Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het formuleren van lipide nanodeeltjes (LNP's) die mRNA inkapselen dat codeert voor vuurvliegluciferase. Deze LNP's werden in vitro getest op hun werkzaamheid in HepG2-cellen en in vivo in C57BL/6-muizen.
Abstract
Lipide nanodeeltjes (LNP's) hebben de laatste tijd veel aandacht getrokken met de succesvolle ontwikkeling van de COVID-19 mRNA-vaccins door Moderna en Pfizer/BioNTech. Deze vaccins hebben de werkzaamheid van mRNA-LNP-therapieën aangetoond en de deur geopend voor toekomstige klinische toepassingen. In mRNA-LNP-systemen dienen de LNP's als leveringsplatforms die de mRNA-lading beschermen tegen afbraak door nucleasen en hun intracellulaire afgifte bemiddelen. De LNP's bestaan doorgaans uit vier componenten: een ioniseerbaar lipide, een fosfolipide, cholesterol en een lipide-verankerd polyethyleenglycol (PEG)-conjugaat (lipide-PEG). Hier worden LNP's die mRNA inkapselen dat codeert voor vuurvliegluciferase geformuleerd door microfluïdische menging van de organische fase met LNP-lipidecomponenten en de waterige fase die mRNA bevat. Deze mRNA-LNP's worden vervolgens in vitro getest om hun transfectie-efficiëntie in HepG2-cellen te evalueren met behulp van een bioluminescente plaatgebaseerde test. Bovendien worden mRNA-LNP's in vivo geëvalueerd bij C57BL/6-muizen na een intraveneuze injectie via de laterale staartader. Bioluminescentiebeeldvorming van het hele lichaam wordt uitgevoerd met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem. Representatieve resultaten worden getoond voor de mRNA-LNP-kenmerken, hun transfectie-efficiëntie in HepG2-cellen en de totale luminescente flux in C57BL/6-muizen.
Introduction
Lipide nanodeeltjes (LNP's) zijn de afgelopen jaren veelbelovend gebleken op het gebied van niet-virale gentherapie. In 2018 keurde de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) het allereerste RNA-interferentietherapeutisch middel (RNAi), Onpattro van Alnylam, goed voor de behandeling van erfelijke transthyretine-amyloïdose 1,2,3,4. Dit was een belangrijke stap voorwaarts voor lipide nanodeeltjes en RNA-gebaseerde therapieën. Meer recentelijk ontvingen Moderna en Pfizer/BioNTech FDA-goedkeuringen voor hun mRNA-LNP-vaccins tegen SARS-CoV-2 4,5. In elk van deze op LNP gebaseerde nucleïnezuurtherapieën dient de LNP om zijn lading te beschermen tegen afbraak door nucleasen en om krachtige intracellulaire afgifte te vergemakkelijken 6,7. Hoewel LNP's succes hebben geboekt in RNAi-therapieën en vaccintoepassingen, zijn mRNA-LNP's ook onderzocht voor gebruik in eiwitvervangende therapieën8 en voor de gelijktijdige afgifte van Cas9-mRNA en gids-RNA voor de levering van het CRISPR-Cas9-systeem voor genbewerking9. Er is echter niet één specifieke formulering die geschikt is voor alle toepassingen, en subtiele veranderingen in de LNP-formuleringsparameters kunnen de potentie en biodistributie in vivo sterk beïnvloeden 8,10,11. Individuele mRNA-LNP's moeten dus worden ontwikkeld en geëvalueerd om de optimale formulering voor elke op LNP gebaseerde therapie te bepalen.
