Summary
Her præsenteres en protokol til formulering af lipidnanopartikler (LNP'er), der indkapsler mRNA-kodning af ildflueluciferase. Disse LNP'er blev testet for deres styrke in vitro i HepG2-celler og in vivo i C57BL/6-mus.
Abstract
Lipidnanopartikler (LNP'er) har tiltrukket sig stor opmærksomhed for nylig med den vellykkede udvikling af COVID-19 mRNA-vaccinerne af Moderna og Pfizer/BioNTech. Disse vacciner har vist effektiviteten af mRNA-LNP-terapi og åbnet døren for fremtidige kliniske anvendelser. I mRNA-LNP-systemer fungerer LNP'erne som leveringsplatforme, der beskytter mRNA-lasten mod nedbrydning af nukleaser og formidler deres intracellulære levering. LNP'erne består typisk af fire komponenter: et ioniserbart lipid, et phospholipid, kolesterol og et lipidforankret polyethylenglycol (PEG) konjugat (lipid-PEG). Her formuleres LNP'er, der indkapsler mRNA-kodende firefly luciferase ved mikrofluidisk blanding af den organiske fase indeholdende LNP-lipidkomponenter og den vandige fase indeholdende mRNA. Disse mRNA-LNP'er testes derefter in vitro for at evaluere deres transfektionseffektivitet i HepG2-celler ved hjælp af et bioluminescerende pladebaseret assay. Derudover evalueres mRNA-LNP'er in vivo i C57BL/6-mus efter en intravenøs injektion via den laterale halevene. Helkropsbioluminescensbilleddannelse udføres ved hjælp af et in vivo-billeddannelsessystem. Repræsentative resultater vises for mRNA-LNP-egenskaberne, deres transfektionseffektivitet i HepG2-celler og den totale selvlysende flux i C57BL/6-mus.
Introduction
Lipidnanopartikler (LNP'er) har vist sig meget lovende i de senere år inden for ikke-viral genterapi. I 2018 godkendte United States Food and Drug Administration (FDA) den første RNA-interferens (RNAi) terapeutiske, Onpattro af Alnylam, til behandling af arvelig transthyretin amyloidose 1,2,3,4. Dette var et vigtigt skridt fremad for lipidnanopartikler og RNA-baserede terapier. For nylig modtog Moderna og Pfizer/BioNTech FDA-godkendelser for deres mRNA-LNP-vacciner mod SARS-CoV-2 4,5. I hver af disse LNP-baserede nukleinsyreterapier tjener LNP til at beskytte sin last mod nedbrydning af nukleaser og lette potent intracellulær levering 6,7. Mens LNP'er har set succes i RNAi-terapier og vaccineapplikationer, er mRNA-LNP'er også blevet undersøgt til brug i proteinerstatningsterapier8 samt til co-levering af Cas9 mRNA og guide-RNA til levering af CRISPR-Cas9-systemet til genredigering9. Der er imidlertid ingen specifik formulering, der er velegnet til alle applikationer, og subtile ændringer i LNP-formuleringsparametrene kan i høj grad påvirke styrken og biodistributionen in vivo 8,10,11. Således skal individuelle mRNA-LNP'er udvikles og evalueres for at bestemme den optimale formulering for hver LNP-baseret terapi.
LNP'er formuleres almindeligvis med fire lipidkomponenter: et ioniserbart lipid, et phospholipid, kolesterol og et lipidforankret polyethylenglycol (PEG) konjugat (lipid-PEG)11,12,13. Den potente intracellulære levering lettet af LNP'er er delvis afhængig af den ioniserbare lipidkomponent12. Denne komponent er neutral ved fysiologisk pH, men bliver positivt ladet i det sure miljø i endosomet11. Denne ændring i ionisk ladning menes at være en vigtig bidragyder til endosomal flugt12,14,15. Ud over det ioniserbare lipid forbedrer phospholipidkomponenten (hjælperlipid) indkapslingen af lasten og hjælper med endosomal flugt, kolesterolet giver stabilitet og forbedrer membranfusion, og lipid-PEG minimerer LNP-aggregering og opsonisering i omløb10,11,14,16. For at formulere LNP kombineres disse lipidkomponenter i en organisk fase, typisk ethanol, og blandes med en vandig fase indeholdende nukleinsyrelasten. LNP-formuleringsprocessen er meget alsidig, idet den gør det muligt let at erstatte og kombinere forskellige komponenter i forskellige molære forhold for at formulere mange LNP-formuleringer med en lang række fysisk-kemiske egenskaber10,17. Men når man udforsker dette store udvalg af LNP'er, er det afgørende, at hver formulering evalueres ved hjælp af en standardiseret procedure for nøjagtigt at måle forskellene i karakterisering og ydeevne.
