用 200-300 mL 新鲜的 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 填充干净的 4 L 烧杯。
    1. 用超纯水将烧杯中的10x PBS稀释10倍，以获得1x PBS的烧杯。确保1x PBS的最终体积在2-3L之间。
    2. 将适合LNP制剂容量的透析盒（20kDa截留分子量[MWCO]）放入填充的烧杯中以水合它们。
      注意：透析盒在使用前至少需要 2 分钟来补水。
    3. 将搅拌棒放入烧杯中，并用铝箔盖住烧杯。
    4. 将盖好的烧杯放在磁力搅拌板上。打开搅拌板，将其设置为以 300-400 rpm 的速度旋转。
  2. 用超纯水将 100 mM 柠檬酸缓冲液 （pH 3） 稀释 10 倍，以产生用于 mRNA 稀释的 10 mM 柠檬酸缓冲液。
  3. 通过将每种脂质溶解在 100% 乙醇中，制备 C12-200 可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和脂质锚定 PEG（脂质-PEG）储备溶液。脂质成分的浓度详见 表1。
    1. 在37°C下加热并混合储备溶液，以确保它们完全溶解。

2. 脂质和核酸混合物的制备

  1. 根据所需的摩尔比和可电离脂质与mRNA的重量比计算所需的可电离脂质，辅助脂质，胆固醇和脂质-PEG的体积（表1）。准备10%的额外体积的有机相，以考虑配制过程中注射器中的死体积。
    1. 将锥形管中不同脂质成分的计算体积组合在一起。
    2. 用100%乙醇稀释脂质至最终体积 V，其代表LNP最终体积的25%。
  2. 根据可电离脂质与mRNA的重量比和所需的mRNA-LNP总体积计算制剂所需的mRNA量（表1）。
    1. 在冰上解冻萤火虫荧光素酶编码的mRNA。
    2. 在10mM柠檬酸缓冲液中将mRNA稀释至最终体积3V，是有机相体积的三倍。
      注意：每个脂质体积 V 必须含有足够的可电离脂质，用于在 3V 中稀释的 mRNA。这对应于所需的可电离脂质与mRNA的重量比。

3. mRNA-LNPs的微流控配方

  1. 用表面去除 RNase 和 DNA 的污染物喷洒精细的任务擦拭布，并彻底擦拭微流体仪器的内部。
    1. 打开一个新的微流控滤芯，插入时入口通道朝下并背对。
    2. 确保锥形管臂固定两个 15 mL 锥形管，并且位于最右侧的位置。
    3. 在盖子关闭的情况下，在支架上配置两个无菌 15 mL 锥形管。
  2. 用含有在 10 mM 柠檬酸缓冲液中稀释的 mRNA 的 mRNA 溶液填充 5 mL 注射器。
    1. 用脂质溶液填充 3 mL 注射器，该脂质溶液含有在纯 100% 乙醇中稀释的脂质。
    2. 向上翻转微流体装置上的墨盒支架。
    3. 将含有 mRNA 的 5 mL 注射器（不含针头）插入卡式瓶的左侧入口。
    4. 将含有脂质的 3 mL 注射器（不含针头）插入墨盒的右侧入口。
    5. 将墨盒支架翻转回去，然后关闭微流体仪器的盖子。
  3. 使用位于仪器背面的开关打开微流体仪器。
    1. 选择 “快速运行”。
    2. 为插入的 5 mL 和 3 mL 注射器选择正确的注射器类型。
    3. 如 表2所述，以3：1的水与有机流速比输入mRNA-LNP制剂的参数。
    4. 按 “下一步 ”按钮转到下一个屏幕。
    5. 确认输入了正确的参数。
    6. 按下 开始 按钮配制 mRNA-LNP。

