Summary
Här presenteras ett protokoll för att formulera lipidnanopartiklar (LNP) som kapslar in mRNA som kodar för eldflugeluciferas. Dessa LNP:er testades för sin styrka in vitro i HepG2-celler och in vivo i C57BL/6-möss.
Abstract
Lipidnanopartiklar (LNP) har väckt stor uppmärksamhet på senare tid i och med den framgångsrika utvecklingen av mRNA-vaccinerna mot covid-19 av Moderna och Pfizer/BioNTech. Dessa vacciner har visat effekten av mRNA-LNP-terapier och öppnat dörren för framtida kliniska tillämpningar. I mRNA-LNP-system fungerar LNP:erna som leveransplattformar som skyddar mRNA-lasten från nedbrytning av nukleaser och förmedlar deras intracellulära leverans. LNP:erna består vanligtvis av fyra komponenter: en joniserbar lipid, en fosfolipid, kolesterol och ett lipidförankrat polyetylenglykolkonjugat (PEG) (lipid-PEG). Här formuleras LNP:er som kapslar in mRNA-kodande eldflugeluciferas genom mikrofluidisk blandning av den organiska fasen som innehåller LNP-lipidkomponenter och den vattenhaltiga fasen som innehåller mRNA. Dessa mRNA-LNP:er testas sedan in vitro för att utvärdera deras transfektionseffektivitet i HepG2-celler med hjälp av en bioluminescerande plattbaserad analys. Dessutom utvärderas mRNA-LNPs in vivo i C57BL/6-möss efter en intravenös injektion via den laterala svansvenen. Helkroppsbioluminiscensavbildning utförs med hjälp av ett in vivo-avbildningssystem . Representativa resultat visas för mRNA-LNP-egenskaperna, deras transfektionseffektivitet i HepG2-celler och det totala luminescerande flödet i C57BL/6-möss.
Introduction
Lipidnanopartiklar (LNP) har visat sig vara mycket lovande under de senaste åren inom området icke-viral genterapi. År 2018 godkände USA:s Food and Drug Administration (FDA) den första RNA-interferensterapin (RNAi) någonsin, Onpattro by Alnylam, för behandling av ärftlig transtyretinamyloidos 1,2,3,4. Detta var ett viktigt steg framåt för lipidnanopartiklar och RNA-baserade terapier. Nyligen fick Moderna och Pfizer/BioNTech FDA-godkännanden för sina mRNA-LNP-vacciner mot SARS-CoV-2 4,5. I var och en av dessa LNP-baserade nukleinsyraterapier tjänar LNP till att skydda sin last från nedbrytning av nukleaser och underlätta potent intracellulär leverans 6,7. Medan LNP:er har haft framgång inom RNAi-terapier och vaccintillämpningar, har mRNA-LNP:er också undersökts för användning i proteinersättningsterapier8 samt för samleverans av Cas9-mRNA och guide-RNA för leverans av CRISPR-Cas9-systemet för genredigering9. Det finns dock ingen specifik formulering som är väl lämpad för alla applikationer, och subtila förändringar i LNP-formuleringsparametrarna kan i hög grad påverka styrkan och biodistributionen in vivo 8,10,11. Därför måste enskilda mRNA-LNP:er utvecklas och utvärderas för att bestämma den optimala formuleringen för varje LNP-baserad terapi.
