Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בדיקת יעילות In Vitro ו-In Vivo של ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64810
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

Summary

כאן מוצג פרוטוקול לניסוח ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) המכילים mRNA המקודד לוציפראז גחלילית. LNPs אלה נבדקו על עוצמתם במבחנה בתאי HepG2 ו-in vivo בעכברי C57BL/6.

Abstract

ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) משכו תשומת לב נרחבת לאחרונה עם הפיתוח המוצלח של חיסוני mRNA לקורונה על ידי מודרנה ופייזר/ביונטק. חיסונים אלה הוכיחו את יעילותם של טיפולי mRNA-LNP ופתחו את הדלת ליישומים קליניים עתידיים. במערכות mRNA-LNP, ה-LNPs משמשים כפלטפורמות שיגור המגנות על מטען ה-mRNA מפני התפרקות על ידי נוקלאזות ומתווכות את האספקה התוך-תאית שלהם. LNPs מורכבים בדרך כלל מארבעה מרכיבים: ליפיד מיונן, פוספוליפיד, כולסטרול, ופוליאתילן גליקול מעוגן שומנים (PEG) מצומד (ליפיד PEG). כאן, LNPs העוטפים mRNA המקודד לוציפראז גחלילית מנוסחים על ידי ערבוב מיקרופלואיד של השלב האורגני המכיל רכיבי שומנים LNP והפאזה המימית המכילה mRNA. mRNA-LNPs אלה נבדקים לאחר מכן במבחנה כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה שלהם בתאי HepG2 באמצעות בדיקה מבוססת לוחות ביולומינסנטיים. בנוסף, mRNA-LNPs מוערכים in vivo בעכברי C57BL/6 לאחר הזרקה תוך ורידית דרך וריד הזנב הצידי. דימות ביולומינסנציה של כל הגוף מתבצע באמצעות מערכת הדמיה in vivo . תוצאות מייצגות מוצגות עבור מאפייני mRNA-LNP, יעילות הטרנספקציה שלהם בתאי HepG2 ושטף האור הכולל בעכברי C57BL/6.

Introduction

ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) הוכיחו הבטחה גדולה בשנים האחרונות בתחום הטיפול הגנטי שאינו ויראלי. בשנת 2018, מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר את הטיפול הראשון אי פעם בהפרעות RNA (RNAi), Onpattro by Alnylam, לטיפול בעמילואידוזיס טרנסתירטין תורשתי 1,2,3,4. זה היה צעד חשוב קדימה עבור ננו-חלקיקי שומנים וטיפולים מבוססי RNA. לאחרונה, מודרנה ופייזר/ביונטק קיבלו אישורי FDA לחיסוני mRNA-LNP שלהם נגד SARS-CoV-2 4,5. בכל אחד מטיפולי חומצות הגרעין מבוססי LNP, LNP משמש להגנה על המטען שלו מפני פירוק על ידי נוקלאזות ולהקל על משלוח תוך-תאי חזק 6,7. בעוד LNPs ראו הצלחה בטיפולי RNAi ויישומי חיסונים, mRNA-LNPs נחקרו גם לשימוש בטיפולים תחליפי חלבונים8, כמו גם להעברה משותפת של Cas9 mRNA ומנחה RNA להעברת מערכת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים9. עם זאת, אין נוסחה ספציפית אחת המתאימה היטב לכל היישומים, ושינויים עדינים בפרמטרים של נוסחת LNP יכולים להשפיע מאוד על העוצמה וההפצה הביולוגית in vivo 8,10,11. לפיכך, יש לפתח ולהעריך mRNA-LNPs בודדים כדי לקבוע את הנוסחה האופטימלית עבור כל טיפול מבוסס LNP.

LNPs מנוסחים בדרך כלל עם ארבעה רכיבי שומנים: ליפיד מיונן, פוספוליפיד, כולסטרול ופוליאתילן-גליקול מעוגן שומנים (PEG) מצומד (ליפיד PEG)11,12,13. ההעברה התוך-תאית רבת העוצמה המתאפשרת על ידי LNPs מסתמכת, בחלקה, על רכיב השומנים המיוננים12. מרכיב זה הוא נייטרלי ב- pH פיזיולוגי אך הופך להיות טעון חיובי בסביבה החומצית של אנדוזום11. שינוי זה במטען היוני נחשב כתורם מרכזי לבריחה אנדוזומלית12,14,15. בנוסף לשומנים המיוננים, מרכיב הפוספוליפידים (ליפיד עוזר) משפר את האנקפסולציה של המטען ומסייע בבריחה אנדוזומלית, הכולסטרול מציע יציבות ומשפר את איחוי הממברנה, והליפידים-PEG ממזער צבירה ואופסוניזציה של LNP במחזורהדם 10,11,14,16. כדי לגבש את LNP, רכיבי שומנים אלה משולבים בפאזה אורגנית, בדרך כלל אתנול, ומעורבבים עם פאזה מימית המכילה את מטען חומצת הגרעין. תהליך ניסוח LNP הוא מאוד תכליתי בכך שהוא מאפשר להחליף בקלות רכיבים שונים ולשלב אותם ביחסים מולאריים שונים על מנת לגבש נוסחאות LNP רבות עם שפע של תכונות פיסיקוכימיות10,17. עם זאת, כאשר בוחנים מגוון עצום זה של LNPs, חיוני שכל ניסוח יוערך באמצעות הליך סטנדרטי כדי למדוד במדויק את ההבדלים באפיון ובביצועים.