4. mRNA-LNP的制剂后处理和表征

  1. 将收集在右锥形管中的mRNA-LNP加载到先前水合的透析盒中。
    注意：加载 mRNA-LNP 时，请勿刺穿或损坏盒的膜。如果膜损坏，mRNA-LNPs将在加载时丢失。
    1. 将含有mRNA-LNP的透析盒放回含有1x PBS的烧杯中，并让它们透析至少2小时。
    2. 透析后，将含有mRNA-LNP的透析盒放入无菌生物安全柜中，并使用带针头的注射器取出mRNA-LNP。
    3. 使用0.22μm注射器过滤器无菌过滤mRNA-LNP，并将它们收集在无菌锥形管中。
    4. 将 65 μL mRNA-LNP 溶液放入 1.5 mL 微管中以进行表征。
  2. 在比色皿中将 10 μL mRNA-LNP 以 1：100 的比例稀释在 990 μL 的 1x PBS 中，以使用动态光散射测量流体动力学尺寸和多分散指数。
  3. 使用荧光测定法（即RiboGreen）评估mRNA-LNP的浓度和包封效率。
    1. 通过用分子生物学水稀释20x TE缓冲液来制备1x TE缓冲液的储备溶液。
    2. 通过用1x TE缓冲液稀释Triton X-100，制备1%Triton X-100缓冲液的储备溶液。
    3. 用 1x TE 缓冲液以 1：200 稀释试剂储备液来制备荧光试剂。
    4. 在 100 μL 的黑壁黑底 96 孔板中以 1：100 的比例稀释 mRNA-LNP 和 1% Triton X-100 缓冲液。
    5. 按照制造商的说明稀释RNA标准品，制备低范围标准曲线，并将标准曲线铺在96孔板中。
    6. 向每个含有稀释的 mRNA-LNP 或稀释标准品的孔中加入 100 μL 稀释的荧光试剂。
    7. 将 96 孔板放入酶标仪中，摇动 1 分钟，然后等待 4 分钟。
    8. 根据制造商的方案，在480nm / 520nm的激发/发射下测量每个孔的荧光强度。
  4. 使用标准曲线将荧光值转换为浓度。
    1. 根据 公式4.4，从在1%Triton X-100（总mRNA）中稀释LNPs获得的值中减去在TE缓冲液（未包封的mRNA）中稀释LNP获得的值，并除以在1%Triton X-100中稀释LNP获得的值，计算包封效率。
    2. 计算用于细胞和动物研究的mRNA-LNP浓度，方法是从1%Triton X-100（总mRNA）中稀释LNP获得的值中减去在TE缓冲液（未封装的mRNA）中稀释LNP获得的值。
  5. 通过进行6-（对甲苯胺基）-2-萘磺酰氯（TNS）测定来测量mRNA-LNP的pKa 。
    1. 通过在超纯水中制备0.16mM的TNS溶液来制备TNS试剂。
      注意：使用试剂时，请务必将其放在冰上并避光，以免降解。
    2. 制备150mM氯化钠，20mM磷酸钠，25mM柠檬酸铵和20mM醋酸铵的缓冲溶液，以0.5的增量调节至2至12的不同pH值。
    3. 在黑壁黑底 96 孔板中向每种 pH 调节缓冲溶液中加入 2.5 μL LNP。
    4. 向每个孔中加入TNS试剂，使最终TNS浓度为6μM。
    5. 将 96 孔板在黑暗位置孵育 5 分钟。
    6. 使用荧光酶标仪测量322nm / 431nm激发/发射的荧光。
    7. 将数据拟合到S形曲线上，并使用拟合方程计算pKa ，以找到观察到最大强度的50%的pH值。
  6. mRNA-LNP流体动力学尺寸、PDI、包封效率和pKa 的代表性结果如 表3所示。

