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Bioengineering

माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग द्वारा तैयार एमआरएनए-लिपिड नैनोकणों की इन विट्रो और विवो दक्षता का परीक्षण

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64810
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

Summary

यहां, लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो एमआरएनए एन्कोडिंग जुगनू लूसिफेरस को घेरता है। इन एलएनपी का परीक्षण हेपजी 2 कोशिकाओं में विट्रो में और सी 57बीएल /6 चूहों में विवो में उनकी शक्ति के लिए किया गया था।

Abstract

मॉडर्ना और फाइजर/बायोएनटेक द्वारा कोविड-19 एमआरएनए टीकों के सफल विकास के साथ लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) ने हाल ही में व्यापक ध्यान आकर्षित किया है। इन टीकों ने एमआरएनए-एलएनपी चिकित्सीय की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है और भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए दरवाजा खोला है। एमआरएनए-एलएनपी प्रणालियों में, एलएनपी डिलीवरी प्लेटफॉर्म के रूप में काम करते हैं जो एमआरएनए कार्गो को न्यूक्लियस द्वारा गिरावट से बचाते हैं और उनके इंट्रासेल्युलर वितरण को मध्यस्थ करते हैं। एलएनपी आमतौर पर चार घटकों से बने होते हैं: एक आयनीय लिपिड, एक फॉस्फोलिपिड, कोलेस्ट्रॉल, और एक लिपिड-लंगर पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) संयुग्म (लिपिड-पीईजी)। यहां, एलएनपी एनकैप्सुलेटेड एमआरएनए एन्कोडिंग जुगनू लूसिफेरस को एलएनपी लिपिड घटकों वाले कार्बनिक चरण और एमआरएनए युक्त जलीय चरण के माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण द्वारा तैयार किया जाता है। इन एमआरएनए-एलएनपी को तब बायोल्यूमिनेसेंट प्लेट-आधारित परख का उपयोग करके हेपजी 2 कोशिकाओं में उनकी अभिकर्मक दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए विट्रो में परीक्षण किया जाता है। इसके अतिरिक्त, पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद सी 57बीएल /6 चूहों में विवो में एमआरएनए-एलएनपी का मूल्यांकन किया जाता है। पूरे शरीर की बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग एक इनविवो इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके की जाती है। प्रतिनिधि परिणाम एमआरएनए-एलएनपी विशेषताओं, हेपजी 2 कोशिकाओं में उनकी अभिकर्मक दक्षता और सी 57बीएल / 6 चूहों में कुल ल्यूमिनेसेंट फ्लक्स के लिए दिखाए जाते हैं।

Introduction

लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) ने गैर-वायरल जीन थेरेपी के क्षेत्र में हाल के वर्षों में महान वादा किया है। 2018 में, यूनाइटेड स्टेट्स फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) ने वंशानुगत ट्रांसथायरेटिन एमाइलॉयडोसिस 1,2,3,4 के इलाज के लिए अल्निलम द्वारा पहली बार आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) चिकित्सीय, ऑनपैट्रो को मंजूरी दी। यह लिपिड नैनोकणों और आरएनए-आधारित उपचारों के लिए एक महत्वपूर्ण कदम था। हाल ही में, मॉडर्ना और फाइजर/बायोएनटेक को सार्स-सीओवी-2 4,5 के खिलाफ अपने एमआरएनए-एलएनपी टीकों के लिए एफडीए की मंजूरी मिली है। इन एलएनपी-आधारित न्यूक्लिक एसिड उपचारों में से प्रत्येक में, एलएनपी अपने कार्गो को न्यूक्लियस द्वारा गिरावट से बचाने और शक्तिशाली इंट्रासेल्युलर डिलीवरी 6,7 की सुविधा प्रदान करने के लिए कार्य करता है। जबकि एलएनपी ने आरएनएआई उपचारों और वैक्सीन अनुप्रयोगों में सफलता देखी है, एमआरएनए-एलएनपी को प्रोटीन रिप्लेसमेंट थेरेपी8 में उपयोग के साथ-साथ कैस 9 एमआरएनए के सह-वितरण के लिए भी खोजा गया है और जीन संपादन9 के लिए सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 प्रणाली के वितरण के लिए आरएनए का मार्गदर्शन किया गया है। हालांकि, कोई एक विशिष्ट सूत्रीकरण नहीं है जो सभी अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, और एलएनपी फॉर्मूलेशन मापदंडों में सूक्ष्म परिवर्तन विवो 8,10,11 में शक्ति और जैव वितरण को बहुत प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, प्रत्येक एलएनपी-आधारित चिकित्सा के लिए इष्टतम सूत्रीकरण निर्धारित करने के लिए व्यक्तिगत एमआरएनए-एलएनपी को विकसित और मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

एलएनपी आमतौर पर चार लिपिड घटकों के साथ तैयार किए जाते हैं: एक आयनीय लिपिड, एक फॉस्फोलिपिड, कोलेस्ट्रॉल, और एक लिपिड-लंगर पॉलीथीन-ग्लाइकोल (पीईजी) संयुग्म (लिपिड-पीईजी) 11,12,13। एलएनपी द्वारा सुगम शक्तिशाली इंट्रासेल्युलर डिलीवरी, आंशिक रूप से, आयनयोग्य लिपिड घटक12 पर निर्भर करती है। यह घटक शारीरिक पीएच पर तटस्थ होता है लेकिन एंडोसोम11 के अम्लीय वातावरण में सकारात्मक रूप से चार्ज हो जाता है। आयनिक चार्ज में इस परिवर्तन को एंडोसोमल एस्केप12,14,15 में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता माना जाता है। आयनयोग्य लिपिड के अलावा, फॉस्फोलिपिड (हेल्पर लिपिड) घटक कार्गो के एनकैप्सुलेशन में सुधार करता है और एंडोसोमल पलायन में सहायता करता है, कोलेस्ट्रॉल स्थिरता प्रदान करता है और झिल्ली संलयन को बढ़ाता है, और लिपिड-पीईजी परिसंचरण में एलएनपी एकत्रीकरण और ऑप्सनाइजेशन को कम करता है10,11,14,16।. एलएनपी तैयार करने के लिए, इन लिपिड घटकों को एक कार्बनिक चरण में जोड़ा जाता है, आमतौर पर इथेनॉल, और न्यूक्लिक एसिड कार्गो युक्त एक जलीय चरण के साथ मिलाया जाता है। एलएनपी सूत्रीकरण प्रक्रिया बहुत बहुमुखी है क्योंकि यह विभिन्न घटकों को आसानी से प्रतिस्थापित करने और विभिन्न दाढ़ अनुपातों पर संयुक्त करने की अनुमति देती है ताकि भौतिकरासायनिक गुणों की भीड़ के साथ कई एलएनपी योगों को तैयार किया जा सके। हालांकि, एलएनपी की इस विशाल विविधता की खोज करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक फॉर्मूलेशन का मूल्यांकन लक्षण वर्णन और प्रदर्शन में अंतर को सटीक रूप से मापने के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया का उपयोग करके किया जाए।

यहां, एमआरएनए-एलएनपी के निर्माण और कोशिकाओं और जानवरों में उनके प्रदर्शन के आकलन के लिए पूरा वर्कफ़्लो रेखांकित किया गया है।

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Protocol

नोट: आरएनएस और डीएनए के लिए सतह विसंदूषक के साथ सतहों और उपकरणों को पोंछकर एमआरएनए-एलएनपी तैयार करते समय हमेशा आरएनएस-मुक्त स्थितियों को बनाए रखें। केवल RNase-मुक्त युक्तियों और अभिकर्मकों का उपयोग करें।

सभी पशु प्रक्रियाओं को पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों और पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था।

1. पूर्व सूत्रीकरण तैयारी

  1. एक साफ 4 एल बीकर को 200-300 एमएल ताजा 10 एक्स फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से भरें।
    1. 1x PBS का बीकर प्राप्त करने के लिए बीकर में 10x PBS को अल्ट्राप्योर पानी के साथ 10 गुना पतला करें। सुनिश्चित करें कि 1x PBS की अंतिम मात्रा 2-3 L के बीच है।
    2. एलएनपी फॉर्मूलेशन के लिए उपयुक्त क्षमता के डायलिसिस कैसेट (20 केडीए आणविक भार कटऑफ [एमडब्ल्यूसीओ]) को भरे हुए बीकर में रखें ताकि उन्हें हाइड्रेट किया जा सके।
      नोट: डायलिसिस कैसेट को उपयोग से पहले हाइड्रेट करने के लिए न्यूनतम 2 मिनट की आवश्यकता होती है।
    3. बीकर में एक हलचल बार रखें, और बीकर को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।
    4. एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर कवर बीकर रखें। हलचल प्लेट चालू करें, और इसे 300-400 आरपीएम पर स्पिन करने के लिए सेट करें।
  2. एमआरएनए कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले 10 एमएम साइट्रिक एसिड बफर बनाने के लिए अल्ट्राप्योर पानी के साथ 100 एमएम साइट्रिक एसिड बफर स्टॉक (पीएच 3) को 10 गुना पतला करें।
  3. 100% इथेनॉल में प्रत्येक लिपिड को घोलकर सी 12-200 आयनीय लिपिड, हेल्पर लिपिड, कोलेस्ट्रॉल और लिपिड-लंगर पीईजी (लिपिड-पीईजी) स्टॉक समाधान बनाएं। लिपिड घटकों की सांद्रता तालिका 1 में विस्तृत है।
    1. स्टॉक घोल को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और मिलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे पूरी तरह से घुल गए हैं।

2. लिपिड और न्यूक्लिक एसिड मिश्रण की तैयारी

  1. वांछित दाढ़ अनुपात और आयनीय लिपिड से एमआरएनए वजन अनुपात के आधार पर आयनीय लिपिड, सहायक लिपिड, कोलेस्ट्रॉल और लिपिड-पीईजी की आवश्यक मात्रा की गणना करें (तालिका 1)। फॉर्मूलेशन के दौरान सिरिंज में मृत मात्रा के लिए कार्बनिक चरण की 10% अतिरिक्त मात्रा तैयार करें।
    1. शंक्वाकार ट्यूब में विभिन्न लिपिड घटकों की गणना की गई मात्रा को मिलाएं।
    2. 100% इथेनॉल के साथ लिपिड को अंतिम मात्रा, वी में पतला करें, जो एलएनपी की अंतिम मात्रा का 25% प्रतिनिधित्व करता है।
  2. आयनित लिपिड से एमआरएनए वजन अनुपात और आवश्यक एमआरएनए-एलएनपी की कुल मात्रा के आधार पर फॉर्मूलेशन के लिए आवश्यक एमआरएनए की मात्रा की गणना करें (तालिका 1)।
    1. बर्फ पर जुगनू लूसिफेरस-एन्कोडिंग एमआरएनए को पिघलाएं।
    2. एमआरएनए को अंतिम मात्रा, 3वी, कार्बनिक चरण की मात्रा का तीन गुना, 10 एमएम साइट्रिक एसिड बफर में पतला करें।
      नोट: प्रत्येक लिपिड मात्रा, वी, में 3वी में पतला एमआरएनए के लिए पर्याप्त आयनीय लिपिड होना चाहिए। यह एमआरएनए वजन अनुपात के लिए वांछित आयनीय लिपिड से मेल खाती है।

3. एमआरएनए-एलएनपी का माइक्रोफ्लुइडिक सूत्रीकरण।

  1. एक नाजुक कार्य को RNases और DNA के लिए एक सतह विसंदूषक के साथ स्प्रे करें, और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण के इंटीरियर को अच्छी तरह से पोंछ दें।
    1. एक नया माइक्रोफ्लुइडिक कारतूस खोलें, और इसे नीचे और दूर की ओर इनलेट चैनलों के साथ डालें।
    2. सुनिश्चित करें कि शंक्वाकार ट्यूब आर्म में दो 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब हैं और दाईं ओर सबसे दूर की स्थिति में है।
    3. कैप ्स बंद करने के साथ धारक पर दो बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब कॉन्फ़िगर करें।
  2. एमआरएनए समाधान के साथ 5 एमएल सिरिंज भरें जिसमें 10 एमएम साइट्रिक एसिड बफर में पतला एमआरएनए होता है।
    1. लिपिड समाधान के साथ 3 एमएल सिरिंज भरें जिसमें शुद्ध 100% इथेनॉल में पतला लिपिड होता है।
    2. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस पर कारतूस धारक को फ्लिप करें।
    3. सुई के बिना 5 एमएल सिरिंज डालें, जिसमें कारतूस के बाएं इनलेट में एमआरएनए होता है।
    4. सुई के बिना 3 एमएल सिरिंज डालें, जिसमें कारतूस के दाहिने इनलेट में लिपिड होते हैं।
    5. कारतूस धारक को वापस नीचे पलटें, और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण के ढक्कन को बंद करें।
  3. उपकरण के पीछे स्थित स्विच का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण चालू करें।
    1. त्वरित रन का चयन करें.
    2. डाले गए 5 एमएल और 3 एमएल सिरिंज के लिए सही सिरिंज प्रकारों का चयन करें।
    3. एमआरएनए-एलएनपी फॉर्मूलेशन के लिए मापदंडों को 3: 1 जलीय से कार्बनिक प्रवाह दर अनुपात पर इनपुट करें जैसा कि तालिका 2 में वर्णित है।
    4. अगली स्क्रीन पर जाने के लिए अगला बटन दबाएं।
    5. पुष्टि करें कि सही पैरामीटर इनपुट किए गए हैं।
    6. एमआरएनए-एलएनपी तैयार करने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं।

4. एमआरएनए-एलएनपी के पोस्ट-फॉर्मूलेशन प्रोसेसिंग और लक्षण वर्णन

  1. दाएं शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र किए गए एमआरएनए-एलएनपी को पहले से हाइड्रेटेड डायलिसिस कैसेट में लोड करें।
    नोट: एमआरएनए-एलएनपी लोड करते समय कैसेट की झिल्ली को पंचर या नुकसान न पहुंचाएं। यदि झिल्ली क्षतिग्रस्त हो जाती है, तो लोड होने पर एमआरएनए-एलएनपी खो जाएंगे।
    1. एमआरएनए-एलएनपी युक्त डायलिसिस कैसेट को 1x पीबीएस युक्त बीकर में वापस रखें, और उन्हें कम से कम 2 घंटे के लिए डायलेज़ करने के लिए छोड़ दें।
    2. डायलिसिस के बाद, एमआरएनए-एलएनपी युक्त डायलिसिस कैसेट को एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में लाएं, और सुई के साथ सिरिंज का उपयोग करके एमआरएनए-एलएनपी को हटा दें।
    3. 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके एमआरएनए-LNPs को बाँझ-फ़िल्टर करें, और उन्हें बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें।
    4. लक्षण वर्णन उद्देश्यों के लिए 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में एमआरएनए-एलएनपी समाधान के 65 μL रखें।
  2. गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन का उपयोग करके हाइड्रोडायनामिक आकार और पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स के माप के लिए एक क्यूवेट में 1x पीबीएस के 990 μL में एमआरएनए-एलएनपी 1: 100 के 10 μL को पतला करें।
  3. प्रतिदीप्ति परख (यानी, राइबोग्रीन) का उपयोग करके एमआरएनए-एलएनपी की एकाग्रता और एनकैप्सुलेशन दक्षता का आकलन करें।
    1. आणविक जीव विज्ञान के पानी के साथ 20x टीई बफर को पतला करके 1x TE बफर का स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. 1x TE बफर के साथ ट्राइटन एक्स -100 को पतला करके 1% ट्राइटन एक्स -100 बफर का स्टॉक समाधान तैयार करें।
    3. 1x TE बफर के साथ अभिकर्मक स्टॉक 1: 200 को पतला करके फ्लोरोसेंट अभिकर्मक तैयार करें।
    4. एमआरएनए-एलएनपी को 1x TE बफर में 1:100 और 1% ट्राइटन X-100 बफर को 100 μL में ब्लैक-वॉल ब्लैक-बॉटम 96-वेल प्लेट में पतला करें।
    5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए मानक को पतला करके एक कम-श्रेणी मानक वक्र तैयार करें, और 96-वेल प्लेट में मानक वक्र को प्लेट करें।
    6. पतला एमआरएनए-एलएनपी या पतला मानक वाले प्रत्येक कुएं में पतला फ्लोरोसेंट अभिकर्मक के 100 μL जोड़ें।
    7. एक प्लेट रीडर के अंदर 96-वेल प्लेट रखें, और 1 मिनट के लिए हिलाएं, इसके बाद 4 मिनट की प्रतीक्षा करें।
    8. 480 एनएम / 520 एनएम के उत्तेजना / उत्सर्जन पर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक कुएं की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें।
  4. प्रतिदीप्ति मूल्यों को सांद्रता में बदलने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें।
    1. समीकरण 4.4 के अनुसार, 1% ट्राइटन एक्स -100 (कुल एमआरएनए) में एलएनपी को पतला करने से प्राप्त मूल्य से टीई बफर (अनकैप्सुलेटेड एमआरएनए) में एलएनपी को पतला करने से प्राप्त मूल्य को घटाकर और 1% ट्राइटन एक्स -100 में एलएनपी को पतला करने से प्राप्त मूल्य से विभाजित करके एनकैप्सुलेशन दक्षता की गणना करें।
    2. सेल और पशु अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले एमआरएनए-एलएनपी एकाग्रता की गणना 1% ट्राइटन एक्स -100 (कुल एमआरएनए) में एलएनपी को पतला करने से प्राप्त मूल्य से टीई बफर (अनकैप्सुलेटेड एमआरएनए) में एलएनपी को पतला करने से प्राप्त मूल्य को घटाकर करें।
  5. 6-(पी-टोल्यूडिनो)-2-नेफ्थलीनसल्फोनिल क्लोराइड (टीएनएस) परख करके एमआरएनए-एलएनपी केपीकेए को मापें।
    1. अल्ट्राप्योर पानी में टीएनएस का 0.16 एमएम घोल बनाकर टीएनएस अभिकर्मक तैयार करें।
      नोट: अभिकर्मक का उपयोग करते समय, गिरावट से बचने के लिए इसे बर्फ पर और प्रकाश से दूर रखना सुनिश्चित करें।
    2. 150 एमएम सोडियम क्लोराइड, 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट, 25 एमएम अमोनियम साइट्रेट, और 20 एमएम अमोनियम एसीटेट के बफर समाधान तैयार करें जो 0.5 की वृद्धि में 2 से 12 तक के विभिन्न पीएच मानों में समायोजित हों।
    3. ब्लैक-वॉल ब्लैक-बॉटम 96-वेल प्लेट में प्रत्येक पीएच-समायोजित बफर समाधान में एलएनपी के 2.5 μL जोड़ें।
    4. प्रत्येक कुएं में टीएनएस अभिकर्मक जोड़ें ताकि अंतिम टीएनएस एकाग्रता 6 μM हो।
    5. 96-वेल प्लेट को 5 मिनट के लिए अंधेरे स्थान पर इनक्यूबेट करें।
    6. प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग करके 322 एनएम / 431 एनएम के उत्तेजना / उत्सर्जन पर प्रतिदीप्ति को मापें।
    7. डेटा को सिग्मोइडल वक्र में फिट करें, और पीएच का पता लगाने के लिए फिट किए गए समीकरण का उपयोग करके पीकेए की गणना करें जिस पर अधिकतम तीव्रता का 50% देखा गया था।
  6. एमआरएनए-एलएनपी हाइड्रोडायनामिक आकार, पीडीआई, एनकैप्सुलेशन दक्षता औरपीकेए के प्रतिनिधि परिणाम तालिका 3 में दिखाए गए हैं।

5. हेपजी 2 कोशिकाओं के इन विट्रो अभिकर्मक

नोट: विभिन्न अन्य सेल लाइनें, जैसे कि हेला कोशिकाएं या एचईके -293 टी कोशिकाएं, इन विट्रो में एलएनपी की अभिकर्मक दक्षता का आकलन करने के लिए उपयोग की जा सकती हैं। एलएनपी अभिकर्मक अध्ययन से पहले सभी कोशिकाओं को माइकोप्लाज्मा के लिए नकारात्मक परीक्षण करना चाहिए।

  1. पूर्ण सेल कल्चर माध्यम के 100 μL में एक सफेद-दीवार स्पष्ट-तल 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्लेट 5,000 हेपजी 2 कोशिकाएं (डीएमईएम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक)।
    1. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर नियंत्रित सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर पालन करने के लिए छोड़ दें।
  2. एमआरएनए-एलएनपी को पूर्ण सेल कल्चर माध्यम में पतला करें ताकि कुल खुराक 100 μL में वितरित की जा सके।
    1. कुओं से पूरा माध्यम निकालें।
    2. वांछित खुराक या पूर्ण माध्यम (नियंत्रण) पर पूर्ण सेल कल्चर माध्यम में पतला एमआरएनए-एलएनपी के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
    3. उपचारित कोशिकाओं वाले 96-वेल प्लेट को 24 घंटे के लिए नियंत्रित सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  3. एक ल्यूसिफेरस परख करके अभिकर्मक दक्षता का आकलन करें।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ल्यूसिफेरस अभिकर्मक और 1 एक्स सेल लाइसिस बफर तैयार करें।
    2. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं वाली 96-वेल प्लेट को बाहर निकालें, और इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट में लाएं।
    3. 96-वेल प्लेट के हर कुएं से सेल कल्चर माध्यम को हटा दें।
    4. प्रत्येक कुएं में 1x लाइसिस बफर के 20 μL जोड़ें, इसके बाद पहले से तैयार ल्यूसिफेरस परख अभिकर्मक के 100 μL।
    5. प्लेट को प्रकाश से बचाएं, और प्रत्येक कुएं के बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल को मापने के लिए प्लेट रीडर में प्लेट रीडर में रखें।
      नोट: पहले से तैयार सी 12-200 एमआरएनए-एलएनपी के साथ हेपजी 2 कोशिकाओं के उपचार का प्रदर्शन करने वाले प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1 में दिखाए गए हैं।

6. पूंछ शिरा इंजेक्शन के बाद चूहों में एमआरएनए-एलएनपी के विवो मूल्यांकन में ।

  1. बाँझ 1x पीबीएस के साथ एमआरएनए-एलएनपी समाधान को पतला करें ताकि कुल एमआरएनए का 2 μg 100 μL पूंछ शिरा इंजेक्शन मात्रा में मौजूद हो, जो 20 ग्राम माउस के लिए लगभग 0.1 मिलीग्राम / किग्रा की शरीर के वजन की खुराक से मेल खाती है।
  2. एक अनुमोदित विधि का उपयोग करके प्रत्येक माउस को रोकें, और पूंछ को 70% अल्कोहल के साथ नम पैड से पोंछें।
    1. 29 ग्राम इंसुलिन सिरिंज को या तो 100 μL mRNA-LNP (2 μg) या 1x PBS के 100 μL के साथ भरें। सिरिंज से किसी भी बुलबुले को हटा दें।
    2. माउस की पार्श्व पूंछ की नस में बेवेल के साथ सुई डालें, और धीरे-धीरे एमआरएनए-एलएनपी या 1 एक्स पीबीएस के 100 μL इंजेक्ट करें।
    3. सुई को हटा दें और हेमोस्टेसिस प्राप्त होने तक दबाव लागू करें।
  3. इंजेक्शन के 6 घंटे बाद बाँझ 1x पीबीएस में 15 मिलीग्राम / एमएल डी-लूसिफेरिन पोटेशियम नमक का स्टॉक समाधान तैयार करें।
    1. इन विवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) चालू करें, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
    2. डेटा अधिग्रहण के लिए उपकरण तैयार करने के लिए प्रारंभिक दबाएँ ।
    3. ल्यूमिनेसेंस के बगल में स्थित बॉक्स को चेक करें, और ऑटो के लिए एक्सपोज़र समय सेट करें। सुनिश्चित करें कि छवि बनाए जा रहे चूहों की संख्या के लिए दृश्य के सही क्षेत्र का चयन किया गया है।
    4. पहले से इलाज किए गए चूहों को डी-लूसिफेरिन इंट्रापरिटोनियल (150 मिलीग्राम लूसिफेरिन प्रति किलोग्राम शरीर के वजन) के 200 μL का प्रशासन करें।
    5. चूहों को 2.5% आइसोफ्लुरेन और 2.0 एल / मिनट की ऑक्सीजन प्रवाह दर के लिए सेट एक संज्ञाहरण कक्ष में रखें।
    6. एमआरएनए-एलएनपी-उपचारित चूहों की इमेजिंग से पहले ल्यूसिफेरस सिग्नल को स्थिर करने के लिए 10 मिनट प्रतीक्षा करें।
    7. सुनिश्चित करें कि चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज किया गया है, और इमेजिंग कक्ष के अंदर नाक शंकु के माध्यम से आइसोफ्लुरेन को प्रशासित करने के लिए एनेस्थेटिक लाइन को पुनर्निर्देशित करें।
    8. चूहों को नाक शंकु में स्थानांतरित करें, और सुनिश्चित करें कि वे अपने पेट के साथ अपनी पीठ पर हैं।
    9. कक्ष के दरवाजे को बंद करें, और बायोल्यूमिनेसेंस छवियों को प्राप्त करने के लिए सॉफ़्टवेयर में अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें।
      नोट: एमआरएनए-एलएनपी या 1एक्स पीबीएस उपचार के बाद माउस पूरे शरीर की इमेजिंग के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में दिखाए गए हैं।

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Representative Results

एमआरएनए-एलएनपी को एक माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण का उपयोग करके तैयार किया गया था जिसमें 76.16 एनएम का औसत हाइड्रोडायनामिक व्यास और 0.098 का पॉलीडिस्पर्सेबिलिटी इंडेक्स था। टीएनएस परख18 का प्रदर्शन करके एमआरएनए-एलएनपी कापीकेए 5.75 पाया गया। संशोधित प्रतिदीप्ति परख और समीकरण 4.4 का उपयोग करके इन एमआरएनए-एलएनपी के लिए एनकैप्सुलेशन दक्षता की गणना 92.3% की गई थी। सेल उपचार और पशु खुराक के लिए उपयोग की जाने वाली समग्र आरएनए एकाग्रता 40.24 एनजी / यह मान संशोधित प्रतिदीप्ति परख19 से प्राप्त किया गया था, विशेष रूप से 1% ट्राइटन एक्स -100 और 1 एक्स टीई बफर के साथ एलएनपी को कुछ सांद्रता में पतला करके प्राप्त प्रतिदीप्ति को परिवर्तित करने और एनकैप्सुलेटेड एमआरएनए की मात्रा की गणना करने से।

समीकरण 4.4

Equation 1

सीटीएक्स = 1% ट्राइटन एक्स -100 में पतला एलएनपी से एमआरएनए की एकाग्रता

सी टीई = 1x टीई बफर में पतला एलएनपी से एमआरएनए की एकाग्रता।

एमआरएनए-एलएनपी की विभिन्न खुराक के साथ प्रति कुएं 5,000 हेपजी 2 कोशिकाओं के उपचार पर बढ़ती खुराक के साथ बढ़ती बायोल्यूमिनेसेंस देखा गया। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सबसे कम खुराक (5 एनजी / वेल) पर ल्यूसिफेरस अभिव्यक्ति का आसानी से पता लगाया गया था। हालांकि, अन्य सेल लाइनों को खुराक में ल्यूमिनेसेंस में अंतर देखने के लिए एमआरएनए-एलएनपी की अलग-अलग मात्रा की आवश्यकता हो सकती है।

चूहों को एमआरएनए-एलएनपी के 2 μg के साथ इलाज किया गया था और पूरे शरीर के बायोल्यूमिनेसेंस के लिए 6 घंटे बाद मूल्यांकन किया गया था। चूंकि C12-200 mRNA-LNPs मुख्य रूप से यकृत20 को स्थानांतरित करते हैं, इसलिए हमारे तैयार LNPs के साथ इलाज किए गए चूहों के ऊपरी पेट में एक मजबूत बायोल्यूमिनेसेंट संकेत देखा गया था। इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, कुल ल्यूमिनेसेंट फ्लक्स की गणना करने के लिए यकृत संकेतों के आसपास रुचि के क्षेत्र तैयार किए गए थे। इस प्रयोग में, कुल ल्यूमिनेसेंट फ्लक्स लगभग 5 x 109 था, जो इस एलएनपी फॉर्मूलेशन 4,21 के साथ किए गए अन्य अध्ययनों के अनुरूप है।