כאן, זרימת העבודה המלאה עבור ניסוח של mRNA-LNPs ואת הערכת הביצועים שלהם בתאים ובבעלי חיים מתואר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: יש לשמור תמיד על תנאים נטולי RNase בעת גיבוש mRNA-LNPs על ידי ניגוב המשטחים והציוד עם מזהם פני השטח עבור RNases ו- DNA. השתמש רק טיפים וריאגנטים ללא RNase.

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת פנסילבניה ולפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת פנסילבניה.

1. הכנה מוקדמת לפורמולציה

  1. מלאו נקייה בנפח 4 ליטר במי מלח טריים חוצצים בפוספט (PBS) בנפח 200-300 מ"ל.
    1. דללו את 10x PBS בכד פי 10 עם מים טהורים במיוחד כדי לקבל של 1x PBS. ודא שהנפח הסופי של PBS 1x הוא בין 2-3 ליטר.
    2. הניחו את קלטות הדיאליזה (חיתוך משקל מולקולרי של 20 kDa [MWCO]) בעלות הקיבולת המתאימה לפורמולציית LNP לתוך הכד הממולא כדי ללחלח אותן.
      הערה: קלטות דיאליזה דורשות מינימום של 2 דקות כדי להתייבש לפני השימוש.
    3. מניחים מוט ערבוב לתוך הכד, ומכסים את הכד ברדיד אלומיניום.
    4. הניחו את הכד המכוסה על צלחת ערבוב מגנטית. הפעל את צלחת הערבוב, והגדר אותו להסתובב ב 300-400 סל"ד.
  2. יש לדלל מאגר של 100 mM חומצת לימון (pH 3) פי 10 במים טהורים במיוחד כדי ליצור את מאגר חומצת הלימון של 10 mM המשמש לדילול mRNA.
  3. הפוך C12-200 שומנים מיוננים, שומנים עוזרים, כולסטרול ושומנים מעוגני שומנים PEG (ליפידים-PEG) על ידי המסת כל ליפיד באתנול 100%. ריכוזי מרכיבי השומנים מפורטים בטבלה 1.
    1. חממו וערבבו את תמיסות המלאי בטמפרטורה של 37°C כדי להבטיח שהן מומסות במלואן.

2. הכנת תערובות שומנים וחומצות גרעין

  1. חשב את הנפחים הנדרשים של שומנים מיוננים, שומנים מסייעים, כולסטרול וליפיד-PEG בהתבסס על היחס המולרי הרצוי ויחס משקל השומנים המיוננים ל-mRNA (טבלה 1). הכינו 10% נפח נוסף של השלב האורגני כדי להתחשב בנפח מת במזרקים במהלך הפורמולה.
    1. שלב את הכרכים המחושבים של רכיבי השומנים השונים בצינור חרוט.
    2. לדלל את השומנים עם 100% אתנול עד נפח סופי, V, המייצג 25% מהנפח הסופי של LNP.
  2. חשב את כמות ה-mRNA הנדרשת לניסוח בהתבסס על יחס משקל השומנים המיוננים ל-mRNA והנפח הכולל של mRNA-LNP הדרוש (טבלה 1).
    1. הפשירו את ה-mRNA המקודד לוציפראז על קרח.
    2. מדללים את ה-mRNA לנפח סופי, 3וולט, פי שלושה מנפח הפאזה האורגנית, במאגר חומצה ציטרית של 10 מילימול.
      הערה: כל נפח שומנים, V, חייב להכיל מספיק שומנים מיוננים עבור mRNA מדולל ב 3V. זה מתאים ליחס השומנים המיוננים הרצוי למשקל mRNA.