LNP formuleras vanligen med fyra lipidkomponenter: en joniserbar lipid, en fosfolipid, kolesterol och ett lipidförankrat polyetylenglykolkonjugat (PEG) (lipid-PEG)11,12,13. Den potenta intracellulära tillförseln som underlättas av LNP är delvis beroende av den joniserbara lipidkomponenten12. Denna komponent är neutral vid fysiologiskt pH men blir positivt laddad i den sura miljön i endosom11. Denna förändring i jonisk laddning tros vara en viktig bidragande orsak till endosomal flykt12,14,15. Förutom den joniserbara lipiden förbättrar fosfolipidkomponenten (hjälplipid) inkapslingen av lasten och hjälper till med endosomal flykt, kolesterolet erbjuder stabilitet och förbättrar membranfusionen, och lipid-PEG minimerar LNP-aggregering och opsonisering i cirkulationen10,11,14,16. För att formulera LNP kombineras dessa lipidkomponenter i en organisk fas, vanligtvis etanol, och blandas med en vattenfas som innehåller nukleinsyralasten. LNP-formuleringsprocessen är mycket mångsidig genom att den gör det möjligt att enkelt substituera och kombinera olika komponenter vid olika molförhållanden för att formulera många LNP-formuleringar med en mängd fysikalisk-kemiska egenskaper10,17. Men när man utforskar detta stora utbud av LNP:er är det avgörande att varje formulering utvärderas med hjälp av en standardiserad procedur för att noggrant mäta skillnaderna i karakterisering och prestanda.
Här beskrivs det fullständiga arbetsflödet för formulering av mRNA-LNP:er och bedömningen av deras prestanda i celler och djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Upprätthåll alltid RNas-fria förhållanden vid formulering av mRNA-LNP:er genom att torka av ytor och utrustning med en ytdekontaminering för RNaser och DNA. Använd endast RNase-fria spetsar och reagenser.
Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur vid University of Pennsylvania och ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Pennsylvania.
1. Förberedelse före formulering
- Fyll en ren 4 L bägare med 200-300 ml färsk 10x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Späd 10x PBS i bägaren 10-faldigt med ultrarent vatten för att få en bägare på 1x PBS. Se till att den slutliga volymen av 1x PBS är mellan 2-3 L.
- Placera dialyskassetter (20 kDa molekylviktsgräns [MWCO]) med lämplig kapacitet för LNP-formuleringen i den fyllda bägaren för att återfukta dem.
OBS: Dialyskassetter kräver minst 2 minuter för att hydrera före användning. - Placera en omrörningsstång i bägaren och täck bägaren med aluminiumfolie.
- Placera den täckta bägaren på en magnetisk omrörningsplatta. Slå på omrörningsplattan och ställ in den så att den snurrar med 300-400 rpm.
- Späd ett 100 mM citronsyrabuffertlager (pH 3) 10-faldigt med ultrarent vatten för att skapa den 10 mM citronsyrabuffert som används för mRNA-utspädning.
- Gör C12-200 joniserbara lipider, hjälplipider, kolesterol och lipidförankrade PEG (lipid-PEG) stamlösningar genom att lösa upp varje lipid i 100 % etanol. Koncentrationerna av lipidkomponenterna anges i tabell 1.
- Värm stamlösningarna vid 37 °C för att säkerställa att de är helt upplösta.
2. Beredning av lipid- och nukleinsyrablandningar
- Beräkna erforderliga volymer av joniserbar lipid, hjälparlipid, kolesterol och lipid-PEG baserat på önskat molförhållande och joniserbart lipid-mRNA-viktförhållande (tabell 1). Förbered 10 % extra volym av den organiska fasen för att ta hänsyn till dödvolymen i sprutorna under beredningen.
- Kombinera de beräknade volymerna av de olika lipidkomponenterna i ett koniskt rör.
- Späd lipiderna med 100 % etanol till en slutlig volym, V, som representerar 25 % av den slutliga volymen LNP.
- Beräkna mängden mRNA som krävs för formulering baserat på viktförhållandet mellan joniserbara lipider och mRNA och den totala volymen mRNA-LNP som behövs (tabell 1).
- Tina eldflugans luciferaskodande mRNA på is.
- Späd mRNA till en slutlig volym, 3V, tre gånger volymen av den organiska fasen, i 10 mM citronsyrabuffert.
OBS: Varje lipidvolym, V, måste innehålla tillräckligt med joniserbar lipid för mRNA utspätt i 3V. Detta motsvarar det önskade förhållandet mellan joniserbar lipid och mRNA-vikt.