LNP's worden gewoonlijk geformuleerd met vier lipidecomponenten: een ioniseerbaar lipide, een fosfolipide, cholesterol en een lipide-verankerd polyethyleenglycol (PEG)-conjugaat (lipide-PEG)11,12,13. De krachtige intracellulaire afgifte die door LNP's wordt gefaciliteerd, is gedeeltelijk afhankelijk van de ioniseerbare lipidecomponent12. Deze component is neutraal bij fysiologische pH, maar wordt positief geladen in de zure omgeving van het endosoom11. Deze verandering in ionische lading wordt verondersteld een belangrijke bijdrage te leveren aan endosomale ontsnapping12,14,15. Naast het ioniseerbare lipide verbetert de fosfolipidecomponent (helperlipide) de inkapseling van de lading en helpt bij endosomale ontsnapping, het cholesterol biedt stabiliteit en verbetert de membraanfusie, en de lipide-PEG minimaliseert LNP-aggregatie en opsonisatie in circulatie10,11,14,16. Om het LNP te formuleren, worden deze lipidecomponenten gecombineerd in een organische fase, meestal ethanol, en gemengd met een waterige fase die de nucleïnezuurlading bevat. Het LNP-formuleringsproces is zeer veelzijdig omdat het het mogelijk maakt om verschillende componenten gemakkelijk te vervangen en te combineren in verschillende molaire verhoudingen om veel LNP-formuleringen te formuleren met een veelheid aan fysisch-chemische eigenschappen10,17. Bij het verkennen van deze grote verscheidenheid aan LNP's is het echter van cruciaal belang dat elke formulering wordt geëvalueerd met behulp van een gestandaardiseerde procedure om de verschillen in karakterisering en prestaties nauwkeurig te meten.
Hier wordt de volledige workflow voor de formulering van mRNA-LNP's en de beoordeling van hun prestaties in cellen en dieren geschetst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTITIE: Handhaaf altijd RNase-vrije omstandigheden bij het formuleren van mRNA-LNP's door de oppervlakken en apparatuur af te vegen met een oppervlakteontsmettingsmiddel voor RNases en DNA. Gebruik alleen RNasevrije tips en reagentia.
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren aan de Universiteit van Pennsylvania en een protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Pennsylvania.
1. Pre-formulering voorbereiding
- Vul een schoon bekerglas van 4 liter met 200-300 ml verse 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verdun de 10x PBS in het bekerglas 10-voudig met ultrapuur water om een bekerglas van 1x PBS te verkrijgen. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van de 1x PBS tussen 2-3 L ligt.
- Plaats dialysecassettes (20 kDa molecuulgewicht cutoff [MWCO]) met de juiste capaciteit voor de LNP-formulering in het gevulde bekerglas om ze te hydrateren.
NOTITIE: Dialysecassettes hebben minimaal 2 minuten nodig om te hydrateren voor gebruik. - Plaats een roerstaaf in het bekerglas en dek het bekerglas af met aluminiumfolie.
- Plaats het deksel met beker op een magnetisch roerplaatje. Zet de roerplaat aan en laat hem draaien op 300-400 tpm.
- Verdun een 100 mM citroenzuurbuffervoorraad (pH 3) 10-voudig met ultrapuur water om de 10 mM citroenzuurbuffer te creëren die wordt gebruikt voor mRNA-verdunning.
- Maak C12-200 ioniseerbare lipiden-, helperlipide-, cholesterol- en lipide-verankerde PEG-voorraadoplossingen door elk lipide op te lossen in 100% ethanol. De concentraties van de lipidecomponenten zijn gedetailleerd in tabel 1.
- Verwarm en meng de stockoplossingen bij 37 °C om ervoor te zorgen dat ze volledig zijn opgelost.
2. Bereiding van de lipide- en nucleïnezuurmengsels
- Bereken de vereiste volumes ioniseerbare lipiden, helperlipiden, cholesterol en lipide-PEG op basis van de gewenste molaire verhouding en de ioniseerbare lipide-mRNA-gewichtsverhouding (tabel 1). Bereid 10% extra volume van de organische fase voor om rekening te houden met het dode volume in de spuiten tijdens de formulering.
- Combineer de berekende volumes van de verschillende lipidecomponenten in een conische buis.
- Verdun de lipiden met 100% ethanol tot een eindvolume, V, dat 25% van het eindvolume van LNP vertegenwoordigt.
- Bereken de hoeveelheid mRNA die nodig is voor formulering op basis van de ioniseerbare lipide-mRNA-gewichtsverhouding en het totale benodigde volume mRNA-LNP (tabel 1).
- Ontdooi het vuurvliegje luciferase-coderend mRNA op ijs.
- Verdun het mRNA tot een eindvolume, 3V, driemaal het volume van de organische fase, in 10 mM citroenzuurbuffer.
OPMERKING: Elk lipidevolume, V, moet voldoende ioniseerbare lipiden bevatten voor het mRNA verdund in 3V. Dit komt overeen met de gewenste ioniseerbare lipide-mRNA-gewichtsverhouding.