3. ניסוח מיקרופלואידי של mRNA-LNPs

  1. רססו מגבון משימה עדין עם מזהם פני השטח עבור RNases ו- DNA, ונגבו היטב את פנים המכשיר המיקרופלואידי.
    1. פתח מחסנית מיקרופלואידית חדשה והכנס אותה כאשר תעלות הכניסה פונות כלפי מטה והחוצה.
    2. ודא שזרוע הצינור החרוטי מחזיקה שני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל ונמצאת במיקום הרחוק ביותר מימין.
    3. הגדר שני צינורות חרוטיים סטריליים של 15 מ"ל על המחזיק כשהמכסים כבויים.
  2. מלאו מזרק 5 מ"ל בתמיסת mRNA המכילה mRNA מדולל במאגר חומצת לימון 10 mM.
    1. ממלאים מזרק 3 מ"ל בתמיסת השומנים המכילה את השומנים המדוללים באתנול טהור 100%.
    2. הפוך את מחזיק המחסנית במכשיר המיקרופלואידי.
    3. הכנס את מזרק 5 מ"ל, ללא המחט, המכיל mRNA לתוך הכניסה השמאלית של המחסנית.
    4. הכנס את מזרק 3 מ"ל, ללא המחט, המכיל שומנים לתוך הכניסה הימנית של המחסנית.
    5. הפוך את מחזיק המחסנית בחזרה כלפי מטה, וסגור את מכסה המכשיר המיקרופלואידי.
  3. הפעל את המכשיר המיקרופלואידי באמצעות המתג הממוקם בגב המכשיר.
    1. בחר הפעלה מהירה.
    2. בחר את סוגי המזרקים הנכונים עבור מזרקים 5 מ"ל ו -3 מ"ל שהוכנסו.
    3. הזן את הפרמטרים עבור ניסוח mRNA-LNP ביחס קצב זרימה מימי לאורגני של 3:1 כמתואר בטבלה 2.
    4. לחץ על הלחצן הבא כדי לעבור למסך הבא.
    5. ודא שהפרמטרים הנכונים הוזנו.
    6. לחץ על לחצן התחל כדי לנסח את mRNA-LNPs.

4. עיבוד ואפיון לאחר ניסוח של mRNA-LNPs

  1. טען את mRNA-LNPs שנאספו בצינור החרוטי הימני לתוך קלטות דיאליזה hydrated בעבר.
    הערה: אין לנקב או לפגוע בקרום הקלטת בעת טעינת mRNA-LNPs. אם הממברנה ניזוקה, mRNA-LNPs יאבדו בעת הטעינה.
    1. הניחו את קלטות הדיאליזה המכילות את ה-mRNA-LNPs בחזרה לתוך הכד המכיל PBS 1x, והניחו אותן לדיאליזה למשך שעתיים לפחות.
    2. לאחר הדיאליזה, הביאו את קלטות הדיאליזה המכילות את ה-mRNA-LNPs לארון בטיחות ביולוגי סטרילי, והוציאו את ה-mRNA-LNPs באמצעות מזרק עם מחט.
    3. מסננים סטריליים את ה-mRNA-LNPs באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר, ואוספים אותם בצינור חרוטי סטרילי.
    4. מניחים 65 μL של תמיסת mRNA-LNP לתוך מיקרו-צינור 1.5 מ"ל למטרות אפיון.
  2. לדלל 10 μL של mRNA-LNPs 1:100 ב 990 μL של 1x PBS בקובט למדידת גודל הידרודינמי ואינדקס polydispersity באמצעות פיזור אור דינמי.
  3. להעריך את יעילות הריכוז והאנקפסולציה של mRNA-LNPs באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות (כלומר, RiboGreen).
    1. הכינו תמיסת מלאי של 1x TE buffer על ידי דילול חיץ TE 20x עם מים ביולוגיים מולקולריים.
    2. הכן תמיסת מלאי של 1% מאגר Triton X-100 על ידי דילול Triton X-100 עם מאגר TE אחד.
    3. הכן את מגיב פלואורסצנטי על ידי דילול מלאי מגיב 1:200 עם 1x TE buffer.
    4. לדלל את mRNA-LNPs 1:100 ב 1x TE חיץ 1% 1% Triton X-100 בלוח שחור דופן 96 באר ב 100 μL.
    5. הכינו עקומת תקן לטווח נמוך על ידי דילול תקן הרנ"א בהתאם להוראות היצרן, ולוחמו את העקומה הסטנדרטית בלוח 96 הקידוחים.
    6. הוסף 100 μL של מגיב פלואורסצנטי מדולל לכל באר המכילה mRNA-LNP מדולל או תקן מדולל.
    7. מניחים את הצלחת בת 96 הבארות בתוך קורא צלחות, ומנערים במשך דקה, ולאחר מכן 4 דקות המתנה.
    8. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל באר בהתאם לפרוטוקול היצרן בעירור/פליטה של 480 ננומטר/520 ננומטר.
  4. השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי להמיר את ערכי הפלואורסצנטיות לריכוזים.
    1. חישוב יעילות האנקפסולציה על ידי הפחתת הערך המתקבל מדילול LNPs במאגר TE (mRNA unencapsulated) מהערך המתקבל מדילול LNPs ב-1% Triton X-100 (סה"כ mRNA) וחלוקה בערך המתקבל מדילול LNPs ב-1% Triton X-100, על פי משוואה 4.4.
    2. חשב את ריכוז mRNA-LNP המשמש למחקרים בתאים ובבעלי חיים על ידי הפחתת הערך המתקבל מדילול LNPs במאגר TE (mRNA unencapsulated) מהערך המתקבל מדילול LNPs ב- 1% Triton X-100 (סך mRNA).
  5. למדוד את pKa של mRNA-LNPs על ידי ביצוע 6-(p-toluidino)-2-naphthalenesulfonyl כלוריד (TNS) בדיקה.
    1. הכן את מגיב TNS על ידי יצירת תמיסה של 0.16 מילימטר של TNS במים טהורים במיוחד.
      הערה: בעת השימוש בריאגנטים, הקפד לשמור אותו על קרח והרחק מאור כדי למנוע התפרקות.
    2. הכינו תמיסות חוצצות של 150 מ"מ נתרן כלורי, 20 מ"מ נתרן פוספט, 25 מ"מ אמוניום ציטראט ו-20 מ"מ אמוניום אצטט המותאמות לערכי pH שונים הנעים בין 2 ל-12 במרווחים של 0.5.
    3. הוסף 2.5 μL של LNP לכל תמיסת חיץ מותאמת pH בלוח שחור עם תחתית של 96 בארות.
    4. הוסף מגיב TNS לכל באר כך שהריכוז הסופי של TNS הוא 6 מיקרומטר.
    5. דוגרים על הצלחת בת 96 הבארות במקום חשוך למשך 5 דקות.
    6. מדוד את הפלואורסצנטיות בעירור/פליטה של 322 ננומטר/431 ננומטר באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים.
    7. התאימו את הנתונים לעקומה סיגמואידית, וחשבו את pKa באמצעות המשוואה המותאמת כדי למצוא את ה- pH שבו נצפתה 50% מהעוצמה המקסימלית.
  6. תוצאות מייצגות עבור גודל הידרודינמי mRNA-LNP, PDI, יעילות אנקפסולציה ו-pKa מוצגות בטבלה 3.