3. Mikrofluidisk formulering av mRNA-LNP
- Spraya en delikat arbetsservett med ett ytdekontaminerande ämne för RNaser och DNA, och torka av insidan av mikrofluidinstrumentet noggrant.
- Öppna en ny mikrofluidisk patron och sätt in den med inloppskanalerna nedåt och bort.
- Se till att den koniska rörarmen rymmer två 15 ml koniska rör och är i läget längst till höger.
- Konfigurera två sterila 15 ml koniska rör på hållaren med locken av.
- Fyll en 5 ml spruta med mRNA-lösningen som innehåller mRNA utspätt i 10 mM citronsyrabuffert.
- Fyll en 3 ml spruta med lipidlösningen som innehåller lipiderna utspädda i ren 100% etanol.
- Fäll upp patronhållaren på mikrofluidenheten.
- För in 5 ml-sprutan, utan nål, som innehåller mRNA i det vänstra inloppet på cylinderampullen.
- Sätt in den 3 ml stora sprutan, utan nål, som innehåller lipider i det högra inloppet på cylinderampullen.
- Fäll tillbaka patronhållaren och stäng locket på det mikrofluidiska instrumentet.
- Slå på mikrofluidikinstrumentet med hjälp av omkopplaren på baksidan av instrumentet.
- Välj Snabbkörning.
- Välj rätt spruttyp för de 5 ml och 3 ml sprutor som sätts in.
- Mata in parametrarna för mRNA-LNP-formulering vid ett förhållande mellan vattenhaltigt och organiskt flöde på 3:1 enligt beskrivningen i tabell 2.
- Tryck på knappen Nästa för att gå till nästa skärm.
- Bekräfta att rätt parametrar har matats in.
- Tryck på Start-knappen för att formulera mRNA-LNP:erna.
4. Bearbetning och karakterisering av mRNA-LNP:er efter formulering
- Ladda mRNA-LNP:erna som samlats i det högra koniska röret i de tidigare hydratiserade dialyskassetterna.
OBS: Punktera eller skada inte kassettens membran när du laddar mRNA-LNP:erna. Om membranet skadas kommer mRNA-LNP:er att gå förlorade vid laddning.- Sätt tillbaka dialyskassetterna som innehåller mRNA-LNP:erna i bägaren som innehåller 1x PBS och låt dem dialysera i minst 2 timmar.
- Efter dialysen, ta med dialyskassetterna som innehåller mRNA-LNP:erna till ett sterilt biosäkerhetsskåp och ta bort mRNA-LNP:erna med en spruta med en nål.
- Sterilfiltrera mRNA-LNP:erna med ett 0,22 μm sprutfilter och samla upp dem i ett sterilt koniskt rör.
- Placera 65 μl av mRNA-LNP-lösningen i ett 1,5 ml mikrorör för karakteriseringsändamål.
- Späd 10 μl mRNA-LNPs 1:100 i 990 μL 1x PBS i en kyvett för mätning av hydrodynamisk storlek och polydispersitetsindex med hjälp av dynamisk ljusspridning.
- Bedöm koncentrationen och inkapslingseffektiviteten hos mRNA-LNP:erna med hjälp av en fluorescensanalys (dvs. RiboGreen).
- Bered en stamlösning av 1x TE-buffert genom att späda 20x TE-buffert med molekylärbiologiskt vatten.
- Bered en stamlösning av 1 % Triton X-100-buffert genom att späda Triton X-100 med 1 x TE-buffert.
- Bered det fluorescerande reagenset genom att späda reagensmaterialet 1:200 med 1x TE-buffert.
- Späd mRNA-LNP:erna 1:100 i 1x TE-buffert och 1 % Triton X-100-buffert i en svartväggig 96-hålsplatta i 100 μL.
- Bered en lågintervalls standardkurva genom att späda ut RNA-standarden enligt tillverkarens instruktioner och plätera standardkurvan i 96-hålsplattan.
- Tillsätt 100 μl utspätt fluorescerande reagens till varje brunn som innehåller utspädd mRNA-LNP eller utspädd standard.
- Placera plattan med 96 brunnar i en plattläsare och skaka i 1 minut, följt av 4 minuters väntan.
- Mät fluorescensintensiteten för varje brunn enligt tillverkarens protokoll vid en excitation/emission på 480 nm/520 nm.
- Använd standardkurvan för att omvandla fluorescensvärdena till koncentrationer.
- Beräkna inkapslingseffektiviteten genom att subtrahera det värde som erhålls från utspädning av LNP:er i TE-buffert (oinkapslad mRNA) från det värde som erhålls från utspädning av LNP:er i 1 % Triton X-100 (totalt mRNA) och dividera med det värde som erhålls från utspädning av LNP:er i 1 % Triton X-100, enligt ekvation 4.4.
- Beräkna mRNA-LNP-koncentrationen som används för cell- och djurstudier genom att subtrahera det värde som erhålls från utspädning av LNP i TE-buffert (oinkapslat mRNA) från det värde som erhålls från utspädning av LNP i 1 % Triton X-100 (totalt mRNA).
- Mät pKa för mRNA-LNP:erna genom att utföra en 6-(p-toluidin)-2-naftalensulfonylklorid (TNS) analys.
- Bered TNS-reagenset genom att skapa en 0,16 mM lösning av TNS i ultrarent vatten.
OBS: När du använder reagenset, se till att hålla det på is och borta från ljus för att undvika nedbrytning. - Bered buffrade lösningar av 150 mM natriumklorid, 20 mM natriumfosfat, 25 mM ammoniumcitrat och 20 mM ammoniumacetat justerade till olika pH-värden från 2 till 12 i steg om 0,5.
- Tillsätt 2,5 μL LNP till varje pH-justerad buffertlösning i en svartväggig 96-hålsplatta med svart botten.
- Tillsätt TNS-reagens till varje brunn så att den slutliga TNS-koncentrationen är 6 μM.
- Inkubera plattan med 96 brunnar på en mörk plats i 5 minuter.
- Mät fluorescensen vid en excitation/emission på 322 nm/431 nm med hjälp av en fluorescensplattläsare.
- Anpassa data till en sigmoidal kurva och beräkna pKa med hjälp av den anpassade ekvationen för att hitta det pH vid vilket 50 % av den maximala intensiteten observerades.
- Bered TNS-reagenset genom att skapa en 0,16 mM lösning av TNS i ultrarent vatten.
- Representativa resultat för mRNA-LNP-hydrodynamisk storlek, PDI, inkapslingseffektivitet och pKa visas i tabell 3.
5. In vitro-transfektion av HepG2-celler
OBS: Olika andra cellinjer, såsom HeLa-celler eller HEK-293T-celler, kan användas för att bedöma transfektionseffektiviteten hos LNP:er in vitro. Alla celler bör testas negativt för mykoplasma före LNP-transfektionsstudierna.
- Platta 5 000 HepG2-celler i varje brunn i en vitväggig klarbottenplatta med 96 brunnar i 100 μl komplett cellodlingsmedium (DMEM kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin)
- Låt cellerna fästa över natten i en kontrollerad CO 2 -inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 .
- Späd mRNA-LNP:erna i ett komplett cellodlingsmedium så att den totala dosen levereras i 100 μL.
- Ta bort hela mediet från brunnarna.
- Behandla cellerna med antingen mRNA-LNP utspädda i komplett cellodlingsmedium i önskade doser eller helmedium (kontroll).
- Placera tillbaka 96-hålsplattan med de behandlade cellerna i den kontrollerade CO2 -inkubatorn i 24 timmar.
- Bedöm transfektionseffektiviteten genom att utföra en luciferasanalys.
- Förbered luciferasreagenset och 1x celllysbufferten enligt tillverkarens instruktioner.
- Ta ut plattan med 96 brunnar som innehåller cellerna från inkubatorn och ta med den till ett biosäkerhetsskåp.
- Ta bort cellodlingsmediet från varje brunn på plattan med 96 brunnar.
- Tillsätt 20 μl 1x lysbuffert till varje brunn, följt av 100 μl av det tidigare beredda luciferasanalysreagenset.
- Skydda plattan från ljus och placera plattan i en plattläsare för att mäta den bioluminescerande signalen från varje brunn.
OBS: Representativa resultat som visar behandling av HepG2-celler med tidigare formulerade C12-200 mRNA-LNP:er visas i figur 1.
6. In vivo-utvärdering av mRNA-LNP hos möss efter injektion av svansvenen
- Späd mRNA-LNP-lösningen med steril 1x PBS så att 2 μg totalt mRNA finns i en 100 μl injektionsvolym i svansvenen, vilket motsvarar en kroppsviktsdos på cirka 0,1 mg/kg för en 20 g mus.
- Spänn fast varje mus med en godkänd metod och torka av svansen med en dyna fuktad med 70 % alkohol.
- Fyll en 29 G insulinspruta med antingen 100 μL mRNA-LNP (2 μg) eller 100 μL 1x PBS. Ta bort eventuella bubblor från sprutan.
- Stick in nålen med avfasningen uppåt i musens laterala svansven och injicera långsamt 100 μL mRNA-LNP eller 1x PBS.
- Ta bort nålen och tryck tills hemostas uppnås.
- Bered en stamlösning av 15 mg/ml d-luciferin kaliumsalt i steril 1x PBS 6 timmar efter injektionen.
- Slå på in vivo-bildsystemet (IVIS) och öppna bildbehandlingsprogrammet.
- Tryck på Initiera för att förbereda instrumentet för datainsamling.
- Markera rutan bredvid luminiscens och ställ in exponeringstiden på auto. Se till att rätt synfält är valt för antalet möss som avbildas.
- Administrera 200 μl d-luciferin intraperitonealt (150 mg luciferin per kg kroppsvikt) till de tidigare behandlade mössen.
- Placera mössen i en anestesikammare inställd på 2,5 % isofluran och ett syreflöde på 2,0 l/min.
- Vänta 10 minuter tills luciferassignalen har stabiliserats innan du avbildar de mRNA-LNP-behandlade mössen.
- Se till att mössen är helt bedövade och omdirigera anestesislangen för att administrera isofluran via näskoner inuti avbildningskammaren.
- Överför mössen till näskottarna och se till att de ligger på rygg med buken exponerad.
- Stäng kammardörren och klicka på knappen Hämta i programvaran för att få bioluminiscensbilder.
OBS: Representativa resultat för helkroppsavbildning på möss efter mRNA-LNP- eller 1X PBS-behandling visas i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mRNA-LNP:er formulerades med hjälp av ett mikrofluidiskt instrument som hade en genomsnittlig hydrodynamisk diameter på 76,16 nm och ett polydispersitetsindex på 0,098. PKa för mRNA-LNP:erna befanns vara 5,75 genom att utföra en TNS-analys18. Inkapslingseffektiviteten för dessa mRNA-LNP:er beräknades till 92,3 % med hjälp av den modifierade fluorescensanalysen och ekvation 4.4. Den totala RNA-koncentrationen som användes för cellbehandling och djurdosering var 40,24 ng/μL. Detta värde erhölls från den modifierade fluorescensanalysen19, särskilt genom att omvandla fluorescensen som erhölls genom att späda LNP:erna med 1 % Triton X-100 och 1x TE-buffert till vissa koncentrationer och beräkna mängden inkapslat mRNA.
Ekvation 4.4
CTX = Koncentration av mRNA från LNP utspätt i 1% Triton X-100
C TE = Koncentration av mRNA från LNP utspätt i 1x TE-buffert
Ökande bioluminiscens observerades med ökande doser vid behandling av 5 000 HepG2-celler per brunn med olika doser av mRNA-LNP. Luciferasuttryck var lätt att upptäcka vid den lägsta dosen (5 ng/brunn) som användes i denna studie. Andra cellinjer kan dock kräva olika mängder mRNA-LNP för att lätt se skillnader i luminiscens mellan olika doser.
Mössen behandlades med 2 μg mRNA-LNP och bedömdes 6 timmar senare med avseende på helkroppsbioluminiscens. Eftersom C12-200 mRNA-LNP:er huvudsakligen transfekterade levern20, observerades en stark bioluminescerande signal i övre delen av buken hos de möss som behandlades med våra formulerade LNP:er. Med hjälp av avbildningsprogrammet ritades intressanta områden runt leversignalerna för att beräkna det totala luminescerande flödet. I detta experiment var det totala luminescerande flödet cirka 5 x 109, vilket överensstämmer med andra studier som utförts med denna LNP-formulering 4,21.
Tabell 1: Organisk fassammansättning. Koncentrationerna av de enskilda lipidstamlösningarna och de volymer som varje komponent bidrar med till den organiska fasen på 1,3 ml beskrivs. Lipider kombineras i ett molförhållande på 35/16/46,5/2,5 (C12-200:DOPE:Kolesterol:C14-PEG2000). En extra volym på 10 % förbereddes för att ta hänsyn till sprutornas döda volymer under formuleringen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Mikrofluidiska instrumentinställningar för mRNA-LNP-formulering vid ett förhållande mellan 3:1 vattenhaltigt och organiskt flöde. Sprutan på 5 ml innehållande mRNA utspädd i 10 mM citronsyrabuffert sattes in i mittkanalen, medan sprutan på 3 ml som innehöll lipider sattes in i den högra kanalen. LNP formulerades med ett viktförhållande på 10:1 av joniserbar lipid:mRNA. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: mRNA-LNP-karakteriseringsdata bestämda genom dynamisk ljusspridning, en modifierad fluorescensanalys och en 2-(p-toluidin) naftalen-6-sulfonsyra (TNS)-analys. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Figur 1: HepG2-celler behandlade med eldflugans luciferas mRNA-LNP. Totalt såddes 5 000 HepG2-celler per brunn i en platta med 96 brunnar och fick fästa över natten. Cellerna odlades i DMEM kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin. Cellodlingsmediet avlägsnades innan cellerna behandlades med doser på 5 ng, 10 ng och 20 ng av en C12-200-innehållande LNP-formulering som kapslar in eldflugans luciferaskodande mRNA (i 100 μL cellodlingsmedium). 24 timmar efter behandlingen avlägsnades cellodlingsmediet och 20 μL 1x lysbuffert tillsattes till cellerna innan 100 μL luciferasanalysreagens tillsattes. Bioluminiscensen från varje brunn mättes med hjälp av en plattläsare efter en inkubationstid på 5 minuter. Veckökningarna plottas i förhållande till kontrollbrunnar som bestod av obehandlade HepG2-celler. Den statistiska signifikansen utvärderades med hjälp av en envägs ANOVA med post-hoc Tukeys test. ns, inte signifikant; , s < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: C57BL/6-möss behandlade med eldflugeluciferas-mRNA-LNP. I detta arbete administrerades 2 μg totalt mRNA-LNP i 100 μL eller 100 μL 1x PBS till C57BL/6-möss via den laterala svansvenen. (A) Helkroppsbioluminiscens hos möss som behandlades med antingen mRNA-LNP eller 1X PBS mättes med hjälp av in vivo imaging system (IVIS) 6 timmar efter administrering. Programvaran IVIS Spectrum Living Image användes för att analysera och samla in helkroppsbilderna. N = 3. (B) Det totala luminescerande flödet kvantifierades och plottades. Den statistiska signifikansen utvärderades med hjälp av ett tvåsidigt studenttest. **, p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med detta arbetsflöde kan en mängd olika mRNA-LNP:er formuleras och testas för deras effektivitet in vitro och in vivo. Joniserbara lipider och hjälpämnen kan bytas ut och kombineras vid olika molarförhållanden och olika viktförhållanden mellan joniserbara lipider och mRNA för att producera mRNA-LNP med olika fysikalisk-kemiska egenskaper22. Här formulerade vi C12-200 mRNA-LNPs med ett molarförhållande på 35/16/46,5/2,5 (joniserbar lipid:hjälparlipid:kolesterol:lipid-PEG) vid ett 10:1 joniserbart lipid- till mRNA-viktförhållande. Dessa LNP:er testades för sin transfektionseffektivitet in vitro i HepG2-celler och in vivo i C57BL/6-möss. C12-200 mRNA-LNP:erna syntetiserades genom mikrofluidisk blandning med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt mikrofluidiskt instrument. Även om andra formuleringsmetoder kan användas för att formulera LNP:er, såsom pipettblandning eller T-korsningsblandning 4, formulerar mikrofluidisk blandning mRNA-LNP:er som i allmänhet är mindre, mindre polydispersiva och har högre inkapslingseffektivitet 4,13,23,24.
Formuleringen av mRNA-LNP:er med det kommersiellt tillgängliga mikrofluidikinstrumentet möjliggör enkel och flexibel formulering av LNP:er. Flödeshastigheten i början av en körning varierar från den målflödeshastighet som ställts in när sprutknapparna accelererar till full hastighet. Detta kan leda till varierande partikelegenskaper och inkonsekventa resultat. För att övervinna detta utformades mikrofluidikinstrumentet för att samla in LNP:erna som formulerats i början och slutet av en formulering som avfall separat från LNP:erna som formulerats vid steady-state-förhållanden. Detta kan minska polydispersiteten och leda till mer konsekventa partikelegenskaper. Startavfallet kan beräknas baserat på den kombination av sprutor som används för formulering enligt tillverkarens manual. Slutavfallet upplever dock inte samma grad av icke-stationära flödesförhållanden, så volymen är ofta inställd på 0,05 ml för alla sprutkombinationer enligt tillverkarens rekommendation.
Det är viktigt att ta hänsyn till dödvolymen i sprutor och rör när man bereder rätt volymer av de organiska faserna och vattenfaserna. Att förbereda 10 % extra volym av varje fas säkerställer att den minsta volymen LNP som önskas kan formuleras. I detta protokoll matades en total formuleringsvolym på 4,7 ml in med 0,7 ml avfall, vilket resulterade i 4 ml LNP som samlades in under stabila förhållanden. 1,3 ml av den organiska fasen och 3,9 ml av vattenfasen bereddes dock för formulering. Detta säkerställer att 5 ml-sprutan kan fyllas upp till 3,6 ml-markeringen och 3 ml-sprutan kan fyllas upp till 1,2 ml-markeringen. Om volymen når märkena på sprutorna är volymspecifikationerna som används på mikrofluidinstrumentet säkra ingångar. Den sista skärmen innan du trycker på "START"-knappen är avgörande för att säkerställa att alla parametrar är korrekta. Det är viktigt att göra en sista kontroll av spruttyperna, volymerna i sprutorna, volymerna som ska dispenseras, sprutplaceringen och flödeshastigheterna.
Efter formuleringen av mRNA-LNP har dialyssteget några viktiga överväganden att tänka på. De dialyskassetter som används kräver en minsta vätsketid på 2 minuter innan LNP:erna kan laddas. Detta ökar membranets flexibilitet och gör att membranet lättare kan justeras när provet tillsätts. Dessutom måste man vara försiktig så att man inte skadar eller punkterar membranen i dialyskassetterna när de laddas med mRNA-LNP. Om membranen punkteras eller skadas kan de formulerade mRNA-LNP:erna lätt gå förlorade vid belastning.
I detta protokoll testade vi in vitro-effektiviteten hos mRNA-LNP:er i HepG2-celler. Andra celltyper kan dock testas för mRNA-LNP-transfektionseffektivitet. Om icke-vidhäftande celler används måste 96-hålsplattan centrifugeras vid 500 g i 5 minuter innan cellodlingsmediet25 avlägsnas. Detta minimerar eventuell förlust av celler under borttagningen av mediet. Cellerna bör också testas för förekomst av mykoplasma före eventuella LNP-transfektionsstudier. Det kommer att vara svårt att få konsekventa resultat och jämföra olika LNP-formuleringar om cellerna testar positivt för mykoplasma. Dessutom kan primära celler kräva högre doser av LNP för att mäta transfektion utan toxicitet jämfört med cellinjer. En luciferasbaserad viabilitetsanalys kan användas för att utvärdera mRNA-LNP-toxiciteten in vitro vid varierande doser i både primära celler och cellinjer18.
Ett av de viktigaste stegen för att få konsekventa bioluminiscensmätningar över olika möss efter behandling med samma mRNA-LNP-formulering är att säkerställa att tiden mellan den intraperitoneala injektionen av d-luciferin och IVIS-mätningen är konsekvent26. Detta tidsintervall påverkar stabiliteten hos den erhållna bioluminescerande signalen. Tidsintervallet måste vara tillräckligt långt så att eventuella fluktuationer i signalen minimeras. Ett preliminärt experiment kan köras där mössen avbildas varje minut efter d-luciferininjektionen. Tidsintervallet när signalen börjar plana ut är det som är mest lämpligt för transfektionsexperimentet. I detta protokoll möjliggjorde ett intervall på 10 minuter stabila luminiscenssignaler efter injektionen 150 mg d-luciferin/kg kroppsvikt, som vanligtvis utförs för avbildning27,28.
Dessutom är mRNA-LNP-dosen som används i detta protokoll (0,1 mg mRNA/kg kroppsvikt) liten jämfört med de doser som används för att bedöma toxicitet och terapeutisk effekt29,30. Dessa mindre doser hjälper till att utvärdera skillnader i styrkan hos unika mRNA-LNP-formuleringar samtidigt som den erhållna luminescerande signalen inte övermättas. Denna dos kan dock ökas för att mäta den potentiella mRNA-LNP-toxiciteten. Till exempel kan levertoxicitet utvärderas genom att kvantifiera nivåerna av alanintransaminas, aspartattransaminas och alkaliskt fosfatas i serumet vid olika tidpunkter efter mRNA-LNP-injektion31,32,33. Dessa enzymer finns normalt i låga halter i serumet men ökar till följd av leverskador. Kommersiellt tillgängliga kit kan användas för att kvantifiera mängden av dessa enzymer i serumet.
I det här exemplet använde vi mRNA som kodar för eldflugeluciferas, men andra reporter-mRNA kan formuleras till LNP:er för att bedöma styrkan. mRNA som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP) eller mCherry kan användas för att undersöka cellspecifik leverans efter mRNA-LNP-behandling34,35. En encellssuspension kan framställas från vävnader av intresse, och GFP+- eller mCherry+-celler kan bedömas genom flödescytometrianalys. Dessutom kan mRNA-LNP formuleras med mRNA-kodning för erytropoietin för att mäta levertransfektion genom utsöndring av erytropoietin i serum 8,36,37. I Ai9-möss inducerar leveransen av mRNA-kodande Cre-rekombinas robust tdTomato-fluorescens, vilket kan fungera som en annan metod för att undersöka mRNA-LNP-leverans till olika cellpopulationer38,39,40. Genom demonstrationen av detta arbetsflöde är det vår förhoppning att mRNA-LNP-formuleringen upphör att vara ett hinder för forskare när de utforskar nya idéer och möjligheter för mRNA-terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
M.J.M. erkänner stöd från en US National Institutes of Health (NIH) Director's New Innovator Award (DP2 TR002776), en Burroughs Wellcome Fund Career Award vid Scientific Interface (CASI), en US National Science Foundation CAREER-utmärkelse (CBET-2145491) och ytterligare finansiering från National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 och NIDDK R01 DK123049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