3. Microfluïdische formulering van mRNA-LNP's
- Spuit een delicaat taakdoekje in met een oppervlakteontsmettingsmiddel voor RNases en DNA en veeg de binnenkant van het microfluïdische instrument grondig schoon.
- Open een nieuwe microfluïdische cartridge en plaats deze met de inlaatkanalen naar beneden en van u af gericht.
- Zorg ervoor dat de conische buisarm twee conische buizen van 15 ml vasthoudt en zich in de positie bevindt die het verst naar rechts staat.
- Configureer twee steriele conische buisjes van 15 ml op de houder met de doppen eraf.
- Vul een spuit van 5 ml met de mRNA-oplossing die mRNA bevat verdund in 10 mM citroenzuurbuffer.
- Vul een spuit van 3 ml met de lipidenoplossing die de lipiden verdund in pure 100% ethanol bevat.
- Klap de patroonhouder op het microfluïdische apparaat omhoog.
- Steek de spuit van 5 ml, zonder de naald, die mRNA bevat in de linker inlaat van de patroon.
- Steek de spuit van 3 ml, zonder naald, die lipiden bevat in de rechter inlaat van de patroon.
- Klap de patroonhouder weer naar beneden en sluit het deksel van het microfluïdische instrument.
- Schakel het microfluïdische instrument in met behulp van de schakelaar aan de achterkant van het instrument.
- Selecteer Snel uitvoeren.
- Selecteer de juiste soorten spuiten voor de ingebrachte spuiten van 5 ml en 3 ml.
- Voer de parameters voor mRNA-LNP-formulering in bij een waterige tot organische stroomverhouding van 3:1, zoals beschreven in tabel 2.
- Druk op de knop Volgende om naar het volgende scherm te gaan.
- Controleer of de juiste parameters zijn ingevoerd.
- Druk op de Start-knop om de mRNA-LNP's te formuleren.
4. Verwerking en karakterisering van de mRNA-LNP's na formulering
- Laad de mRNA-LNP's die in de rechter conische buis zijn verzameld in de eerder gehydrateerde dialysecassettes.
NOTITIE: Doorboor of beschadig het membraan van de cassette niet bij het laden van de mRNA-LNP's. Als het membraan beschadigd is, gaan mRNA-LNP's verloren bij het laden.- Plaats de dialysecassettes met de mRNA-LNP's terug in het bekerglas met 1x PBS en laat ze minimaal 2 uur dialyseren.
- Breng na de dialyse de dialysecassettes met de mRNA-LNP's in een steriele bioveiligheidskast en verwijder de mRNA-LNP's met een spuit met een naald.
- Filter de mRNA-LNP's steriel met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm en vang ze op in een steriele conische buis.
- Plaats 65 μL van de mRNA-LNP-oplossing in een microbuis van 1,5 ml voor karakteriseringsdoeleinden.
- Verdun 10 μL mRNA-LNP's 1:100 in 990 μL 1x PBS in een cuvet voor de meting van de hydrodynamische grootte en polydispersiteitsindex met behulp van dynamische lichtverstrooiing.
- Beoordeel de concentratie en inkapselingsefficiëntie van de mRNA-LNP's met behulp van een fluorescentietest (d.w.z. RiboGreen).
- Bereid een stockoplossing van 1x TE-buffer door 20x TE-buffer te verdunnen met moleculair-biologisch water.
- Bereid een stockoplossing van 1% Triton X-100 buffer door Triton X-100 te verdunnen met 1x TE-buffer.
- Bereid het fluorescerende reagens voor door de reagensvoorraad 1:200 te verdunnen met 1x TE-buffer.
- Verdun de mRNA-LNP's 1:100 in 1x TE-buffer en 1% Triton X-100-buffer in een black-wall black-bottom 96-well plaat in 100 μL.
- Maak een standaardcurve voor het lage bereik door de RNA-standaard te verdunnen volgens de instructies van de fabrikant en plak de standaardcurve in de plaat met 96 putjes.
- Voeg 100 μL verdund fluorescerend reagens toe aan elk putje dat verdund mRNA-LNP of verdunde standaard bevat.
- Plaats de plaat met 96 putjes in een plaatlezer en schud gedurende 1 minuut, gevolgd door een wachttijd van 4 minuten.
- Meet de fluorescentie-intensiteit van elk putje volgens het protocol van de fabrikant bij een excitatie/emissie van 480 nm/520 nm.