5. טרנספקציה חוץ גופית של תאי HepG2

הערה: קווי תאים שונים אחרים, כגון תאי HeLa או תאי HEK-293T, עשויים לשמש להערכת יעילות הטרנספקציה של LNPs במבחנה. כל התאים צריכים לבדוק שלילי עבור mycoplasma לפני מחקרי טרנספקציה LNP.

  1. צלחת 5,000 תאי HepG2 בכל באר של צלחת בעלת דופן לבנה בעלת תחתית שקופה של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים שלם (DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין)
    1. השאירו את התאים להיצמד למשך הלילה באינקובטור CO 2 מבוקר בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
  2. לדלל את mRNA-LNPs בתווך תרבית תאים מלאה, כך המינון הכולל מועבר ב 100 μL.
    1. הסר את המדיום המלא מהבארות.
    2. טפל בתאים עם mRNA-LNPs מדוללים בתווך תרבית תאים מלאה במינונים הרצויים או בתווך מלא (בקרה).
    3. הניחו את צלחת 96 הקידוחים המכילה את התאים המטופלים בחזרה לאינקובטור CO2 המבוקר למשך 24 שעות.
  3. להעריך את יעילות transfection על ידי ביצוע בדיקת luciferase.
    1. הכן את מגיב luciferase ואת 1x תא lysis buffer בהתאם להוראות היצרן.
    2. הוציאו את צלחת 96 הקידוחים המכילה את התאים מהאינקובטור, והכניסו אותה לארון בטיחות ביולוגית.
    3. הסר את מדיום תרבית התאים מכל באר של צלחת 96 בארות.
    4. הוסף 20 μL של חיץ ליזיס 1x לכל באר, ואחריו 100 μL של מגיב הבדיקה luciferase שהוכן בעבר.
    5. הגן על הצלחת מפני אור, והנח את הצלחת בקורא לוחות כדי למדוד את האות הביו-לומינסנטי של כל באר.
      הערה: תוצאות מייצגות המדגימות את הטיפול בתאי HepG2 עם C12-200 mRNA-LNPs שנוסחו בעבר מוצגות באיור 1.