तालिका 1: कार्बनिक चरण संरचना। व्यक्तिगत लिपिड स्टॉक समाधानों की सांद्रता और प्रत्येक घटक 1.3 एमएल कार्बनिक चरण में योगदान देता है। लिपिड को 35/16/46.5/2.5 (C12-200: डोप: कोलेस्ट्रॉल: C14-PEG2000) के दाढ़ अनुपात में जोड़ा जाता है। फॉर्मूलेशन के दौरान सिरिंज डेड वॉल्यूम के लिए 10% अतिरिक्त मात्रा तैयार की गई थी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: 3: 1 जलीय से कार्बनिक प्रवाह दर अनुपात पर एमआरएनए-एलएनपी फॉर्मूलेशन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण सेटिंग्स। 10 एमएम साइट्रिक एसिड बफर में पतला एमआरएनए युक्त 5 एमएल सिरिंज को केंद्र चैनल में डाला गया था, जबकि लिपिड युक्त 3 एमएल सिरिंज को सही चैनल में डाला गया था। एलएनपी को आयनीय लिपिड: एमआरएनए के 10: 1 वजन अनुपात पर तैयार किया गया था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन, एक संशोधित प्रतिदीप्ति, और 2-(पी-टोलुइडिनो) नेफ्थलीन -6-सल्फोनिक एसिड (टीएनएस) परख द्वारा निर्धारित एमआरएनए-एलएनपी लक्षण वर्णन डेटा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 1
चित्रा 1: हेपजी 2 कोशिकाओं को जुगनू ल्यूसिफेरस एमआरएनए-एलएनपी के साथ इलाज किया जाता है। कुल मिलाकर, 5,000 हेपजी 2 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट में प्रति कुएं बीज दिया गया था और रात भर पालन करने की अनुमति दी गई थी। कोशिकाओं को डीएमईएम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया गया था। सेल कल्चर माध्यम को सी 12-200 युक्त एलएनपी फॉर्मूलेशन की 5 एनजी, 10 एनजी और 20 एनजी खुराक के साथ इलाज करने से पहले हटा दिया गया था, जिसमें जुगनू ल्यूसिफेरस-एन्कोडिंग एमआरएनए (सेल कल्चर माध्यम के 100 μL में) शामिल थे। उपचार के 24 घंटे बाद, सेल कल्चर माध्यम को हटा दिया गया था, और ल्यूसिफेरस परख अभिकर्मक के 100 μL को जोड़ने से पहले कोशिकाओं पर 1x लाइसिस बफर के 20 μL जोड़े गए थे। प्रत्येक कुएं से बायोल्यूमिनेसेंस को 5 मिनट की इनक्यूबेशन अवधि के बाद प्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था। फोल्ड वृद्धि को कुओं को नियंत्रित करने के लिए प्लॉट किया जाता है जिसमें अनुपचारित हेपजी 2 कोशिकाएं शामिल होती हैं। सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन पोस्ट-हॉक ट्यूकी के परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किया गया था। एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है; , पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सी 57बीएल / 6 चूहों को जुगनू ल्यूसिफेरस एमआरएनए-एलएनपी के साथ इलाज किया गया। इस काम में, 100 μL में कुल MRNA-LNP का 2 μg या 1x PBS के 100 μL को पार्श्व पूंछ की नस के माध्यम से C57BL/6 चूहों को प्रशासित किया गया था। (ए) एमआरएनए-एलएनपी या 1एक्स पीबीएस के साथ इलाज किए गए चूहों के पूरे शरीर के बायोल्यूमिनेसेंस को विवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) 6 एच पोस्ट एडमिनिस्ट्रेशन का उपयोग करके मापा गया था। आईवीआईएस स्पेक्ट्रम लिविंग इमेज सॉफ्टवेयर का उपयोग पूरे शरीर की छवियों का विश्लेषण और अधिग्रहण करने के लिए किया गया था। N = 3. (बी) कुल ल्यूमिनेसेंट फ्लक्स की मात्रा निर्धारित और प्लॉट की गई थी। सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। **, पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस वर्कफ़्लो के साथ, विभिन्न प्रकार के एमआरएनए-एलएनपी को उनके इन विट्रो और विवो दक्षता के लिए तैयार और परीक्षण किया जा सकता है। आयनीय लिपिड और एक्सीपिएंट्स को अलग-अलग मोलर अनुपात और विभिन्न आयनीय लिपिड से एमआरएनए वजन अनुपात में जोड़ा जा सकता है ताकि अलग-अलग भौतिकरासायनिक गुणों के साथ एमआरएनए-एलएनपी का उत्पादन किया जा सके। यहां, हमने 10: 1 आयनीय लिपिड से एमआरएनए वजन अनुपात पर 35/16/46.5/2.5 (आयनीय लिपिड: हेल्पर लिपिड: कोलेस्ट्रॉल: लिपिड-पीईजी) के दाढ़ अनुपात के साथ सी 12-200 एमआरएनए-एलएनपी तैयार किया। इन एलएनपी का परीक्षण हेपजी 2 कोशिकाओं में विट्रो में और सी 57बीएल /6 चूहों में विवो में उनकी अभिकर्मक दक्षता के लिए किया गया था। सी 12-200 एमआरएनए-एलएनपी को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण द्वारा संश्लेषित किया गया था। हालांकि अन्य फॉर्मूलेशन विधियों का उपयोग एलएनपी तैयार करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि पिपेट मिक्सिंग या टी-जंक्शन मिक्सिंग 4, माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग एमआरएनए-एलएनपी तैयार करता है जो आम तौर पर छोटे, कम पॉलीस्प्रेट होते हैं, और उच्च एनकैप्सुलेशन क्षमता 4,13,23,24 होती है।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण के साथ एमआरएनए-एलएनपी का निर्माण एलएनपी के सरल और लचीले सूत्रीकरण की अनुमति देता है। एक रन की शुरुआत में प्रवाह दर निर्धारित लक्ष्य प्रवाह दर से भिन्न होती है क्योंकि सिरिंज पुशर्स पूरी गति तक तेज हो जाते हैं। इससे परिवर्तनीय कण विशेषताओं और असंगत परिणाम हो सकते हैं। इसे दूर करने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण को स्थिर-राज्य स्थितियों में तैयार किए गए एलएनपी से अलग कचरे के रूप में एक फॉर्मूलेशन की शुरुआत और अंत में तैयार किए गए एलएनपी को इकट्ठा करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। यह पॉलीडिस्पर्सिटी को कम कर सकता है और अधिक सुसंगत कण गुणों को जन्म दे सकता है। स्टार्ट वेस्ट की गणना निर्माता के मैनुअल के अनुसार फॉर्मूलेशन के लिए उपयोग की जा रही सिरिंज के संयोजन के आधार पर की जा सकती है। हालांकि, अंतिम अपशिष्ट गैर-स्थिर-राज्य प्रवाह स्थितियों की समान डिग्री का अनुभव नहीं करता है, इसलिए निर्माता की सिफारिश के अनुसार सभी सिरिंज संयोजनों के लिए मात्रा अक्सर 0.05 एमएल पर सेट होती है।

कार्बनिक और जलीय चरणों की सही मात्रा तैयार करते समय सिरिंज और ट्यूबों में मृत मात्रा का हिसाब रखना महत्वपूर्ण है। प्रत्येक चरण की 10% अतिरिक्त मात्रा तैयार करना यह सुनिश्चित करता है कि वांछित एलएनपी की न्यूनतम मात्रा तैयार की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल में, 4.7 एमएल की कुल फॉर्मूलेशन मात्रा को 0.7 एमएल कचरे के साथ इनपुट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप स्थिर-राज्य स्थितियों में 4 एमएल एलएनपी एकत्र किया गया था। हालांकि, कार्बनिक चरण के 1.3 एमएल और जलीय चरण के 3.9 एमएल फॉर्मूलेशन के लिए तैयार किए गए थे। यह सुनिश्चित करता है कि 5 एमएल सिरिंज को 3.6 एमएल मार्क तक भरा जा सकता है और 3 एमएल सिरिंज को 1.2 एमएल मार्क तक भरा जा सकता है। यदि मात्रा सिरिंज पर निशान तक पहुंचती है, तो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण पर उपयोग किए जाने वाले वॉल्यूम विनिर्देश सुरक्षित इनपुट हैं। "स्टार्ट" बटन दबाने से पहले अंतिम स्क्रीन यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सभी पैरामीटर सही हैं। सिरिंज प्रकार, सिरिंज में वॉल्यूम, वितरित की जाने वाली वॉल्यूम, सिरिंज प्लेसमेंट और प्रवाह दरों पर अंतिम जांच करना महत्वपूर्ण है।

एमआरएनए-एलएनपी के निर्माण के बाद, डायलिसिस चरण में ध्यान में रखने के लिए कुछ महत्वपूर्ण विचार हैं। उपयोग किए जाने वाले डायलिसिस कैसेट को एलएनपी लोड करने से पहले 2 मिनट के न्यूनतम हाइड्रेशन समय की आवश्यकता होती है। यह झिल्ली के लचीलेपन को बढ़ाता है और नमूना जोड़े जाने के साथ झिल्ली को अधिक आसानी से समायोजित करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि एमआरएनए-एलएनपी के साथ लोड करते समय डायलिसिस कैसेट्स की झिल्लियों को नुकसान या पंचर न करें। यदि झिल्ली पंचर या क्षतिग्रस्त हो जाती है, तो तैयार एमआरएनए-एलएनपी को लोड होने पर आसानी से खो दिया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हमने हेपजी 2 कोशिकाओं में एमआरएनए-एलएनपी की इन विट्रो दक्षता का परीक्षण किया। हालांकि, अन्य सेल प्रकारों को एमआरएनए-एलएनपी अभिकर्मक दक्षता के लिए परीक्षण किया जा सकता है। यदि गैर-अनुयायी कोशिकाओं का उपयोग किया जा रहा है, तो 96-वेल प्लेट को सेल कल्चर माध्यम25 को हटाने से पहले 5 मिनट के लिए 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता होती है। यह मध्यम निष्कासन के दौरान कोशिकाओं के किसी भी नुकसान को कम करता है। किसी भी एलएनपी अभिकर्मक अध्ययन से पहले माइकोप्लाज्मा की उपस्थिति के लिए कोशिकाओं का भी परीक्षण किया जाना चाहिए। यदि कोशिकाएं माइकोप्लाज्मा के लिए सकारात्मक परीक्षण करती हैं तो लगातार परिणाम प्राप्त करना और विभिन्न एलएनपी योगों की तुलना करना मुश्किल होगा। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक कोशिकाओं को सेल लाइनों की तुलना में विषाक्तता के बिना अभिकर्मक को मापने के लिए एलएनपी की उच्च खुराक की आवश्यकता हो सकती है। प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों18 दोनों में अलग-अलग खुराक पर विट्रो में एमआरएनए-एलएनपी विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए एक ल्यूसिफेरस-आधारित व्यवहार्यता परख का उपयोग किया जा सकता है।

एक ही एमआरएनए-एलएनपी फॉर्मूलेशन के साथ उपचार के बाद विभिन्न चूहों में लगातार बायोल्यूमिनेसेंस माप प्राप्त करने में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक यह सुनिश्चित करना है कि डी-लूसिफेरिन के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन और आईवीआईएस माप के बीच कासमय सुसंगत है। यह समय अंतराल प्राप्त बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल की स्थिरता को प्रभावित करता है। समय अंतराल काफी लंबा होना चाहिए ताकि सिग्नल में किसी भी उतार-चढ़ाव को कम किया जा सके। एक प्रारंभिक प्रयोग चलाया जा सकता है जिसमें चूहों को डी-लूसिफेरिन इंजेक्शन के बाद हर मिनट चित्रित किया जाता है। समय अंतराल जब सिग्नल स्थिर होना शुरू होता है, अभिकर्मक प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त है। इस प्रोटोकॉल में, 150 मिलीग्राम डी-लूसिफेरिन / किग्रा शरीर के वजन इंजेक्शन के बाद स्थिर ल्यूमिनेसेंस संकेतों के लिए 10 मिनट के अंतराल की अनुमति दी जाती है, जो आमतौर परइमेजिंग 27,28 के लिए किया जाता है।

इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली एमआरएनए-एलएनपी खुराक (0.1 मिलीग्राम एमआरएनए / किग्रा शरीर का वजन) विषाक्तता और चिकित्सीय प्रभावकारिता29,30 का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली खुराक की तुलना में छोटी है। ये छोटी खुराक अद्वितीय एमआरएनए-एलएनपी फॉर्मूलेशन की क्षमता में अंतर का मूल्यांकन करने में मदद करती हैं, जबकि प्राप्त ल्यूमिनेसेंट सिग्नल को ओवरसैट्यूट नहीं करती हैं। हालांकि, संभावित एमआरएनए-एलएनपी विषाक्तता को मापने के लिए इस खुराक को बढ़ाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एमआरएनए-एलएनपी इंजेक्शन31,32,33 के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर सीरम में एलानिन ट्रांसमिनेज, एस्पार्टेट ट्रांसमिनेज और क्षारीय फॉस्फेट के स्तर को निर्धारित करके यकृत विषाक्तता का मूल्यांकन किया जा सकता है। ये एंजाइम आमतौर पर सीरम में निम्न स्तर पर पाए जाते हैं लेकिन यकृत क्षति के परिणामस्वरूप बढ़ जाते हैं। सीरम में इन एंजाइमों की मात्रा निर्धारित करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग किया जा सकता है।

इस उदाहरण में, हमने जुगनू लूसिफेरस-एन्कोडिंग एमआरएनए का उपयोग किया, लेकिन अन्य रिपोर्टर एमआरएनए को शक्ति का आकलन करने के लिए एलएनपी में तैयार किया जा सकता है। हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या एमचेरी के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग को एमआरएनए-एलएनपी उपचार34,35 के बाद सेल-विशिष्ट वितरण की जांच के लिए नियोजित किया जा सकता है। एक एकल-कोशिका निलंबन रुचि के ऊतकों से उत्पादित किया जा सकता है, और जीएफपी + या एमचेरी + कोशिकाओं का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एमआरएनए-एलएनपी को एरिथ्रोपोइटिन के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग के साथ तैयार किया जा सकता है ताकि सीरम 8,36,37 में एरिथ्रोपोइटिन के स्राव के माध्यम से यकृत अभिकर्मक को मापा जा सके। एआई 9 चूहों में, एमआरएनए एन्कोडिंग क्रे रिकोम्बिनेस की डिलीवरी मजबूत टीडीटोमैटो फ्लोरेसेंस को प्रेरित करती है, जो विभिन्न सेल आबादी 38,39,40 में एमआरएनए-एलएनपी वितरण की जांच के लिए एक और विधि के रूप में काम कर सकती है। इस वर्कफ़्लो के प्रदर्शन के माध्यम से, यह हमारी आशा है कि एमआरएनए-एलएनपी सूत्रीकरण जांचकर्ताओं के लिए एक बाधा बनना बंद हो जाता है क्योंकि वे एमआरएनए चिकित्सीय के लिए नए विचारों और संभावनाओं का पता लगाते हैं।

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Disclosures

घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एमजेएम यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) के निदेशक के न्यू इनोवेटर अवार्ड (डीपी 2 TR002776), साइंटिफिक इंटरफेस (सीएएसआई) में बरोज वेलकम फंड करियर अवार्ड, यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन करियर अवार्ड (सीबीईटी -2145491), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनसीआई आर 01 CA241661, एनसीआई आर 37 CA244911 और एनआईडीडीके आर 01 DK123049) से अतिरिक्त धन प्राप्त करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Hydrochloric Acid Sigma 7647-01-0
0.22 μm Syringe Filters Genesee 25-243
1 mL BD Slip Tip Syringe BD 309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) Avanti Polar Lipids 880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) Avanti Polar Lipids 850725P
1.5 mL Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
200 proof Ethanol Decon Labs 2716
23G Needles Fisher Scientific 14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips Fisher Scientific 14-823-435
3 mL Dialysis Cassettes Thermo Scientific A52976
96 Well Black Wall Black Bottom Plate Fisher Scientific 07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface Thermo Scientific 165306
Ammonium Acetate, 1 Kilogram Research Products International  631-61-8
Ammonium Citrate dibasic SIgma 3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL BD 309646
C12-200 Ionizable Lipid Cayman Chemical 36699
C57BL/6 Mice Jackson Laboratory 000664
Cholesterol Sigma 57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU) TriLink Biotechnologies L-7202
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955129
D-Luciferin, Potassium Salt Thermo Scientific L2916
DMEM, high glucose Thermofisher Scientific 11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mL Fisher Scientific 1484132
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Hep G2 [HEPG2] ATCC HB-8065
HyPure Molecular Biology Grade Water Cytiva SH30538.03
Infinite 200 PRO Plate Reader Tecan N/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer N/A
Large Kimwipes Fisher Scientific 06-666-11D
Luciferase Assay Kit Promega E4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack Precision Nanosystems NIN0065
NanoAssemblr Ignite Instrument Precision Nanosystems NIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free Thermo Scientific AM9624
Penicillin-Streptomycin Thermofisher Scientific 15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 Teknova Q2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Scientific R11490
Reporter Lysis 5x Buffer Promega E3971
RNase Away Surface Decontaminant Thermofisher Scientific 7000TS1
Sodium Chloride Sigma 7647-14-5
Sodium Hydroxide Sigma 1310-73-2
Sodium Phosphate Sigma 7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) Sigma T9792
Triton X-100 Sigma 9036-19-5
Zetasizer Malvern Panalytical NanoZS

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 191 इन विट्रो दक्षता विवो दक्षता में एलएनपी एमआरएनए कार्गो न्यूक्लियस डिग्रेडेशन इंट्रासेल्युलर डिलीवरी आयनेबल लिपिड फॉस्फोलिपिड कोलेस्ट्रॉल लिपिड-पीईजी संयुग्म जुगनू लूसिफेरस अभिकर्मक दक्षता हेपजी 2 कोशिकाएं बायोल्यूमिनेसेंट प्लेट-आधारित परख सी 57बीएल /6 चूहे अंतःशिरा इंजेक्शन पार्श्व पूंछ नस पूरे शरीर के बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग विवो इमेजिंग सिस्टम में।
माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग द्वारा तैयार एमआरएनए-लिपिड नैनोकणों की <em>इन विट्रो</em> और <em>विवो</em> दक्षता का परीक्षण
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El-Mayta, R., Padilla, M. S.,… More

El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing. J. Vis. Exp. (191), e64810, doi:10.3791/64810 (2023).

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