- Gebruik de standaardcurve om de fluorescentiewaarden om te rekenen naar concentraties.
- Bereken de inkapselingsefficiëntie door de waarde die wordt verkregen door het verdunnen van LNP's in TE-buffer (niet-ingekapseld mRNA) af te trekken van de waarde die wordt verkregen door het verdunnen van LNP's in 1% Triton X-100 (totaal mRNA) en te delen door de waarde die wordt verkregen door het verdunnen van LNP's in 1% Triton X-100, volgens vergelijking 4.4.
- Bereken de mRNA-LNP-concentratie die wordt gebruikt voor cel- en dierstudies door de waarde die wordt verkregen door het verdunnen van LNP's in TE-buffer (niet-ingekapseld mRNA) af te trekken van de waarde die wordt verkregen door het verdunnen van LNP's in 1% Triton X-100 (totaal mRNA).
- Meet de pKa van de mRNA-LNP's door een 6-(p-toluïdino)-2-naftaleensulfonylchloride (TNS)-test uit te voeren.
- Bereid het TNS-reagens voor door een 0,16 mM-oplossing van TNS te maken in ultrapuur water.
NOTITIE: Wanneer u het reagens gebruikt, zorg er dan voor dat u het op ijs en uit de buurt van licht bewaart om degradatie te voorkomen. - Bereid gebufferde oplossingen van 150 mM natriumchloride, 20 mM natriumfosfaat, 25 mM ammoniumcitraat en 20 mM ammoniumacetaat, aangepast aan verschillende pH-waarden variërend van 2 tot 12 in stappen van 0,5.
- Voeg 2,5 μL LNP toe aan elke pH-gecorrigeerde bufferoplossing in een zwartwandige plaat met zwarte bodem en 96 putjes.
- Voeg TNS-reagens toe aan elk putje, zodat de uiteindelijke TNS-concentratie 6 μM is.
- Incubeer de plaat met 96 putjes gedurende 5 minuten op een donkere plaats.
- Meet de fluorescentie bij een excitatie/emissie van 322 nm/431 nm met behulp van een fluorescentieplaatlezer.
- Pas de gegevens aan op een sigmoïdale curve en bereken de pKa met behulp van de aangepaste vergelijking om de pH te vinden waarbij 50% van de maximale intensiteit werd waargenomen.
- Bereid het TNS-reagens voor door een 0,16 mM-oplossing van TNS te maken in ultrapuur water.
- Representatieve resultaten voor de mRNA-LNP-hydrodynamische grootte, PDI, inkapselingsefficiëntie en pKa worden weergegeven in tabel 3.
5. In vitro transfectie van HepG2-cellen
OPMERKING: Verschillende andere cellijnen, zoals HeLa-cellen of HEK-293T-cellen, kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de transfectie-efficiëntie van LNP's in vitro. Alle cellen moeten negatief testen op mycoplasma voorafgaand aan de LNP-transfectieonderzoeken.
- Plaat 5.000 HepG2-cellen in elk putje van een witwandige plaat met 96 putjes met heldere bodem in 100 μL compleet celkweekmedium (DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine)
- Laat de cellen een nacht hechten in een gecontroleerde CO 2 -incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
- Verdun de mRNA-LNP's in een compleet celkweekmedium zodat de totale dosis in 100 μL wordt toegediend.
- Verwijder het volledige medium uit de putjes.
- Behandel de cellen met mRNA-LNP's verdund in volledig celkweekmedium in de gewenste doses of volledig medium (controle).
- Plaats de plaat met 96 putjes met de behandelde cellen gedurende 24 uur terug in de gecontroleerde CO2 -incubator.
- Beoordeel de transfectie-efficiëntie door een luciferase-test uit te voeren.
- Bereid het luciferase-reagens en 1x cellysebuffer volgens de instructies van de fabrikant.
- Haal de plaat met 96 putjes met de cellen uit de incubator en breng deze in een bioveiligheidskast.
- Verwijder het celkweekmedium uit elk putje van de plaat met 96 putjes.
- Voeg 20 μL 1x lysisbuffer toe aan elk putje, gevolgd door 100 μL van het eerder bereide luciferase-testreagens.
- Bescherm de plaat tegen licht en plaats de plaat in een plaatlezer om het bioluminescente signaal van elke put te meten.
OPMERKING: Representatieve resultaten die de behandeling van HepG2-cellen met eerder geformuleerde C12-200 mRNA-LNP's aantonen, worden weergegeven in figuur 1.
6. In vivo evaluatie van mRNA-LNP's bij muizen na injectie van de staartader
- Verdun de mRNA-LNP-oplossing met steriele 1x PBS zodat 2 μg totaal mRNA aanwezig is in een injectievolume van 100 μl staartader, wat overeenkomt met een dosis lichaamsgewicht van ongeveer 0,1 mg/kg voor een muis van 20 g.
- Houd elke muis in bedwang met behulp van een goedgekeurde methode en veeg de staart af met een pad dat is bevochtigd met 70% alcohol.
- Vul een insulinespuit van 29 G met 100 μL mRNA-LNP (2 μg) of 100 μL 1x PBS. Verwijder eventuele luchtbellen uit de spuit.
- Steek de naald met de schuine kant naar boven in de laterale staartader van de muis en injecteer langzaam de 100 μL mRNA-LNP of 1x PBS.
- Verwijder de naald en oefen druk uit totdat hemostase is bereikt.
- Bereid een voorraadoplossing van 15 mg/ml d-luciferine-kaliumzout in steriel 1x PBS 6 uur na injectie.
- Schakel het in-vivobeeldvormingssysteem (IVIS) in en open de beeldvormingssoftware.
- Druk op Initialiseren om het instrument voor te bereiden op gegevensverzameling.
- Vink het vakje naast luminescentie aan en stel de belichtingstijd in op automatisch. Zorg ervoor dat het juiste gezichtsveld is geselecteerd voor het aantal muizen dat wordt afgebeeld.
- Dien 200 μL d-luciferine intraperitoneaal (150 mg luciferine per kg lichaamsgewicht) toe aan de eerder behandelde muizen.
- Plaats de muizen in een anesthesiekamer die is ingesteld op 2,5% isofluraan en een zuurstofdebiet van 2,0 l/min.
- Wacht 10 minuten totdat het luciferase-signaal is gestabiliseerd voordat u de met mRNA-LNP behandelde muizen in beeld brengt.
- Zorg ervoor dat de muizen volledig verdoofd zijn en leid de anesthesielijn om om isofluraan toe te dienen via neuskegels in de beeldvormingskamer.
- Breng de muizen over naar de neuskegels en zorg ervoor dat ze op hun rug liggen met hun buik bloot.
- Sluit de kamerdeur en klik op de knop Verwerven in de software om bioluminescentiebeelden te verkrijgen.
OPMERKING: Representatieve resultaten voor beeldvorming van het hele lichaam van muizen na mRNA-LNP- of 1X PBS-behandeling worden weergegeven in figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mRNA-LNP's werden geformuleerd met behulp van een microfluïdisch instrument met een gemiddelde hydrodynamische diameter van 76,16 nm en een polydispersiteitsindex van 0,098. De pKa van de mRNA-LNP's bleek 5,75 te zijn door een TNS-test18 uit te voeren. De inkapselingsefficiëntie voor deze mRNA-LNP's werd berekend op 92,3% met behulp van de gemodificeerde fluorescentietest en vergelijking 4.4. De totale RNA-concentratie die werd gebruikt voor de celbehandeling en dierdosering was 40,24 ng/μL. Deze waarde werd verkregen uit de gemodificeerde fluorescentietest19, met name door de fluorescentie die werd verkregen door de LNP's te verdunnen met 1% Triton X-100 en 1x TE-buffer tot bepaalde concentraties en de hoeveelheid ingekapseld mRNA te berekenen.
Vergelijking 4.4
CTX = Concentratie van mRNA uit LNP's verdund in 1% Triton X-100
C TE = Concentratie van mRNA uit LNP's verdund in 1x TE-buffer
Toenemende bioluminescentie werd waargenomen met toenemende doses bij de behandeling van 5.000 HepG2-cellen per put met verschillende doses mRNA-LNP. Luciferase-expressie werd gemakkelijk gedetecteerd bij de laagste dosis (5 ng/put) die in dit onderzoek werd gebruikt. Andere cellijnen kunnen echter verschillende hoeveelheden mRNA-LNP nodig hebben om gemakkelijk verschillen in luminescentie tussen doses te zien.
Muizen werden behandeld met 2 μg mRNA-LNP en 6 uur later beoordeeld op bioluminescentie van het hele lichaam. Aangezien C12-200 mRNA-LNP's voornamelijk de levertransfecteren 20, werd een sterk bioluminescent signaal waargenomen in de bovenbuik van de muizen die werden behandeld met onze geformuleerde LNP's. Met behulp van de beeldvormingssoftware werden interessegebieden rond de leversignalen getekend om de totale luminescente flux te berekenen. In dit experiment was de totale lichtstroom ongeveer 5 x 109, wat consistent is met andere onderzoeken die zijn uitgevoerd met deze LNP-formulering 4,21.
Tabel 1: Organische fasesamenstelling. Concentraties van de afzonderlijke lipidevoorraadoplossingen en de volumes die elke component bijdraagt aan de organische fase van 1,3 ml worden beschreven. Lipiden worden gecombineerd met een molaire verhouding van 35/16/46,5/2,5 (C12-200:DOPE:Cholesterol:C14-PEG2000). Er werd een extra volume van 10% bereid om rekening te houden met de dode volumes van de spuit tijdens de formulering. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Microfluïdische instrumentinstellingen voor mRNA-LNP-formulering bij een waterige tot organische stroomverhouding van 3:1. De spuit van 5 ml met mRNA verdund in 10 mM citroenzuurbuffer werd in het middenkanaal ingebracht, terwijl de spuit van 3 ml met lipiden in het rechterkanaal werd ingebracht. LNP's werden geformuleerd met een gewichtsverhouding van 10:1 van ioniseerbaar lipide:mRNA. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: mRNA-LNP-karakteriseringsgegevens bepaald door dynamische lichtverstrooiing, een gemodificeerde fluorescentieassay en een 2-(p-toluïdino)naftaleen-6-sulfonzuur (TNS)-test. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Figuur 1: HepG2-cellen behandeld met vuurvliegluciferase mRNA-LNP. In totaal werden 5.000 HepG2-cellen per put gezaaid in een plaat met 96 putjes en mochten ze zich een nacht hechten. De cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine. Het celkweekmedium werd verwijderd voordat cellen werden behandeld met doses van 5 ng, 10 ng en 20 ng van een C12-200-bevattende LNP-formulering die vuurvliegluciferase-coderend mRNA inkapselt (in 100 μL celkweekmedium). 24 uur na de behandeling werd het celkweekmedium verwijderd en werd 20 μL 1x lysisbuffer aan de cellen toegevoegd voordat 100 μL luciferase-testreagens werd toegevoegd. De bioluminescentie van elk putje werd gemeten met behulp van een plaatlezer na een incubatietijd van 5 minuten. De vouwtoename wordt uitgezet ten opzichte van controleputjes die bestonden uit onbehandelde HepG2-cellen. De statistische significantie werd geëvalueerd met behulp van een eenrichtings-ANOVA met post-hoc Tukey's test. ns, niet significant; , p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: C57BL/6 muizen behandeld met firefly luciferase mRNA-LNP. In dit werk werd 2 μg totaal mRNA-LNP in 100 μL of 100 μL 1x PBS toegediend aan C57BL/6-muizen via de laterale staartader. (A) Bioluminescentie van het hele lichaam van de muizen die werden behandeld met mRNA-LNP of 1X PBS werd 6 uur na toediening gemeten met behulp van het in vivo beeldvormingssysteem (IVIS). De IVIS Spectrum Living Image-software werd gebruikt om de beelden van het hele lichaam te analyseren en te verkrijgen. N = 3. (B) De totale lichtstroom werd gekwantificeerd en uitgezet. De statistische significantie werd geëvalueerd met behulp van een tweezijdige Student's t-toets. **, p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met deze workflow kan een verscheidenheid aan mRNA-LNP's worden geformuleerd en getest op hun in vitro en in vivo efficiëntie. Ioniseerbare lipiden en hulpstoffen kunnen worden verwisseld en gecombineerd met verschillende molaire verhoudingen en verschillende ioniseerbare lipide-mRNA-gewichtsverhoudingen om mRNA-LNP's te produceren met verschillende fysisch-chemische eigenschappen22. Hier formuleerden we C12-200 mRNA-LNP's met een molaire verhouding van 35/16/46,5/2,5 (ioniseerbaar lipide:helperlipide:cholesterol:lipide-PEG) bij een gewichtsverhouding van 10:1 ioniseerbaar lipide tot mRNA. Deze LNP's werden getest op hun transfectie-efficiëntie in vitro in HepG2-cellen en in vivo in C57BL/6-muizen. De C12-200 mRNA-LNP's werden gesynthetiseerd door microfluïdisch mengen met behulp van een in de handel verkrijgbaar microfluïdisch instrument. Hoewel andere formuleringsmethoden kunnen worden gebruikt om LNP's te formuleren, zoals pipetmenging of T-junctiemenging 4, formuleert microfluïdisch mengen mRNA-LNP's die over het algemeen kleiner zijn, minder polydispersief en een hogere inkapselingsefficiëntie hebben 4,13,23,24.
De formulering van mRNA-LNP's met het in de handel verkrijgbare microfluïdische instrument maakt de eenvoudige en flexibele formulering van LNP's mogelijk. Het debiet aan het begin van een run varieert van het ingestelde doeldebiet wanneer de spuitduwers op volle snelheid accelereren. Dit kan leiden tot variabele deeltjeseigenschappen en inconsistente resultaten. Om dit te ondervangen, is het microfluïdische instrument ontworpen om de LNP's die aan het begin en einde van een formulering zijn geformuleerd, als afval te verzamelen, gescheiden van de LNP's die zijn geformuleerd onder stationaire omstandigheden. Dit kan de polydispersiteit verminderen en leiden tot meer consistente deeltjeseigenschappen. Het startafval kan worden berekend op basis van de combinatie van spuiten die wordt gebruikt voor de formulering volgens de handleiding van de fabrikant. Het eindafval ervaart echter niet dezelfde mate van niet-steady-state flow-omstandigheden, dus het volume wordt vaak ingesteld op 0,05 ml voor alle spuitcombinaties volgens de aanbeveling van de fabrikant.
Het is van cruciaal belang om rekening te houden met het dode volume in spuiten en buisjes bij het bereiden van de juiste volumes van de organische en waterige fasen. Het voorbereiden van 10% extra volume van elke fase zorgt ervoor dat het minimale gewenste volume LNP kan worden geformuleerd. In dit protocol werd een totaal formuleringsvolume van 4,7 ml ingevoerd met 0,7 ml afval, wat resulteerde in 4 ml LNP verzameld in steady-state omstandigheden. Er werd echter 1,3 ml van de organische fase en 3,9 ml van de waterige fase bereid voor formulering. Dit zorgt ervoor dat de spuit van 5 ml tot de 3,6 ml-markering kan worden gevuld en de spuit van 3 ml tot de 1,2 ml-markering. Als het volume de markeringen op de spuiten bereikt, zijn de volumespecificaties die op het microfluïdische instrument worden gebruikt, veilige invoer. Het laatste scherm voordat u op de "START"-knop drukt, is cruciaal om ervoor te zorgen dat alle parameters correct zijn. Het is belangrijk om een laatste controle uit te voeren op de soorten spuiten, de volumes in de spuiten, de te doseren volumes, de plaatsing van de spuit en de stroomsnelheden.
Na de formulering van mRNA-LNP's heeft de dialysestap een paar belangrijke overwegingen om in gedachten te houden. De gebruikte dialysecassettes hebben een minimale hydratatietijd van 2 minuten nodig voordat de LNP's kunnen worden geladen. Dit verhoogt de flexibiliteit van het membraan en zorgt ervoor dat het membraan zich gemakkelijker kan aanpassen naarmate het monster wordt toegevoegd. Bovendien moet ervoor worden gezorgd dat de membranen van de dialysecassettes niet worden beschadigd of doorboord terwijl ze met mRNA-LNP's worden geladen. Als de membranen worden doorboord of beschadigd, kunnen de geformuleerde mRNA-LNP's gemakkelijk verloren gaan bij belasting.
In dit protocol hebben we de in vitro efficiëntie van mRNA-LNP's in HepG2-cellen getest. Andere celtypen kunnen echter worden getest op mRNA-LNP-transfectie-efficiëntie. Als niet-klevende cellen worden gebruikt, moet de plaat met 96 putjes gedurende 5 minuten worden gecentrifugeerd bij 500 g voordat het celkweekmediumwordt verwijderd 25. Dit minimaliseert het verlies van cellen tijdens de verwijdering van het medium. De cellen moeten ook worden getest op de aanwezigheid van mycoplasma voorafgaand aan LNP-transfectieonderzoek. Het zal moeilijk zijn om consistente resultaten te verkrijgen en verschillende LNP-formuleringen te vergelijken als de cellen positief testen op mycoplasma. Bovendien kunnen primaire cellen hogere doses LNP nodig hebben om transfectie zonder toxiciteit te meten in vergelijking met cellijnen. Een op luciferase gebaseerde levensvatbaarheidstest kan worden gebruikt om de mRNA-LNP-toxiciteit in vitro te evalueren bij verschillende doses in zowel primaire cellen als cellijnen18.
Een van de belangrijkste stappen bij het verkrijgen van consistente bioluminescentiemetingen bij verschillende muizen na behandeling met dezelfde mRNA-LNP-formulering is ervoor te zorgen dat de tijd tussen de intraperitoneale injectie van d-luciferine en de IVIS-meting consistent is26. Dit tijdsinterval beïnvloedt de stabiliteit van het verkregen bioluminescente signaal. Het tijdsinterval moet lang genoeg zijn om eventuele fluctuaties in het signaal tot een minimum te beperken. Er kan een voorbereidend experiment worden uitgevoerd waarbij de muizen elke minuut na de d-luciferine-injectie in beeld worden gebracht. Het tijdsinterval waarin het signaal begint af te vlakken, is het meest geschikt voor het transfectie-experiment. In dit protocol zorgde een interval van 10 minuten voor stabiele luminescentiesignalen na de injectie van 150 mg d-luciferine/kg lichaamsgewicht, die gewoonlijk wordt uitgevoerd voor beeldvorming27,28.
Bovendien is de mRNA-LNP-dosis die in dit protocol wordt gebruikt (0,1 mg mRNA/kg lichaamsgewicht) klein in vergelijking met de doses die worden gebruikt om de toxiciteit en therapeutische werkzaamheid te beoordelen29,30. Deze kleinere doses helpen bij het evalueren van verschillen in de potentie van unieke mRNA-LNP-formuleringen, zonder het verkregen luminescente signaal te oververzadigen. Deze dosis kan echter worden verhoogd om de potentiële mRNA-LNP-toxiciteit te meten. Levertoxiciteit kan bijvoorbeeld worden geëvalueerd door de niveaus van alaninetransaminase, aspartaattransaminase en alkalische fosfatase in het serum op verschillende tijdstippen na mRNA-LNP-injectie31,32,33 te kwantificeren. Deze enzymen worden normaal gesproken in lage concentraties in het serum aangetroffen, maar zijn verhoogd als gevolg van leverschade. In de handel verkrijgbare kits kunnen worden gebruikt om de hoeveelheid van deze enzymen in het serum te kwantificeren.
In dit voorbeeld gebruikten we firefly luciferase-coderend mRNA, maar andere reporter-mRNA's kunnen worden geformuleerd in LNP's om de potentie te beoordelen. mRNA's die coderen voor groen fluorescerend eiwit (GFP) of mCherry kunnen worden gebruikt om celspecifieke afgifte na mRNA-LNP-behandeling te onderzoeken34,35. Een eencellige suspensie kan worden geproduceerd uit weefsels van belang, en GFP+- of mCherry+-cellen kunnen worden beoordeeld door middel van flowcytometrie-analyse. Bovendien kunnen mRNA-LNP's worden geformuleerd met mRNA dat codeert voor erytropoëtine om levertransfectie te meten door de secretie van erytropoëtine in het serum 8,36,37. In Ai9-muizen induceert de afgifte van mRNA dat codeert voor Cre-recombinase robuuste tdTomato-fluorescentie, die kan dienen als een andere methode om de afgifte van mRNA-LNP aan verschillende celpopulaties te onderzoeken38,39,40. Door de demonstratie van deze workflow hopen we dat mRNA-LNP-formulering niet langer een barrière vormt voor onderzoekers bij het verkennen van nieuwe ideeën en mogelijkheden voor mRNA-therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
M.J.M. erkent de steun van een Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) Director's New Innovator Award (DP2 TR002776), een Burroughs Wellcome Fund Career Award bij de Scientific Interface (CASI), een US National Science Foundation CAREER Award (CBET-2145491) en aanvullende financiering van de National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 en NIDDK R01 DK123049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