6. הערכה In vivo של mRNA-LNPs בעכברים לאחר הזרקת וריד הזנב

  1. לדלל את תמיסת mRNA-LNP עם PBS סטרילי 1x כך 2 מיקרוגרם של mRNA הכולל נמצא בנפח הזרקת 100 μL ורידי זנב, אשר מתאים למינון משקל גוף של כ 0.1 מ"ג / ק"ג עבור עכבר 20 גרם.
  2. יש לרסן כל עכבר בשיטה מאושרת, ולנגב את הזנב עם פד טבול ב-70% אלכוהול.
    1. מלא מזרק אינסולין 29 גרם עם 100 μL של mRNA-LNP (2 מיקרוגרם) או 100 μL של 1x PBS. הסר את כל הבועות מהמזרק.
    2. הכנס את המחט עם השיפוע הפונה כלפי מעלה לתוך וריד הזנב הצידי של העכבר, והזריק לאט את 100 μL של mRNA-LNP או 1x PBS.
    3. הסר את המחט ולהפעיל לחץ עד hemostasis מושגת.
  3. הכינו תמיסת ציר של 15 מ"ג/מ"ל מלח אשלגן d-luciferin ב-PBS סטרילי 1x 6 שעות לאחר ההזרקה.
    1. הפעל את מערכת ההדמיה in vivo (IVIS) ופתח את תוכנת ההדמיה.
    2. הקש Initialize כדי להכין את המכשיר לרכישת נתונים.
    3. סמן את התיבה לצד עוצמת האור והגדר את זמן החשיפה לאוטומטי. ודא שנבחר שדה הראייה הנכון למספר העכברים המצולמים.
    4. מתן 200 μL של d-luciferin intraperitoneally (150 מ"ג של luciferin לכל ק"ג משקל גוף) לעכברים שטופלו בעבר.
    5. הכניסו את העכברים לתא הרדמה המוגדר ל-2.5% איזופלורן וקצב זרימת חמצן של 2.0 ליטר/דקה.
    6. המתינו 10 דקות עד שאות הלוציפראז יתייצב לפני הדמיה של עכברים שטופלו ב-mRNA-LNP.
    7. ודא שהעכברים מורדמים לחלוטין, והפנה את קו ההרדמה למתן איזופלורן דרך חרוטי אף בתוך תא ההדמיה.
    8. העבירו את העכברים לקונוסים באף, וודאו שהם על הגב כשהבטן חשופה.
    9. סגור את דלת התא ולחץ על הלחצן Purchase בתוכנה כדי לקבל תמונות bioluminescence.
      הערה: תוצאות מייצגות עבור הדמיית כל הגוף של עכבר לאחר טיפול mRNA-LNP או 1X PBS מוצגות באיור 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

mRNA-LNPs נוסחו באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל קוטר הידרודינמי ממוצע של 76.16 ננומטר ומדד פיזור של 0.098. pKa של mRNA-LNPs נמצא 5.75 על ידי ביצוע בדיקת TNS18. יעילות האנקפסולציה עבור mRNA-LNPs אלה חושבה להיות 92.3% באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות שונה ומשוואה 4.4. ריכוז הרנ"א הכולל ששימש לטיפול בתאים ולמינון בבעלי חיים היה 40.24 ננוגרם/מיקרוליטר. ערך זה התקבל מבדיקת הפלואורסצנטיות המתוקנת 19, במיוחד מהמרת הפלואורסצנטיות המתקבלת על ידי דילול ה- LNPs עם 1% Triton X-100 ו-1x TE buffer לריכוזים מסוימים וחישוב כמות ה- mRNA העטוף.

משוואה 4.4

Equation 1

CTX = ריכוז mRNA מ-LNPs מדולל ב-1% Triton X-100

C TE = ריכוז mRNA מ-LNPs מדוללים ב-1x TE buffer

הגדלת bioluminescence נצפתה עם מינונים הולכים וגדלים עם הטיפול של 5,000 תאי HepG2 לכל באר עם מינונים שונים של mRNA-LNP. ביטוי לוציפראז זוהה בקלות במינון הנמוך ביותר (5 ננוגרם/באר) ששימש במחקר זה. עם זאת, קווי תאים אחרים עשויים לדרוש כמויות שונות של mRNA-LNP כדי לראות בקלות הבדלים באור בין מינונים.

עכברים טופלו ב-2 מיקרוגרם של mRNA-LNP והוערכו כעבור 6 שעות עבור ביולומינסנציה של כל הגוף. מכיוון ש-C12-200 mRNA-LNPs מדביקים בעיקר את הכבד20, נצפה אות ביולומינסנטי חזק בבטן העליונה של העכברים שטופלו ב-LNPs שנוסחו. באמצעות תוכנת ההדמיה, אזורים מעניינים נמשכו סביב אותות הכבד כדי לחשב את שטף האור הכולל. בניסוי זה, שטף האור הכולל היה בערך 5 x 109, אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים שנערכו עם ניסוח LNPזה 4,21.