5. HepG2细胞的 体外 转染

注：各种其他细胞系，如HeLa细胞或HEK-293T细胞，可用于评估LNP 在体外的转染效率。在 LNP 转染研究之前，所有细胞的支原体检测均应呈阴性。

  1. 在 100 μL 完全细胞培养基（补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM）中，在白壁透明底 96 孔板的每个孔中接种 5,000 个 HepG2 细胞
    1. 让细胞在37°C和5%CO 2的受控CO2培养箱中粘附过夜。
  2. 在完全细胞培养基中稀释mRNA-LNP，使总剂量以100μL递送。
    1. 从孔中取出完整的培养基。
    2. 用在所需剂量的完全细胞培养基或完全培养基（对照）中稀释的mRNA-LNP处理细胞。
    3. 将含有处理细胞的 96 孔板放回受控的 CO2 培养箱中 24 小时。
  3. 通过进行荧光素酶测定来评估转染效率。
    1. 按照制造商的说明制备荧光素酶试剂和1x细胞裂解缓冲液。
    2. 从培养箱中取出装有细胞的 96 孔板，并将其放入生物安全柜中。
    3. 从96孔板的每个孔中取出细胞培养基。
    4. 向每个孔中加入 20 μL 的 1x 裂解缓冲液，然后加入 100 μL 先前制备的荧光素酶测定试剂。
    5. 保护板避光，并将板放入酶标仪中以测量每个孔的生物发光信号。
      注： 图1显示了用先前配制的C12-200 mRNA-LNP处理HepG2细胞的代表性结果。

6. 尾静脉注射后小鼠mRNA-LNPs的 体内 评价

  1. 用无菌1x PBS稀释mRNA-LNP溶液，使2μg总mRNA存在于100μL尾静脉注射体积中，这相当于20g小鼠的体重剂量约为0.1mg / kg。
  2. 使用经批准的方法约束每只鼠标，并用蘸有 70% 酒精的垫擦拭尾巴。
    1. 用 100 μL mRNA-LNP （2 μg） 或 100 μL 1x PBS 填充 29 G 胰岛素注射器。从注射器中去除所有气泡。
    2. 将针头斜面朝上插入小鼠的侧尾静脉，并缓慢注射100μL的mRNA-LNP或1x PBS。
    3. 取下针头并施加压力，直到达到止血。
  3. 注射后 6 小时在无菌 1x PBS 中制备 15 mg/mL d-荧光素钾盐的储备溶液。
    1. 打开 活体 成像系统（IVIS），打开成像软件。
    2. 按 初始化 准备仪器进行数据采集。
    3. 选中发光旁边的框，并将曝光时间设置为自动。确保为正在成像的小鼠数量选择了正确的视野。
    4. 腹膜内施用200μLd-荧光素（每kg体重150mg荧光素）给先前治疗的小鼠。
    5. 将小鼠置于设置为2.5%异氟醚和2.0L / min氧气流速的麻醉室中。
    6. 等待10分钟，使荧光素酶信号稳定，然后对mRNA-LNP处理的小鼠进行成像。
    7. 确保小鼠完全麻醉，并重定向麻醉线以 通过 成像室内的鼻锥施用异氟醚。
    8. 将小鼠转移到鼻锥上，并确保它们仰卧，腹部暴露在外。
    9. 关闭腔室门，点击软件中的 采集 按钮，获取生物发光图像。
      注：mRNA-LNP或1X PBS处理后小鼠全身成像的代表性结果 如图2所示。

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Representative Results

mRNA-LNPs采用微流控仪器配制，其平均流体动力学直径为76.16 nm，多分散指数为0.098。通过进行 TNS 测定，发现 mRNA-LNP 的 pKa 为 5.7518。使用改良荧光测定法和 方程式 4.4 计算出这些 mRNA-LNP 的包封效率为 92.3%。用于细胞处理和动物给药的总RNA浓度为40.24 ng/μL。该值是从改良的荧光测定19中获得的，特别是通过将用1%Triton X-100和1x TE缓冲液稀释LNPs到一定浓度并计算包封的mRNA的量来获得的荧光。

方程 4.4

Equation 1

CTX = 在 1% Triton X-100 中稀释的 LNP 的 mRNA 浓度

C TE = 在 1x TE 缓冲液中稀释的 LNP 的 mRNA 浓度

用不同剂量的 mRNA-LNP 处理每孔 5,000 个 HepG2 细胞后，观察到生物发光增加，剂量增加。在本研究中使用的最低剂量（5 ng/孔）下很容易检测到荧光素酶表达。然而，其他细胞系可能需要不同量的mRNA-LNP才能轻松看到不同剂量的发光差异。

用 2 μg mRNA-LNP 处理小鼠，并在 6 小时后评估全身生物发光。由于 C12-200 mRNA-LNP 主要转染肝脏20，因此在用我们配制的 LNP 处理的小鼠的上腹部观察到强烈的生物发光信号。 使用成像软件，在肝脏信号周围绘制感兴趣的区域以计算总发光通量。在该实验中，总光通量约为 5 x 109，这与使用该 LNP 配方 4,21 进行的其他研究一致。

表1：有机相组成。 描述了单个脂质储备溶液的浓度以及每种组分对 1.3 mL 有机相的贡献体积。脂质以35/16/46.5/2.5（C12-200：DOPE：胆固醇：C14-PEG2000）的摩尔比结合。准备了 10% 的额外体积，以说明配制过程中注射器死体积。 请按此下载此表格。

表 2：mRNA-LNP 配方的微流控仪器设置，水与有机流速比为 3：1。 将含有在 10 mM 柠檬酸缓冲液中稀释的 mRNA 的 5 mL 注射器插入中心通道，同时将含有脂质的 3 mL 注射器插入右侧通道。LNP以10：1的可电离脂质：mRNA的重量比配制。 请按此下载此表格。

表 3：通过动态光散射、改良荧光测定法和 2-（对甲苯胺基）萘-6-磺酸 （TNS） 测定法测定的 mRNA-LNP 表征数据。请按此下载此表格。

Figure 1
图 1：用萤火虫荧光素酶 mRNA-LNP 处理的 HepG2 细胞。 总体而言，每孔接种 5,000 个 HepG2 细胞，放入 96 孔板中，并使其粘附过夜。将细胞培养在补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 中。在用 5 ng、10 ng 和 20 ng 剂量的含 C12-200 的 LNP 制剂（在 100 μL 细胞培养基中）封装萤火虫荧光素酶编码 mRNA 处理细胞之前，去除细胞培养基。处理后24小时，除去细胞培养基，在加入100μL荧光素酶测定试剂之前，向细胞中加入20μL 1x裂解缓冲液。在孵育5分钟后，使用酶标仪测量每个孔的生物发光。相对于由未经处理的HepG2细胞组成的对照孔绘制倍数增加图。使用单因素方差分析和事后Tukey检验评估统计显着性。ns，不显著;， p < 0.0001。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2：用萤火虫荧光素酶 mRNA-LNP 处理的 C57BL/6 小鼠。 在这项工作中， 通过 侧尾静脉向 C57BL/6 小鼠施用 100 μL 或 100 μL 1x PBS 中的 2 μg 总 mRNA-LNP。（A） 用 mRNA-LNP 或 1X PBS 处理的小鼠的全身生物发光在给药后 6 小时使用 体内 成像系统 （IVIS） 测量。使用IVIS Spectrum Living Image软件对全身图像进行分析和采集。N = 3。（B）对总发光通量进行量化并绘制。使用双尾学生 t 检验评估统计显着性。**， 第 < 0.01 页。 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

通过该工作流程，可以配制和测试各种mRNA-LNP的体外和体内效率。可电离脂质和赋形剂可以以不同的摩尔比和不同的可电离脂质与mRNA重量比进行交换和组合，以产生具有不同物理化学性质的mRNA-LNPs22。在这里，我们配制了摩尔比为 35/16/46.5/2.5（可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：脂质-PEG）的 C12-200 mRNA-LNP，可电离脂质与 mRNA 重量比为 10：1。这些 LNP 在体外 HepG2 细胞中和体内 C57BL/6 小鼠中测试了它们的转染效率。C12-200 mRNA-LNPs是使用市售的微流控仪器通过微流控混合合成的。虽然可以使用其他配方方法配制 LNP，例如移液器混合或 T 型液络部混合 4，但微流控混合配制的 mRNA-LNP 通常更小、多分散性更低，并且具有更高的包封效率 4,13,23,24。

使用市售的微流控仪器配制mRNA-LNP可以简单灵活地配制LNP。当注射器推料器加速到全速时，运行开始时的流速与设定的目标流速不同。这可能导致颗粒特性多变和结果不一致。为了克服这个问题，微流体仪器被设计为将配方开始和结束时配制的LNP作为废物收集，与在稳态条件下配制的LNP分开收集。这可以降低多分散性并导致更一致的颗粒特性。根据制造商的手册，可以根据用于配制的注射器组合来计算启动浪费。然而，最终废液不会经历相同程度的非稳态流动条件，因此根据制造商的建议，所有注射器组合的体积通常设置为 0.05 mL。

在制备正确体积的有机相和水相时，考虑注射器和试管中的死体积至关重要。每相额外准备 10% 的体积可确保配制所需的最小体积的 LNP。在该方案中，将总制剂体积为4.7mL与0.7mL废物一起输入，从而在稳态条件下收集4mL LNP。然而，制备了1.3 mL的有机相和3.9 mL的水相用于配制。这确保了 5 mL 注射器可以填充到 3.6 mL 标记，而 3 mL 注射器可以填充到 1.2 mL 标记。如果体积达到注射器上的标记，则微流体仪器上使用的体积规格是安全的输入。按下“开始”按钮之前的最后一个屏幕对于确保所有参数正确至关重要。重要的是要对注射器类型、注射器中的体积、要分配的体积、注射器位置和流速进行最终检查。

在配制 mRNA-LNP 后，透析步骤需要牢记一些重要的注意事项。在加载LNP之前，使用的透析盒需要至少2分钟的水合时间。这增加了膜的柔韧性，并允许膜在添加样品时更容易调整。此外，在用 mRNA-LNP 加载透析盒时，必须注意不要损坏或刺穿透析盒的膜。如果膜被刺破或损坏，配制的 mRNA-LNP 在上样时很容易丢失。

在该方案中，我们测试了 HepG2 细胞中 mRNA-LNP 的体外效率。然而，可以测试其他细胞类型的mRNA-LNP转染效率。如果使用非贴壁细胞，则在去除细胞培养基25之前，96孔板需要以500g离心5分钟。这最大限度地减少了培养基去除过程中的任何细胞损失。在进行任何 LNP 转染研究之前，还应检测细胞是否存在支原体。如果细胞的支原体检测呈阳性，将很难获得一致的结果并比较不同的 LNP 制剂。此外，与细胞系相比，原代细胞可能需要更高剂量的LNP来测量无毒性的转染。基于荧光素酶的活力测定可用于评估原代细胞和细胞系中不同剂量的体外 mRNA-LNP 毒性18。

在用相同的 mRNA-LNP 制剂处理后，在不同小鼠之间获得一致的生物发光测量值的最重要步骤之一是确保腹膜内注射 d-荧光素和 IVIS 测量之间的时间一致26.该时间间隔会影响所获得的生物发光信号的稳定性。时间间隔需要足够长，以便将信号中的任何波动降至最低。可以进行初步实验，其中在d-荧光素注射后每分钟对小鼠进行成像。信号开始趋于平稳的时间间隔是最适合转染实验的时间间隔。在该协议中，在150mg d-荧光素/ kg体重注射后，10分钟的间隔允许稳定的发光信号，这通常用于成像27,28。

此外，与用于评估毒性和治疗效果的剂量相比，该方案中使用的mRNA-LNP剂量（0.1mg mRNA / kg体重）很小29,30。这些较小的剂量有助于评估独特 mRNA-LNP 制剂效力的差异，同时不会使获得的发光信号过度饱和。然而，可以增加该剂量以测量潜在的 mRNA-LNP 毒性。例如，可以通过量化 mRNA-LNP 注射后不同时间点血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶的水平来评估肝毒性31,32,33。这些酶通常在血清中含量较低，但由于肝损伤而增加。市售试剂盒可用于定量血清中这些酶的含量。

在这个例子中，我们使用了萤火虫荧光素酶编码的mRNA，但其他报告基因mRNA可以配制成LNP来评估效力。编码绿色荧光蛋白 （GFP） 或 mCherry 的 mRNA 可用于研究 mRNA-LNP 处理后的细胞特异性递送34,35。可以从感兴趣的组织中产生单细胞悬液，并且可以通过流式细胞术分析评估GFP+或mCherry+细胞。此外，mRNA-LNP可以用编码促红细胞生成素的mRNA配制，以便通过血清中促红细胞生成素的分泌来测量肝脏转染8,36,37。在 Ai9 小鼠中，编码 Cre 重组酶的 mRNA 递送诱导强大的 tdTomato 荧光，这可以作为研究 mRNA-LNP 递送至不同细胞群的另一种方法38,39,40。通过该工作流程的演示，我们希望 mRNA-LNP 制剂不再是研究人员探索 mRNA 疗法新想法和可能性的障碍。

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Disclosures

没有利益冲突需要声明。

Acknowledgments

M.J.M. 感谢美国国立卫生研究院 （NIH） 主任新创新者奖 （DP2 TR002776）、科学界面 （CASI） 的 Burroughs Wellcome 基金职业奖、美国国家科学基金会职业奖 （CBET-2145491） 以及美国国立卫生研究院（NCI R01 CA241661、NCI R37 CA244911 和 NIDDK R01 DK123049）的额外资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Hydrochloric Acid Sigma 7647-01-0
0.22 μm Syringe Filters Genesee 25-243
1 mL BD Slip Tip Syringe BD 309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) Avanti Polar Lipids 880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) Avanti Polar Lipids 850725P
1.5 mL Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
200 proof Ethanol Decon Labs 2716
23G Needles Fisher Scientific 14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips Fisher Scientific 14-823-435
3 mL Dialysis Cassettes Thermo Scientific A52976
96 Well Black Wall Black Bottom Plate Fisher Scientific 07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface Thermo Scientific 165306
Ammonium Acetate, 1 Kilogram Research Products International  631-61-8
Ammonium Citrate dibasic SIgma 3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL BD 309646
C12-200 Ionizable Lipid Cayman Chemical 36699
C57BL/6 Mice Jackson Laboratory 000664
Cholesterol Sigma 57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU) TriLink Biotechnologies L-7202
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955129
D-Luciferin, Potassium Salt Thermo Scientific L2916
DMEM, high glucose Thermofisher Scientific 11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mL Fisher Scientific 1484132
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Hep G2 [HEPG2] ATCC HB-8065
HyPure Molecular Biology Grade Water Cytiva SH30538.03
Infinite 200 PRO Plate Reader Tecan N/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer N/A
Large Kimwipes Fisher Scientific 06-666-11D
Luciferase Assay Kit Promega E4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack Precision Nanosystems NIN0065
NanoAssemblr Ignite Instrument Precision Nanosystems NIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free Thermo Scientific AM9624
Penicillin-Streptomycin Thermofisher Scientific 15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 Teknova Q2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Scientific R11490
Reporter Lysis 5x Buffer Promega E3971
RNase Away Surface Decontaminant Thermofisher Scientific 7000TS1
Sodium Chloride Sigma 7647-14-5
Sodium Hydroxide Sigma 1310-73-2
Sodium Phosphate Sigma 7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) Sigma T9792
Triton X-100 Sigma 9036-19-5
Zetasizer Malvern Panalytical NanoZS

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References

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El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing. J. Vis. Exp. (191), e64810, doi:10.3791/64810 (2023).

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