Her skitseres den komplette arbejdsgang til formulering af mRNA-LNP'er og vurderingen af deres ydeevne i celler og dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Oprethold altid RNase-frie forhold, når du formulerer mRNA-LNP'er ved at tørre overfladerne og udstyret af med et overfladedekontaminant til RNaser og DNA. Brug kun RNase-fri spidser og reagenser.
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr ved University of Pennsylvania og en protokol godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pennsylvania.
1. Forberedelse før formulering
- Fyld et rent 4 L bægerglas med 200-300 ml frisk 10x fosfatbufret saltvand (PBS).
- 10x PBS i bægerglasset fortyndes 10 gange med ultrarent vand for at opnå et bægerglas med 1x PBS. Sørg for, at det endelige volumen af 1x PBS er mellem 2-3 L.
- Dialysekassetter (20 kDa afskæring [MWCO] med en molekylvægt på 20 kDa med passende kapacitet til LNP-formuleringen anbringes i det fyldte bægerglas for at hydrere dem.
BEMÆRK: Dialysekassetter kræver mindst 2 minutter at hydrere før brug. - Anbring en rørestang i bægerglasset, og dæk bægerglasset med aluminiumsfolie.
- Det overdækkede bægerglas anbringes på en magnetisk omrøringsplade. Tænd omrøringspladen, og sæt den til at dreje ved 300-400 o / min.
- Fortynd en 100 mM citronsyrebufferbestand (pH 3) 10 gange med ultrarent vand for at skabe den 10 mM citronsyrebuffer, der anvendes til mRNA-fortynding.
- Lav C12-200 ioniserbare lipid-, hjælperlipid-, kolesterol- og lipidforankrede PEG (lipid-PEG) stamopløsninger ved at opløse hvert lipid i 100% ethanol. Koncentrationerne af lipidkomponenterne er beskrevet i tabel 1.
- Stamopløsningerne opvarmes og blandes ved 37 °C for at sikre, at de er helt opløst.
2. Fremstilling af lipid- og nukleinsyreblandingerne
- Beregn de krævede volumener af ioniserbart lipid, hjælperlipid, kolesterol og lipid-PEG baseret på det ønskede molære forhold og ioniserbart lipid til mRNA-vægtforhold (tabel 1). Forbered 10% ekstra volumen af den organiske fase for at tage højde for dødvolumen i sprøjterne under formuleringen.
- Kombiner de beregnede volumener af de forskellige lipidkomponenter i et konisk rør.
- Fortynd lipiderne med 100% ethanol til et endeligt volumen, V, som repræsenterer 25% af det endelige volumen LNP.
- Beregn mængden af mRNA, der kræves til formulering baseret på det ioniserbare lipid til mRNA-vægtforhold og det totale volumen af mRNA-LNP, der er nødvendigt (tabel 1).
- Optø ildfluen luciferase-kodende mRNA på is.
- Fortynd mRNA'et til et endeligt volumen, 3V, tre gange volumenet af den organiske fase i 10 mM citronsyrebuffer.
BEMÆRK: Hvert lipidvolumen, V, skal indeholde nok ioniserbart lipid til mRNA fortyndet i 3V. Dette svarer til det ønskede ioniserbare lipid til mRNA vægtforhold.
3. Mikrofluidisk formulering af mRNA-LNP'er
- Sprøjt en delikat opgaveserviet med et overfladedekontaminant for RNaser og DNA, og tør det indre af det mikrofluidiske instrument grundigt.