טבלה 1: הרכב פאזה אורגני. מתוארים ריכוזי תמיסות מלאי השומנים הבודדות והנפחים שכל רכיב תורם לשלב האורגני של 1.3 מ"ל. שומנים משולבים ביחס מולארי של 35/16/46.5/2.5 (C12-200:DOPE:כולסטרול:C14-PEG2000). נפח נוסף של 10% הוכן כדי לקחת בחשבון נפחים מתים של מזרקים במהלך הפורמולה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: הגדרות מכשיר מיקרופלואידי עבור ניסוח mRNA-LNP ביחס קצב זרימה מימי לאורגני של 3:1. מזרק 5 מ"ל המכיל mRNA מדולל בחיץ חומצת לימון 10 מ"ל הוכנס לתעלה המרכזית, ואילו מזרק 3 מ"ל המכיל שומנים הוכנס לתעלה הימנית. LNPs נוסחו ביחס משקל של 10:1 של שומנים מיוננים:mRNA. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: נתוני אפיון mRNA-LNP שנקבעו על ידי פיזור אור דינמי, בדיקה פלואורסצנטית שונה ובדיקת 2-(p-toluidino) naphthalene-6-sulfonic acid (TNS). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Figure 1
איור 1: תאי HepG2 שטופלו ב-mRNA mRNA-LNP של הגחלילית. בסך הכל, 5,000 תאי HepG2 נזרעו לכל באר בצלחת של 96 בארות והורשו להיצמד בן לילה. התאים גודלו בתרבית DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. מדיום תרבית התאים הוסר לפני שהתאים טופלו במינונים של 5 ננוגרם, 10 ננוגרם ו-20 ננוגרם של פורמולציית LNP המכילה C12-200 המקפלת mRNA מקודד גחליליות לוציפראז (ב-100 מיקרוליטר של תווך תרבית תאים). לאחר 24 שעות הטיפול, מדיום תרבית התאים הוסר, ו 20 μL של חיץ ליזה 1x נוסף על התאים לפני תוספת של 100 μL של מגיב בדיקת luciferase. הביולומינסנציה מכל באר נמדדה באמצעות קורא לוחות לאחר תקופת דגירה של 5 דקות. עליות הקיפול מתוכננות ביחס לבארות בקרה שהורכבו מתאי HepG2 לא מטופלים. המובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן Tukey פוסט-הוק. NS, לא משמעותי; עמ' < 0.0001., אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עכברי C57BL/6 שטופלו ב-mRNA-LNP של גחלילית. בעבודה זו, 2 מיקרוגרם של mRNA-LNP כולל ב-100 μL או 100 μL של 1x PBS ניתנו לעכברי C57BL/6 דרך וריד הזנב הצידי. (A) ביולומינסנציה של כל הגוף של עכברים שטופלו ב-mRNA-LNP או ב-1X PBS נמדדה באמצעות מערכת הדמיה in vivo (IVIS) 6 שעות לאחר מתן התרופה. תוכנת IVIS Spectrum Living Image שימשה לניתוח ורכישה של תמונות הגוף כולו. N = 3. (B) שטף האור הכולל כומת ושורטט. המובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט. **, עמ' < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באמצעות תהליך עבודה זה, ניתן לגבש ולבדוק מגוון של mRNA-LNPs עבור יעילות in vitro ו- in vivo שלהם. ניתן להחליף ולשלב ליפידים וחומרים פעילים מיוננים ביחסים מולאריים שונים וביחסי משקל שונים בין ליפידים מיוננים ל-mRNA כדי לייצר mRNA-LNPs בעלי תכונות פיסיקוכימיות שונות22. כאן, יצרנו C12-200 mRNA-LNPs עם יחס מולארי של 35/16/46.5/2.5 (ליפיד מיונן:עוזר שומנים:כולסטרול:שומנים-PEG) ביחס משקל של 10:1 ליפיד ל-mRNA. LNPs אלה נבדקו על יעילות הטרנספקציה שלהם במבחנה בתאי HepG2 ו-in vivo בעכברי C57BL/6. C12-200 mRNA-LNPs סונתזו על ידי ערבוב מיקרופלואידי באמצעות מכשיר מיקרופלואידי זמין מסחרית. למרות שניתן להשתמש בשיטות ניסוח אחרות כדי לנסח LNPs, כגון ערבוב פיפטה או ערבוב צומת T 4, ערבוב מיקרופלואידי מנסח mRNA-LNPs שהם בדרך כלל קטנים יותר, פחות polydisperse, ויש להם יעילות אנקפסולציה גבוהה יותר 4,13,23,24.

הניסוח של mRNA-LNPs עם המכשיר המיקרופלואידי הזמין מסחרית מאפשר ניסוח פשוט וגמיש של LNPs. קצב הזרימה בתחילת הריצה משתנה מקצב זרימת היעד שנקבע כאשר דוחפי המזרקים מאיצים למהירות מלאה. זה יכול להוביל למאפייני חלקיקים משתנים ולתוצאות לא עקביות. כדי להתגבר על כך, המכשיר המיקרופלואידי תוכנן לאסוף את ה-LNPs שנוסחו בתחילת ובסוף הפורמולציה כפסולת בנפרד מה-LNPs שנוסחו בתנאי מצב יציב. זה יכול להקטין את הפיזור הפולי-פיזור ולהוביל לתכונות חלקיקים עקביות יותר. ניתן לחשב את פסולת ההתחלה על בסיס שילוב של מזרקים המשמשים לפורמולציה לפי מדריך היצרן. עם זאת, הפסולת הסופית אינה חווה את אותה מידה של תנאי זרימה שאינם במצב יציב, ולכן הנפח מוגדר לעתים קרובות ל -0.05 מ"ל עבור כל שילובי המזרקים בהתאם להמלצת היצרן.

חשוב לקחת בחשבון נפח מת במזרקים ובצינורות בעת הכנת הנפחים הנכונים של הפאזה האורגנית והמימית. הכנת נפח נוסף של 10% מכל שלב מבטיחה שניתן יהיה לגבש את הנפח המינימלי הרצוי של LNP. בפרוטוקול זה, נפח פורמולציה כולל של 4.7 מ"ל הוזן עם 0.7 מ"ל של פסולת, וכתוצאה מכך 4 מ"ל של LNP נאספו בתנאי מצב יציב. עם זאת, 1.3 מ"ל של השלב האורגני ו -3.9 מ"ל של השלב המימי הוכנו לניסוח. זה מבטיח כי מזרק 5 מ"ל ניתן למלא עד סימן 3.6 מ"ל ואת מזרק 3 מ"ל ניתן למלא עד 1.2 מ"ל סימן. אם נפח מגיע סימנים על מזרקים, אז מפרט נפח בשימוש על המכשיר microfluidic הם תשומות בטוחות. המסך הסופי לפני לחיצה על כפתור "התחל" הוא חיוני כדי להבטיח כי כל הפרמטרים נכונים. חשוב לבצע בדיקה סופית של סוגי המזרקים, הנפחים במזרקים, הנפחים שיש לחלק, מיקום המזרקים וקצבי הזרימה.

לאחר גיבוש mRNA-LNPs, לשלב הדיאליזה יש כמה שיקולים חשובים שיש לזכור. קלטות הדיאליזה המשמשות דורשות זמן הידרציה מינימלי של 2 דקות לפני שניתן לטעון את ה- LNPs. זה מגדיל את גמישות הממברנה ומאפשר לממברנה להתאים את עצמה בקלות רבה יותר עם הוספת הדגימה. בנוסף, יש להקפיד שלא לפגוע או לנקב את קרומי קלטות הדיאליזה תוך העמסתן ב-mRNA-LNPs. אם הממברנות מנוקבות או ניזוקות, ה-mRNA-LNPs המנוסחים יכולים ללכת לאיבוד בקלות בעת הטעינה.

בפרוטוקול זה, בדקנו את יעילות המבחנה של mRNA-LNPs בתאי HepG2. עם זאת, סוגי תאים אחרים יכולים להיבדק עבור יעילות transfection mRNA-LNP. אם משתמשים בתאים שאינם דבקים, הצלחת בעלת 96 הבארות דורשת צנטריפוגה ב -500 גרם למשך 5 דקות לפני כל הסרה של מדיום תרבית התא25. זה ממזער כל אובדן של תאים במהלך הסרה בינונית. התאים צריכים גם להיבדק לנוכחות מיקופלסמה לפני כל מחקרי טרנספקציה LNP. יהיה קשה להשיג תוצאות עקביות ולהשוות ניסוחים שונים של LNP אם התאים נבדקים חיוביים למיקופלסמה. בנוסף, תאים ראשוניים עשויים לדרוש מינונים גבוהים יותר של LNP כדי למדוד טרנספקציה ללא רעילות בהשוואה לקווי תאים. ניתן להשתמש בבדיקת כדאיות מבוססת לוציפראז כדי להעריך את רעילות mRNA-LNP במבחנה במינונים משתנים הן בתאים ראשוניים והן בקווי תאים18.

אחד השלבים החשובים ביותר בהשגת מדידות ביולומינסנציה עקביות בעכברים שונים לאחר טיפול באותה פורמולציה של mRNA-LNP הוא להבטיח שהזמן בין הזרקת d-luciferin לבין מדידת IVIS יהיה עקבי26. מרווח זמן זה משפיע על יציבות האות הביולומינסנטי המתקבל. מרווח הזמן צריך להיות ארוך מספיק כדי שכל תנודות האות ימוזערו. ניתן לערוך ניסוי מקדים שבו העכברים מצולמים כל דקה לאחר הזרקת d-luciferin. מרווח הזמן שבו האות מתחיל להתייצב הוא המתאים ביותר לניסוי הטרנספקציה. בפרוטוקול זה, מרווח של 10 דקות איפשר אותות לומינסנציה יציבים לאחר הזרקת משקל גוף של 150 מ"ג d-luciferin/kg, המבוצעת בדרך כלל עבור הדמיה27,28.

בנוסף, מינון mRNA-LNP המשמש בפרוטוקול זה (0.1 מ"ג mRNA / ק"ג משקל גוף) הוא קטן בהשוואה למינונים המשמשים להערכת רעילות ויעילות טיפולית29,30. מינונים קטנים אלה מסייעים להעריך את ההבדלים בעוצמות של פורמולציות mRNA-LNP ייחודיות מבלי להרוות יתר על המידה את האות הזוהר המתקבל. עם זאת, ניתן להגדיל מינון זה כדי למדוד את רעילות mRNA-LNP פוטנציאלית. לדוגמה, ניתן להעריך רעילות כבד על ידי כימות רמות אלנין טרנסמינאז, טרנסמינאז אספרטט ופוספטאז אלקליין בסרום בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת mRNA-LNP31,32,33. אנזימים אלה נמצאים בדרך כלל ברמות נמוכות בסרום, אך הם מוגברים כתוצאה מנזק לכבד. ניתן להשתמש בערכות מסחריות כדי לכמת את כמות האנזימים הללו בסרום.