- Åbn en ny mikrofluidisk patron, og indsæt den med indløbskanalerne nedad og væk.
- Sørg for, at den koniske rørarm holder to 15 ml koniske rør og er i den position, der er længst til højre.
- Konfigurer to sterile 15 ml koniske rør på holderen med hætterne af.
- Fyld en 5 ml sprøjte med mRNA-opløsningen, der indeholder mRNA fortyndet i 10 mM citronsyrebuffer.
- Fyld en 3 ml sprøjte med lipidopløsningen, der indeholder lipiderne fortyndet i ren 100% ethanol.
- Vip patronholderen på den mikrofluidiske enhed op.
- Indsæt 5 ml sprøjten uden kanylen, der indeholder mRNA, i cylinderampullens venstre indgang.
- Indsæt 3 ml sprøjten uden kanylen, der indeholder lipider, i cylinderampullens højre indgang.
- Vip patronholderen ned igen, og luk låget på det mikrofluidiske instrument.
- Tænd det mikrofluidiske instrument ved hjælp af kontakten bag på instrumentet.
- Vælg Hurtig kørsel.
- Vælg de korrekte sprøjtetyper til de 5 ml og 3 ml sprøjter, der indsættes.
- Parametrene for mRNA-LNP-formulering indtastes ved et 3:1 vandigt til organisk strømningsforhold som beskrevet i tabel 2.
- Tryk på knappen Næste for at gå til næste skærmbillede.
- Bekræft, at de korrekte parametre er indtastet.
- Tryk på Start-knappen for at formulere mRNA-LNP'erne.
4. Behandling efter formulering og karakterisering af mRNA-LNP'erne
- Læg mRNA-LNP'erne opsamlet i det højre koniske rør i de tidligere hydrerede dialysekassetter.
BEMÆRK: Du må ikke punktere eller beskadige kassettens membran, når du lægger mRNA-LNP'erne. Hvis membranen er beskadiget, vil mRNA-LNP'er gå tabt ved belastning.- Dialysekassetterne indeholdende mRNA-LNP'erne hældes tilbage i bægerglasset, der indeholder 1x PBS, og lad dem dialysere i mindst 2 timer.
- Efter dialyse bringes dialysekassetterne indeholdende mRNA-LNP'erne ind i et sterilt biosikkerhedsskab, og mRNA-LNP'erne fjernes ved hjælp af en sprøjte med en nål.
- Sterilfiltrer mRNA-LNP'erne ved hjælp af et 0,22 μm sprøjtefilter, og saml dem i et sterilt konisk rør.
- 65 μL af mRNA-LNP-opløsningen anbringes i et 1,5 ml mikrorør til karakteriseringsformål.
- Fortynd 10 μL mRNA-LNP'er 1:100 i 990 μL 1x PBS i en kuvette til måling af hydrodynamisk størrelse og polydispersitetsindeks ved hjælp af dynamisk lysspredning.
- Vurder koncentrationen og indkapslingseffektiviteten af mRNA-LNP'erne ved hjælp af et fluorescensassay (dvs. RiboGreen).
- Forbered en stamopløsning af 1x TE-buffer ved at fortynde 20x TE-buffer med molekylærbiologisk vand.
- Forbered en stamopløsning af 1% Triton X-100 buffer ved at fortynde Triton X-100 med 1x TE-buffer.
- Det fluorescerende reagens fremstilles ved at fortynde reagenslageret 1:200 med 1x TE-buffer.
- Fortynd mRNA-LNP'erne 1:100 i 1x TE-buffer og 1% Triton X-100-buffer i en sortvægget sortbundet 96-brøndplade i 100 μL.
- Forbered en standardkurve med lavt interval ved at fortynde RNA-standarden i henhold til producentens anvisninger, og plade standardkurven i 96-brøndpladen.
- Der tilsættes 100 μL fortyndet fluorescerende reagens til hvert hul, der indeholder fortyndet mRNA-LNP eller fortyndet standard.
- Placer pladen med 96 brønde i en pladelæser, og ryst i 1 minut efterfulgt af en ventetid på 4 minutter.
- Fluorescensintensiteten af hvert hul måles i henhold til fabrikantens protokol ved en excitation/emission på 480 nm/520 nm.
- Brug standardkurven til at konvertere fluorescensværdierne til koncentrationer.
- Indkapslingseffektiviteten beregnes ved at trække værdien opnået ved fortynding af LNP'er i TE-buffer (uindkapslet mRNA) fra værdien opnået ved fortynding af LNP'er i 1% Triton X-100 (total mRNA) og dividere med værdien opnået ved fortynding af LNP'er i 1% Triton X-100 i henhold til ligning 4.4.
- Beregn mRNA-LNP-koncentrationen anvendt til celle- og dyreforsøg ved at trække værdien opnået ved fortynding af LNP'er i TE-buffer (uindkapslet mRNA) fra værdien opnået ved fortynding af LNP'er i 1% Triton X-100 (total mRNA).
- Mål pKa af mRNA-LNP'erne ved at udføre et 6-(p-toluidino)-2-naphthalensulfonylchlorid (TNS) assay.
- Forbered TNS-reagenset ved at skabe en 0,16 mM opløsning af TNS i ultrarent vand.
BEMÆRK: Når du bruger reagenset, skal du sørge for at holde det på is og væk fra lys for at undgå nedbrydning. - Der fremstilles bufferopløsninger af 150 mM natriumchlorid, 20 mM natriumphosphat, 25 mM ammoniumcitrat og 20 mM ammoniumacetat justeret til forskellige pH-værdier fra 2 til 12 i trin på 0,5.
- Der tilsættes 2,5 μL af LNP til hver pH-justeret bufferopløsning i en sortvægget sortbundet plade med 96 brønde.
- Der tilsættes TNS-reagens til hvert hul, så den endelige TNS-koncentration er 6 μM.
- Inkuber 96-brøndpladen på et mørkt sted i 5 minutter.
- Fluorescensen måles ved en excitation/emission på 322 nm/431 nm ved hjælp af en fluorescenspladelæser.
- Tilpas dataene til en sigmoidal kurve, og beregn pKa ved hjælp af den tilpassede ligning for at finde den pH, hvor 50% af den maksimale intensitet blev observeret.
- Forbered TNS-reagenset ved at skabe en 0,16 mM opløsning af TNS i ultrarent vand.
- Repræsentative resultater for mRNA-LNP hydrodynamisk størrelse, PDI, indkapslingseffektivitet og pKa er vist i tabel 3.
5. In vitro transfektion af HepG2-celler
BEMÆRK: Forskellige andre cellelinjer, såsom HeLa-celler eller HEK-293T-celler, kan anvendes til vurdering af transfektionseffektiviteten af LNP'er in vitro. Alle celler bør testes negative for mycoplasma før LNP-transfektionsundersøgelserne.
- Plade 5.000 HepG2-celler i hver brønd i en hvidvægget klarbundet 96-brøndplade i 100 μL komplet cellekulturmedium (DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin)
- Lad cellerne klæbe natten over i en kontrolleret CO 2 -inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fortynd mRNA-LNP'erne i komplet cellekulturmedium, så den totale dosis leveres i 100 μL.
- Fjern det komplette medium fra brøndene.
- Behandl cellerne med enten mRNA-LNP'er fortyndet i komplet cellekulturmedium ved de ønskede doser eller komplet medium (kontrol).
- Den 96 brønds plade, der indeholder de behandlede celler, anbringes tilbage i den kontrollerede CO2 -inkubator i 24 timer.
- Vurder transfektionseffektiviteten ved at udføre et luciferase-assay.
- Forbered luciferase-reagenset og 1x cellelysebuffer i henhold til producentens anvisninger.
- Tag 96-brøndpladen indeholdende cellerne ud af inkubatoren, og bring den ind i et biosikkerhedsskab.
- Fjern cellekulturmediet fra hver brønd på 96-brøndpladen.
- Der tilsættes 20 μL 1x lysisbuffer til hvert hul efterfulgt af 100 μL af det tidligere fremstillede luciferaseasoreareagens.
- Beskyt pladen mod lys, og placer pladen i en pladelæser for at måle det bioluminescerende signal fra hvert hul.
BEMÆRK: Repræsentative resultater, der demonstrerer behandlingen af HepG2-celler med tidligere formulerede C12-200 mRNA-LNP'er, er vist i figur 1.
6. In vivo-evaluering af mRNA-LNP'er hos mus efter haleveneinjektion
- mRNA-LNP-opløsningen fortyndes med steril 1x PBS, således at 2 μg total mRNA er til stede i et 100 μL haleveneinjektionsvolumen, hvilket svarer til en legemsvægtdosis på ca. 0,1 mg/kg for en 20 g mus.
- Begræns hver mus ved hjælp af en godkendt metode, og tør halen af med en pude fugtet med 70% alkohol.
- Fyld en 29 G insulinsprøjte med enten 100 μL mRNA-LNP (2 μg) eller 100 μL 1x PBS. Fjern eventuelle bobler fra sprøjten.
- Indsæt nålen med skråningen opad i musens laterale halevene, og injicer langsomt 100 μL mRNA-LNP eller 1x PBS.
- Fjern nålen og tryk på, indtil hæmostase er opnået.
- Forbered en stamopløsning af 15 mg/ml d-luciferin kaliumsalt i sterilt 1x PBS 6 timer efter injektion.
- Tænd for in vivo-billedbehandlingssystemet (IVIS), og åbn billedbehandlingssoftwaren.
- Tryk på Initialiser for at forberede instrumentet til dataindsamling.
- Markér afkrydsningsfeltet ud for luminescens, og indstil eksponeringstiden til auto. Sørg for, at det korrekte synsfelt er valgt for antallet af mus, der afbildes.
- Administrer 200 μL d-luciferin intraperitonealt (150 mg luciferin pr. kg legemsvægt) til de tidligere behandlede mus.
- Placer musene i et anæstesikammer indstillet til 2,5% isofluran og en iltstrømningshastighed på 2,0 l / min.
- Vent 10 minutter på, at luciferasesignalet stabiliseres, før du tager billeder af de mRNA-LNP-behandlede mus.
- Sørg for, at musene er fuldt bedøvede, og omdiriger bedøvelseslinjen til at administrere isofluran via næsekegler inde i billeddannelseskammeret.
- Overfør musene til næsekeglerne, og sørg for, at de er på ryggen med deres underliv udsat.
- Luk kammerdøren, og klik på knappen Hent i softwaren for at få bioluminescensbilleder.
BEMÆRK: Repræsentative resultater for helkropsbilleddannelse hos mus efter mRNA-LNP- eller 1X PBS-behandling er vist i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mRNA-LNP'er blev formuleret under anvendelse af et mikrofluidisk instrument, der havde en gennemsnitlig hydrodynamisk diameter på 76, 16 nm og et polydispersitetsindeks på 0, 098. PKa af mRNA-LNP'erne viste sig at være 5,75 ved at udføre et TNS-assay18. Indkapslingseffektiviteten for disse mRNA-LNP'er blev beregnet til at være 92,3% ved anvendelse af det modificerede fluorescensassay og ligning 4,4. Den samlede RNA-koncentration, der blev anvendt til cellebehandling og dosering af dyr, var 40,24 ng/μL. Denne værdi blev opnået fra det modificerede fluorescensassay19, specifikt ved at konvertere fluorescensen opnået ved fortynding af LNP'erne med 1% Triton X-100 og 1x TE-buffer til visse koncentrationer og beregning af mængden af indkapslet mRNA.
Ligning 4.4
CTX = Koncentration af mRNA fra LNP'er fortyndet i 1% Triton X-100
C TE = Koncentration af mRNA fra LNP'er fortyndet i 1x TE-buffer
Stigende bioluminescens blev observeret med stigende doser ved behandling af 5.000 HepG2-celler pr. brønd med forskellige doser mRNA-LNP. Luciferaseekspression blev let detekteret ved den laveste dosis (5 ng/brønd), der blev anvendt i dette studie. Imidlertid kan andre cellelinjer kræve forskellige mængder mRNA-LNP for let at se forskelle i luminescens på tværs af doser.
Mus blev behandlet med 2 μg mRNA-LNP og vurderet 6 timer senere for helkropsbioluminescens. Da C12-200 mRNA-LNP'er overvejende transfekterer leveren20, blev der observeret et stærkt bioluminescerende signal i den øvre del af maven hos de mus, der blev behandlet med vores formulerede LNP'er. Ved hjælp af billeddannelsessoftwaren blev interesseområder tegnet omkring leversignalerne for at beregne den samlede selvlysende flux. I dette eksperiment var den totale selvlysende flux ca. 5 x 109, hvilket er i overensstemmelse med andre undersøgelser udført med denne LNP-formulering 4,21.
Tabel 1: Organisk fasesammensætning. Koncentrationerne af de enkelte lipidstamopløsninger og de volumener, som hver komponent bidrager med til den organiske fase på 1,3 ml, beskrives. Lipider kombineres i et molært forhold på 35/16/46,5/2,5 (C12-200: DOPE: Kolesterol: C14-PEG2000). En 10% ekstra mængde blev forberedt for at tage højde for sprøjtedøde mængder under formuleringen. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Mikrofluidiske instrumentindstillinger for mRNA-LNP-formulering ved et 3: 1 vandigt til organisk strømningshastighedsforhold. 5 ml sprøjten indeholdende mRNA fortyndet i 10 mM citronsyrebuffer blev indsat i midterkanalen, mens 3 ml sprøjten indeholdende lipider blev indsat i højre kanal. LNP'er blev formuleret ved et vægtforhold på 10: 1 ioniserbart lipid: mRNA. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: mRNA-LNP-karakteriseringsdata bestemt ved dynamisk lysspredning, et modificeret fluorescensassay og et 2-(p-toluidino) naphthalen-6-sulfonsyre (TNS) assay. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 1: HepG2-celler behandlet med firefly luciferase mRNA-LNP. Samlet set blev 5.000 HepG2-celler podet pr. brønd i en 96-brøndplade og fik lov til at klæbe natten over. Cellerne blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Cellekulturmediet blev fjernet, før cellerne blev behandlet med 5 ng, 10 ng og 20 ng doser af en C12-200-holdig LNP-formulering, der indkapsler firefly luciferase-kodende mRNA (i 100 μL cellekulturmedium). Ved 24 timer efter behandling blev cellekulturmediet fjernet, og 20 μL 1x lysisbuffer blev tilsat cellerne før tilsætning af 100 μL luciferase assayreagens. Bioluminescensen fra hver brønd blev målt ved hjælp af en pladelæser efter en inkubationsperiode på 5 minutter. Foldforøgelserne plottes i forhold til kontrolbrønde, der bestod af ubehandlede HepG2-celler. Den statistiske signifikans blev evalueret ved hjælp af en envejs ANOVA med post-hoc Tukeys test. ns, ikke signifikant; , p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: C57BL/6 mus behandlet med ildflue luciferase mRNA-LNP. I dette arbejde blev 2 μg total mRNA-LNP i 100 μL eller 100 μL 1x PBS administreret til C57BL/6 mus via den laterale halevene. (A) Helkropsbioluminescens hos de mus, der blev behandlet med enten mRNA-LNP eller 1X PBS, blev målt ved hjælp af in vivo imaging system (IVIS) 6 timer efter administration. IVIS Spectrum Living Image-softwaren blev brugt til at analysere og erhverve helkropsbillederne. N = 3. (B) Den totale selvlysende strøm blev kvantificeret og plottet. Den statistiske signifikans blev evalueret ved hjælp af en tohalet elevs t-test. **, p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med denne arbejdsgang kan en række mRNA-LNP'er formuleres og testes for deres in vitro- og in vivo-effektivitet. Ioniserbare lipider og hjælpestoffer kan udskiftes og kombineres ved forskellige molære forhold og forskellige ioniserbare lipid til mRNA-vægtforhold for at producere mRNA-LNP'er med forskellige fysisk-kemiske egenskaber22. Her formulerede vi C12-200 mRNA-LNP'er med et molært forhold på 35/16/46,5/2,5 (ioniserbart lipid:hjælperlipid:kolesterol:lipid-PEG) ved et 10:1 ioniserbart lipid til mRNA vægtforhold. Disse LNP'er blev testet for deres transfektionseffektivitet in vitro i HepG2-celler og in vivo i C57BL/6-mus. C12-200 mRNA-LNP'erne blev syntetiseret ved mikrofluidisk blanding under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt mikrofluidisk instrument. Selvom andre formuleringsmetoder kan bruges til at formulere LNP'er, såsom pipetteblanding eller T-krydsblanding 4, formulerer mikrofluidisk blanding mRNA-LNP'er, der generelt er mindre, mindre polydisperse og har højere indkapslingseffektivitet 4,13,23,24.
Formuleringen af mRNA-LNP'er med det kommercielt tilgængelige mikrofluidiske instrument muliggør en enkel og fleksibel formulering af LNP'er. Strømningshastigheden i begyndelsen af en løbetur varierer fra den indstillede målstrømningshastighed, efterhånden som sprøjteskubberne accelererer til fuld hastighed. Dette kan føre til variable partikelegenskaber og inkonsekvente resultater. For at overvinde dette blev det mikrofluidiske instrument designet til at indsamle LNP'er, der er formuleret i starten og slutningen af en formulering, som affald separat fra LNP'erne formuleret ved stationære forhold. Dette kan reducere polydispersiteten og føre til mere konsistente partikelegenskaber. Startaffaldet kan beregnes ud fra kombinationen af sprøjter, der anvendes til formulering i henhold til producentens manual. Slutaffaldet oplever imidlertid ikke den samme grad af ikke-stabile strømningsforhold, så volumenet indstilles ofte til 0,05 ml for alle sprøjtekombinationer i henhold til producentens anbefaling.
Det er afgørende at tage højde for dødvolumen i sprøjter og rør, når de korrekte volumener af de organiske og vandige faser tilberedes. Forberedelse af 10% ekstra volumen af hver fase sikrer, at det ønskede minimumsvolumen LNP kan formuleres. I denne protokol blev et samlet formuleringsvolumen på 4,7 ml tilført med 0,7 ml affald, hvilket resulterede i 4 ml LNP indsamlet under stationære forhold. Imidlertid blev 1,3 ml af den organiske fase og 3,9 ml af den vandige fase forberedt til formulering. Dette sikrer, at 5 ml sprøjten kan fyldes op til 3,6 ml mærket, og 3 ml sprøjten kan fyldes op til 1,2 ml mærket. Hvis volumenet når mærkerne på sprøjterne, er volumenspecifikationerne, der anvendes på det mikrofluidiske instrument, sikre indgange. Den sidste skærm, før du trykker på "START" -knappen, er afgørende for at sikre, at alle parametre er korrekte. Det er vigtigt at foretage en endelig kontrol af sprøjtetyperne, mængderne i sprøjterne, de mængder, der skal dispenseres, sprøjtens placering og strømningshastighederne.
Efter formuleringen af mRNA-LNP'er har dialysetrinnet et par vigtige overvejelser at huske på. De anvendte dialysekassetter kræver en minimumshydreringstid på 2 minutter, før LNP'erne kan påfyldes. Dette øger membranens fleksibilitet og gør det muligt for membranen at justere lettere, når prøven tilsættes. Derudover skal man passe på ikke at beskadige eller punktere membranerne i dialysekassetterne, mens de lægges med mRNA-LNP'er. Hvis membranerne bliver punkteret eller beskadiget, kan de formulerede mRNA-LNP'er let gå tabt ved belastning.
I denne protokol testede vi in vitro-effektiviteten af mRNA-LNP'er i HepG2-celler. Imidlertid kan andre celletyper testes for mRNA-LNP-transfektionseffektivitet. Hvis der anvendes ikke-klæbende celler, skal 96-brøndpladen centrifugeres ved 500 g i 5 minutter, før cellekulturmedietfjernes 25. Dette minimerer ethvert tab af celler under mediefjernelsen. Cellerne bør også testes for tilstedeværelse af mycoplasma forud for eventuelle LNP-transfektionsundersøgelser. Det vil være vanskeligt at opnå konsistente resultater og sammenligne forskellige LNP-formuleringer, hvis cellerne testes positive for mycoplasma. Derudover kan primære celler kræve højere doser LNP for at måle transfektion uden toksicitet sammenlignet med cellelinjer. Et luciferase-baseret levedygtighedsassay kan anvendes til at evaluere mRNA-LNP-toksiciteten in vitro ved varierende doser i både primære celler og cellelinjer18.
Et af de vigtigste trin i at opnå konsistente bioluminescensmålinger på tværs af forskellige mus efter behandling med den samme mRNA-LNP-formulering er at sikre, at tiden mellem intraperitoneal injektion af d-luciferin og IVIS-målingen er konsistent26. Dette tidsinterval påvirker stabiliteten af det opnåede bioluminescerende signal. Tidsintervallet skal være langt nok, så eventuelle udsving i signalet minimeres. Et indledende forsøg kan køres, hvor musene er afbildet hvert minut efter d-luciferin injektion. Tidsintervallet, når signalet begynder at plateau, er det, der er bedst egnet til transfektionseksperimentet. I denne protokol tillod et interval på 10 minutter stabile luminescenssignaler efter injektionen med 150 mg d-luciferin/kg legemsvægt, som almindeligvis udføres til billeddannelse27,28.
Derudover er den mRNA-LNP-dosis, der anvendes i denne protokol (0,1 mg mRNA/kg legemsvægt), lille sammenlignet med de doser, der anvendes til at vurdere toksicitet og terapeutisk effekt29,30. Disse mindre doser hjælper med at evaluere forskelle i styrken af unikke mRNA-LNP-formuleringer, mens de ikke overmætter det opnåede selvlysende signal. Denne dosis kan dog øges for at måle den potentielle mRNA-LNP-toksicitet. For eksempel kan levertoksicitet evalueres ved at kvantificere niveauerne af alanintransaminase, aspartattransaminase og alkalisk fosfatase i serum på forskellige tidspunkter efter mRNA-LNP-injektion31,32,33. Disse enzymer findes normalt i lave niveauer i serumet, men øges som følge af leverskader. Kommercielt tilgængelige kits kan bruges til at kvantificere mængden af disse enzymer i serumet.
I dette eksempel brugte vi firefly luciferase-kodende mRNA, men andre reporter-mRNA'er kan formuleres i LNP'er for at vurdere styrke. mRNA'er, der koder for grønt fluorescerende protein (GFP) eller mCherry, kan anvendes til at undersøge cellespecifik levering efter mRNA-LNP-behandling34,35. En enkeltcellesuspension kan fremstilles af væv af interesse, og GFP + eller mCherry + celler kan vurderes ved flowcytometrianalyse. Derudover kan mRNA-LNP'er formuleres med mRNA-kodning for erythropoietin for at måle levertransfektion gennem sekretion af erythropoietin i serum 8,36,37. I Ai9-mus inducerer leveringen af mRNA-kodende Cre-rekombinase robust tdTomatfluorescens, som kan tjene som en anden metode til undersøgelse af mRNA-LNP-levering til forskellige cellepopulationer38,39,40. Gennem demonstrationen af denne arbejdsgang er det vores håb, at mRNA-LNP-formulering ophører med at være en barriere for efterforskere, når de udforsker nye ideer og muligheder for mRNA-terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
M.J.M. anerkender støtte fra en US National Institutes of Health (NIH) Director's New Innovator Award (DP2 TR002776), en Burroughs Wellcome Fund Career Award ved Scientific Interface (CASI), en US National Science Foundation CAREER-pris (CBET-2145491) og yderligere finansiering fra National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 og NIDDK R01 DK123049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