בדוגמה זו, השתמשנו ב-mRNA המקודד לוציפראז של גחליליות, אולם ניתן לנסח mRNA של כתבים אחרים ל-LNPs כדי להעריך עוצמה. ניתן להשתמש ב-mRNA המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או mCherry כדי לחקור העברה ספציפית לתא לאחר טיפול mRNA-LNP34,35. תרחיף חד-תאי יכול להיות מיוצר מרקמות מעניינות, ותאי GFP+ או mCherry+ יכולים להיות מוערכים על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה. בנוסף, mRNA-LNPs יכול להיות מנוסח עם mRNA קידוד עבור אריתרופויאטין על מנת למדוד טרנספקציה בכבד באמצעות הפרשת אריתרופויאטין בסרום 8,36,37. בעכברי Ai9, העברת mRNA המקודד Cre recombinase גורמת לפלואורסצנטיות חזקה של tdTomato, אשר יכולה לשמש כשיטה נוספת לחקר העברת mRNA-LNP לאוכלוסיות תאים שונות38,39,40. באמצעות הדגמה של זרימת עבודה זו, תקוותנו היא כי ניסוח mRNA-LNP יפסיק להיות מחסום עבור חוקרים כאשר הם חוקרים רעיונות חדשים ואפשרויות עבור טיפולי mRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

M.J.M. מודה על תמיכתו של מנהל המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (NIH) פרס החדשן החדש (DP2 TR002776), פרס הקריירה של קרן Burroughs Wellcome בממשק המדעי (CASI), פרס CAREER של הקרן הלאומית למדע של ארה"ב (CBET-2145491), ומימון נוסף מהמכונים הלאומיים לבריאות (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 ו- NIDDK R01 DK123049).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Hydrochloric Acid Sigma 7647-01-0
0.22 μm Syringe Filters Genesee 25-243
1 mL BD Slip Tip Syringe BD 309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) Avanti Polar Lipids 880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) Avanti Polar Lipids 850725P
1.5 mL Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
200 proof Ethanol Decon Labs 2716
23G Needles Fisher Scientific 14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips Fisher Scientific 14-823-435
3 mL Dialysis Cassettes Thermo Scientific A52976
96 Well Black Wall Black Bottom Plate Fisher Scientific 07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface Thermo Scientific 165306
Ammonium Acetate, 1 Kilogram Research Products International  631-61-8
Ammonium Citrate dibasic SIgma 3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL BD 309646
C12-200 Ionizable Lipid Cayman Chemical 36699
C57BL/6 Mice Jackson Laboratory 000664
Cholesterol Sigma 57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU) TriLink Biotechnologies L-7202
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955129
D-Luciferin, Potassium Salt Thermo Scientific L2916
DMEM, high glucose Thermofisher Scientific 11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mL Fisher Scientific 1484132
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Hep G2 [HEPG2] ATCC HB-8065
HyPure Molecular Biology Grade Water Cytiva SH30538.03
Infinite 200 PRO Plate Reader Tecan N/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer N/A
Large Kimwipes Fisher Scientific 06-666-11D
Luciferase Assay Kit Promega E4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack Precision Nanosystems NIN0065
NanoAssemblr Ignite Instrument Precision Nanosystems NIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free Thermo Scientific AM9624
Penicillin-Streptomycin Thermofisher Scientific 15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 Teknova Q2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Scientific R11490
Reporter Lysis 5x Buffer Promega E3971
RNase Away Surface Decontaminant Thermofisher Scientific 7000TS1
Sodium Chloride Sigma 7647-14-5
Sodium Hydroxide Sigma 1310-73-2
Sodium Phosphate Sigma 7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) Sigma T9792
Triton X-100 Sigma 9036-19-5
Zetasizer Malvern Panalytical NanoZS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
  2. Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
  3. Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
  4. Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
  5. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
  6. Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
  7. Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
  8. Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
  9. Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
  10. Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
  11. El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
  12. Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
  13. Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
  14. Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
  15. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
  16. Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
  17. Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
  18. Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
  19. Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
  20. Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
  21. Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
  22. Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
  23. Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
  24. Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
  25. Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
  26. Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
  27. Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
  28. Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
  29. Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
  30. Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
  31. Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
  32. Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
  33. Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
  34. Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
  35. Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
  36. Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
  37. Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
  38. Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
  39. Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
  40. Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 191 יעילות חוץ גופית יעילות In Vivo LNPs מטען MRNA פירוק Nucleases אספקה תוך תאית ליפיד מיונן פוספוליפיד כולסטרול מצומד ליפידים-PEG לוציפראז גחליליות יעילות טרנספקציה תאי HepG2 בדיקה מבוססת צלחת ביולומינסנטית C57BL/6 עכברים הזרקה תוך ורידית וריד זנב לטרלי הדמיית ביולומינסנציה של כל הגוף מערכת הדמיה In Vivo
בדיקת יעילות <em>In Vitro</em> <em>ו-In Vivo</em> של ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El-Mayta, R., Padilla, M. S.,… More

El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing. J. Vis. Exp. (191), e64810, doi:10.3791/64810 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter