Summary
Aqui, um protocolo para a formulação de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulam RNAm que codifica a luciferase do vagalume é apresentado. Esses LNPs foram testados quanto à sua potência in vitro em células HepG2 e in vivo em camundongos C57BL/6.
Abstract
As nanopartículas lipídicas (LNPs) atraíram atenção generalizada recentemente com o desenvolvimento bem-sucedido das vacinas de mRNA COVID-19 pela Moderna e Pfizer/BioNTech. Essas vacinas demonstraram a eficácia da terapêutica mRNA-LNP e abriram as portas para futuras aplicações clínicas. Em sistemas de mRNA-LNP, os LNPs servem como plataformas de entrega que protegem a carga de mRNA da degradação por nucleases e mediam sua entrega intracelular. Os LNPs são tipicamente compostos por quatro componentes: um lipídio ionizável, um fosfolipídio, colesterol e um conjugado de polietilenoglicol (PEG) ancorado a lipídios (lipid-PEG). Aqui, LNPs encapsulando mRNA que codificam a luciferase de vagalumes são formulados por mistura microfluídica da fase orgânica contendo componentes lipídicos do LNP e da fase aquosa contendo mRNA. Esses mRNA-LNPs são então testados in vitro para avaliar sua eficiência de transfecção em células HepG2 usando um ensaio baseado em placa bioluminescente. Além disso, os mRNA-LNPs são avaliados in vivo em camundongos C57BL/6 após uma injeção intravenosa através da veia lateral da cauda. A imagem de bioluminescência de corpo inteiro é realizada usando um sistema de imagem in vivo . Resultados representativos são mostrados para as características do RNAm-LNP, sua eficiência de transfecção em células HepG2 e o fluxo luminescente total em camundongos C57BL/6.
Introduction
Nanopartículas lipídicas (LNPs) têm se mostrado promissoras nos últimos anos no campo da terapia gênica não viral. Em 2018, a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos aprovou a primeira terapêutica de RNA de interferência (RNAi), Onpattro by Alnylam, para o tratamento da amiloidose transtirretina hereditária 1,2,3,4. Este foi um passo importante para nanopartículas lipídicas e terapias baseadas em RNA. Mais recentemente, a Moderna e a Pfizer/BioNTech receberam aprovações da FDA para suas vacinas de mRNA-LNP contra o SARS-CoV-2 4,5. Em cada uma dessas terapias de ácidos nucleicos baseadas em LNP, o LNP serve para proteger sua carga da degradação por nucleases e facilitar a potente liberação intracelular 6,7. Enquanto LNPs têm visto sucesso em terapias de RNAi e aplicações de vacinas, mRNA-LNPs também têm sido explorados para uso em terapias de substituição de proteínas8, bem como para a co-entrega de mRNA Cas9 e RNA guia para a entrega do sistema CRISPR-Cas9 para edição de genes9. No entanto, não há uma formulação específica que seja adequada para todas as aplicações, e mudanças sutis nos parâmetros de formulação do LNP podem afetar sobremaneira a potência e a biodistribuição in vivo 8,10,11. Assim, RNAm-LNPs individuais devem ser desenvolvidos e avaliados para determinar a formulação ideal para cada terapia baseada em LNP.
Os LNPs são comumente formulados com quatro componentes lipídicos: um lipídio ionizável, um fosfolipídio, colesterol e um conjugado de polietilenoglicol (PEG) ancorado a lipídios (lipid-PEG)11,12,13. A potente liberação intracelular facilitada pelos LNPs reside, em parte, no componente lipídico ionizável12. Esse componente é neutro em pH fisiológico, mas torna-se carregado positivamente no ambiente ácido do endossomo11. Acredita-se que essa mudança na carga iônica seja um dos principais contribuintes para o escape endossômico12,14,15. Além do lipídio ionizável, o componente fosfolipídeo (lipídio auxiliar) melhora a encapsulação da carga e auxilia no escape endossomal, o colesterol oferece estabilidade e aumenta a fusão da membrana, e o lipídio-PEG minimiza a agregação e opsonização do LNP na circulação10,11,14,16. Para formular o LNP, esses componentes lipídicos são combinados em uma fase orgânica, tipicamente etanol, e misturados com uma fase aquosa contendo a carga de ácido nucleico. O processo de formulação do LNP é muito versátil, pois permite que diferentes componentes sejam facilmente substituídos e combinados em diferentes razões molares para formular muitas formulações de LNP com uma infinidade de propriedades físico-químicas10,17. No entanto, ao explorar essa grande variedade de LNPs, é crucial que cada formulação seja avaliada usando um procedimento padronizado para medir com precisão as diferenças na caracterização e desempenho.
Aqui, o fluxo de trabalho completo para a formulação de mRNA-LNPs e a avaliação de seu desempenho em células e animais é descrito.
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Protocol
NOTA: Sempre mantenha as condições livres de RNase ao formular mRNA-LNPs, limpando as superfícies e equipamentos com um descontaminante de superfície para RNases e DNA. Use apenas pontas e reagentes sem RNase.
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade da Pensilvânia e um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Pensilvânia.
1. Preparação da pré-formulação
- Encha um copo limpo de 4 L com 200-300 mL de solução salina fresca tamponada com fosfato (PBS) 10x.
- Diluir o 10x PBS no copo 10 vezes com água ultrapura para obter um copo de 1x PBS. Certifique-se de que o volume final do PBS 1x esteja entre 2-3 L.
- Coloque os de diálise (20 kDa molecular weight cutoff [MWCO]) da capacidade apropriada para a formulação de LNP no copo cheio para hidratá-los.
NOTA: Os de diálise requerem um mínimo de 2 minutos para hidratar antes de usar. - Coloque uma barra de agitação no copo e cubra o copo com papel alumínio.
- Coloque o copo coberto sobre uma placa de agitação magnética. Ligue a placa de agitação e coloque-a para girar a 300-400 rpm.
- Diluir um estoque tampão de ácido cítrico de 100 mM (pH 3) 10 vezes com água ultrapura para criar o tampão de ácido cítrico de 10 mM usado para diluição de mRNA.
- Fazer C12-200 lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol, e lipid-anchored PEG (lipid-PEG) soluções estoque dissolvendo cada lipídio em 100% etanol. As concentrações dos componentes lipídicos estão detalhadas na Tabela 1.
- Aquecer e misturar as soluções-mãe a 37 °C para garantir que estão totalmente dissolvidas.
2. Preparação das misturas de lipídios e ácidos nucleicos
- Calcular os volumes necessários de lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol e lipídio-PEG com base na razão molar desejada e na relação lipídio ionizável para peso de RNAm (Tabela 1). Preparar 10% de volume extra da fase orgânica para contabilizar o volume morto nas seringas durante a formulação.
- Combinar os volumes calculados dos diferentes componentes lipídicos em um tubo cônico.
- Diluir os lipídios com etanol 100% até um volume final, V, que representa 25% do volume final do LNP.
- Calcular a quantidade de mRNA necessária para a formulação com base na relação entre o peso do lipídio ionizável e do RNAm e o volume total de mRNA-LNP necessário (Tabela 1).
- Descongele o mRNA codificador de luciferase de vagalume no gelo.
- Diluir o mRNA até um volume final, 3V, três vezes o volume da fase orgânica, em tampão ácido cítrico 10 mM.
NOTA: Todo volume lipídico, V, deve conter lipídio ionizável suficiente para o mRNA diluído em 3 V. Isso corresponde à relação lipídio ionizável desejado para o peso do RNAm.
3. Formulação microfluídica de mRNA-LNPs
- Borrife uma limpeza de tarefa delicada com um descontaminante de superfície para RNases e DNA e limpe completamente o interior do instrumento microfluídico.
- Abra um novo cartucho microfluídico e insira-o com os canais de entrada virados para baixo e para longe.
- Certifique-se de que o braço do tubo cônico contém dois tubos cônicos de 15 mL e está na posição mais à direita.
- Configure dois tubos cônicos estéreis de 15 mL no suporte com as tampas desligadas.
- Encha uma seringa de 5 ml com a solução de mRNA que contém mRNA diluído em tampão de ácido cítrico 10 mM.
- Encha uma seringa de 3 mL com a solução lipídica que contém os lipídios diluídos em etanol 100% puro.
- Vire o suporte do cartucho no dispositivo microfluídico.
- Insira a seringa de 5 mL, sem a agulha, que contém mRNA na entrada esquerda do cartucho.
- Introduza a seringa de 3 ml, sem a agulha, que contém lípidos na entrada direita do cartucho.
- Vire o suporte do cartucho de volta para baixo e feche a tampa do instrumento microfluídico.
- Ligue o instrumento microfluídico usando o interruptor localizado na parte traseira do instrumento.
- Selecione Execução Rápida.
- Selecione os tipos de seringas corretos para as seringas de 5 mL e 3 mL inseridas.
- Insira os parâmetros para a formulação de mRNA-LNP em uma relação de fluxo aquoso para orgânico de 3:1, conforme descrito na Tabela 2.
- Pressione o botão Avançar para ir para a próxima tela.
- Confirme se os parâmetros corretos foram inseridos.
- Pressione o botão Iniciar para formular os mRNA-LNPs.
4. Processamento pós-formulação e caracterização dos RNAm-LNPs
- Carregar os RNAm-LNPs coletados no tubo cônico direito nos de diálise previamente hidratados.
NOTA: Não puncione ou danifique a membrana do ao carregar os mRNA-LNPs. Se a membrana estiver danificada, os mRNA-LNPs serão perdidos após a carga.- Coloque as de diálise contendo os mRNA-LNPs de volta no copo contendo 1x PBS e deixe-os dialisar por um mínimo de 2 h.
- Após a diálise, traga as de diálise contendo os mRNA-LNPs para um gabinete de biossegurança estéril e remova os mRNA-LNPs usando uma seringa com uma agulha.
- Filtrar estéril-os mRNA-LNPs usando um filtro de seringa de 0,22 μm e coletá-los em um tubo cônico estéril.
- Colocar 65 μL da solução de mRNA-LNP em um microtubo de 1,5 mL para fins de caracterização.
- Diluir 10 μL de mRNA-LNPs 1:100 em 990 μL de 1x PBS em uma cubeta para a medição do tamanho hidrodinâmico e do índice de polidispersidade usando espalhamento dinâmico de luz.
- Avaliar a concentração e a eficiência de encapsulação dos RNAm-LNPs usando um ensaio de fluorescência (i.e., RiboGreen).
- Preparar uma solução-mãe de tampão 1x TE diluindo o tampão 20x TE com água de biologia molecular.
- Preparar uma solução-mãe de tampão Triton X-100 a 1% diluindo Triton X-100 com 1x tampão TE.
- Prepare o reagente fluorescente diluindo o estoque de reagente 1:200 com 1x tampão TE.
- Diluir os mRNA-LNPs 1:100 em tampão TE 1x e tampão Triton X-100 1% em uma placa de fundo preto de 96 poços em 100 μL.
- Prepare uma curva padrão de baixo alcance diluindo o padrão de RNA de acordo com as instruções do fabricante e plaqueie a curva padrão na placa de 96 poços.
- Adicionar 100 μL de reagente fluorescente diluído a cada poço contendo mRNA-LNP diluído ou padrão diluído.
- Coloque a placa de 96 poços dentro de um leitor de placas e agite por 1 min, seguido de uma espera de 4 min.
- Medir a intensidade de fluorescência de cada poço de acordo com o protocolo do fabricante a uma excitação/emissão de 480 nm/520 nm.
- Use a curva padrão para converter os valores de fluorescência em concentrações.
- Calcular a eficiência de encapsulação subtraindo o valor obtido da diluição de LNPs em tampão TE (mRNA não encapsulado) do valor obtido com a diluição de LNPs em 1% Triton X-100 (mRNA total) e dividindo pelo valor obtido com a diluição de LNPs em 1% Triton X-100, de acordo com a equação 4.4.
- Calcular a concentração de mRNA-LNP utilizada para estudos em células e animais, subtraindo o valor obtido da diluição de LNPs em tampão TE (mRNA não encapsulado) do valor obtido da diluição de LNPs em 1% Triton X-100 (mRNA total).
- Medir o pKa dos mRNA-LNPs realizando um ensaio de cloreto de 6-(p-toluidino)-2-naftalenosulfonila (TNS).
- Prepare o reagente TNS criando uma solução de 0,16 mM de TNS em água ultrapura.
NOTA: Ao usar o reagente, certifique-se de mantê-lo no gelo e longe da luz para evitar a degradação. - Preparar soluções tamponadas de cloreto de sódio 150 mM, fosfato de sódio 20 mM, citrato de amónio 25 mM e acetato de amónio 20 mM ajustados a diferentes valores de pH que variam de 2 a 12 em incrementos de 0,5.
- Adicionar 2,5 μL do LNP a cada solução tampão ajustada ao pH em uma placa de fundo preto de 96 poços de parede preta.
- Adicionar o reagente TNS a cada poço para que a concentração final de TNS seja de 6 μM.
- Incubar a placa de 96 poços em um local escuro por 5 min.
- Medir a fluorescência a uma excitação/emissão de 322 nm/431 nm usando um leitor de placas de fluorescência.
- Ajustar os dados a uma curva sigmoidal e calcular o pK a usando a equação ajustada para encontrar o pH no qual 50% da intensidade máxima foi observada.
- Prepare o reagente TNS criando uma solução de 0,16 mM de TNS em água ultrapura.
- Resultados representativos para o tamanho hidrodinâmico do mRNA-LNP, PDI, eficiência de encapsulação e pKa são mostrados na Tabela 3.
5. Transfecção in vitro de células HepG2
NOTA: Várias outras linhagens celulares, como células HeLa ou células HEK-293T, podem ser usadas para avaliar a eficiência de transfecção de LNPs in vitro. Todas as células devem apresentar teste negativo para micoplasma antes dos estudos de transfecção do LNP.
- Placa de 5.000 células HepG2 em cada poço de uma placa de fundo claro de parede branca de 96 poços em 100 μL de meio de cultura celular completo (DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina)
- Deixe as células aderirem durante a noite em uma incubadora controlada de CO 2 a 37 °C e 5% de CO2.
- Diluir os RNAm-LNPs em meio de cultura celular completo para que a dose total seja administrada em 100 μL.
- Retire o meio completo dos poços.
- Tratar as células com RNAm-LNPs diluídos em meio de cultura celular completo nas doses desejadas ou meio completo (controle).
- Coloque a placa de 96 poços contendo as células tratadas de volta na incubadora controlada de CO2 por 24 horas.
- Avaliar a eficiência da transfecção realizando um ensaio de luciferase.
- Prepare o reagente luciferase e 1x tampão de lise celular de acordo com as instruções do fabricante.
- Retire a placa de 96 poços contendo as células da incubadora e leve-a para um armário de biossegurança.
- Remova o meio de cultura celular de cada poço da placa de 96 poços.
- Adicionar 20 μL de tampão de lise 1x a cada poço, seguido de 100 μL do reagente de ensaio de luciferase previamente preparado.
- Proteja a placa da luz e coloque-a em um leitor de placas para medir o sinal bioluminescente de cada poço.
NOTA: Resultados representativos demonstrando o tratamento de células HepG2 com C12-200 mRNA-LNPs previamente formulados são mostrados na Figura 1.
6. Avaliação in vivo de RNAm-LNPs em camundongos após injeção na veia caudal
- Diluir a solução de mRNA-LNP com 1x PBS estéril de modo que 2 μg de mRNA total estejam presentes em um volume de injeção da veia caudal de 100 μL, o que corresponde a uma dose de peso corporal de aproximadamente 0,1 mg/kg para um camundongo de 20 g.
- Restrinja cada rato usando um método aprovado e limpe a cauda com uma almofada umedecida com álcool a 70%.
- Encha uma seringa de insulina 29 G com 100 μL de mRNA-LNP (2 μg) ou 100 μL de 1x PBS. Retire as bolhas da seringa.
- Insira a agulha com o bisel voltado para cima na veia lateral da cauda do rato e injete lentamente os 100 μL de mRNA-LNP ou 1x PBS.
- Retire a agulha e aplique pressão até atingir a hemostasia.
- Preparar uma solução-mãe de 15 mg/mL de sal de d-luciferina potássica em estéril 1x PBS 6 horas após a injeção.
- Ligue o sistema de imagem in vivo (IVIS) e abra o software de imagem.
- Pressione Inicializar para preparar o instrumento para aquisição de dados.
- Marque a caixa ao lado de luminescência e defina o tempo de exposição como automático. Certifique-se de que o campo de visão correto esteja selecionado para o número de ratos que estão sendo fotografados.
- Administrar 200 μL de d-luciferina por via intraperitoneal (150 mg de luciferina por kg de peso corporal) aos ratinhos previamente tratados.
- Colocar os camundongos em uma câmara de anestesia regulada para isoflurano a 2,5% e fluxo de oxigênio de 2,0 L/min.
- Aguarde 10 minutos para que o sinal de luciferase se estabilize antes de obter imagens dos camundongos tratados com mRNA-LNP.
- Certifique-se de que os camundongos estejam totalmente anestesiados e redirecione a linha anestésica para administrar isoflurano através de cones nasais dentro da câmara de imagem.
- Transfira os ratos para os cones nasais e certifique-se de que eles estejam de costas com o abdômen exposto.
- Feche a porta da câmara e clique no botão Adquirir no software para obter imagens de bioluminescência.
NOTA: Resultados representativos para imagens de corpo inteiro de camundongos após o tratamento com mRNA-LNP ou 1X PBS são mostrados na Figura 2.
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Representative Results
Os mRNA-LNPs foram formulados usando um instrumento microfluídico que possuía um diâmetro hidrodinâmico médio de 76,16 nm e um índice de polidispersidade de 0,098. O pKa dos RNAm-LNPs foi encontrado em 5,75 através da realização de um ensaio TNS18. A eficiência de encapsulação para esses mRNA-LNPs foi calculada em 92,3% usando o ensaio de fluorescência modificado e a equação 4.4. A concentração total de RNA utilizada para o tratamento celular e dosagem em animais foi de 40,24 ng/μL. Esse valor foi obtido a partir do ensaio de fluorescência modificado 19, especificamente da conversão da fluorescência obtida pela diluição dos LNPs com tampão Triton X-100 a 1% e1x TE para determinadas concentrações e do cálculo da quantidade de RNAm encapsulado.
Equação 4.4
CTX = Concentração de RNAm de LNPs diluídos em Triton X-100 a 1%
C TE = Concentração de mRNA de LNPs diluídos em tampão 1x TE
Observou-se aumento da bioluminescência com doses crescentes no tratamento de 5.000 células HepG2 por poço com diferentes doses de RNAm-LNP. A expressão de Luciferase foi facilmente detectada na menor dose (5 ng/poço) utilizada neste estudo. No entanto, outras linhagens celulares podem exigir quantidades diferentes de mRNA-LNP para ver prontamente diferenças na luminescência entre as doses.
Camundongos foram tratados com 2 μg de RNAm-LNP e avaliados 6 h mais tarde para bioluminescência de corpo inteiro. Como C12-200 mRNA-LNPs transfect predominantemente o fígado20, um forte sinal bioluminescente foi observado no abdome superior dos camundongos tratados com nossos LNPs formulados. Usando o software de imagem, regiões de interesse foram desenhadas ao redor dos sinais hepáticos para calcular o fluxo luminescente total. Neste experimento, o fluxo luminescente total foi de aproximadamente 5 x 109, o que está de acordo com outros estudos realizados com esta formulação de LNP 4,21.
Tabela 1: Composição orgânica das fases. São descritas as concentrações das soluções estoque lipídicas individuais e os volumes que cada componente contribui para a fase orgânica de 1,3 mL. Os lipídios são combinados em uma razão molar de 35/16/46,5/2,5 (C12-200:DOPE:Colesterol:C14-PEG2000). Um volume extra de 10% foi preparado para contabilizar os volumes mortos da seringa durante a formulação. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Configurações do instrumento microfluídico para formulação de mRNA-LNP em uma relação de fluxo aquoso para orgânico de 3:1. A seringa de 5 mL contendo RNAm diluído em tampão ácido cítrico 10 mM foi inserida no canal central, enquanto a seringa de 3 mL contendo lipídios foi inserida no canal direito. Os LNPs foram formulados na razão de 10:1 em peso de lipídio ionizável:RNAm. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Dados de caracterização do mRNA-LNP determinados por espalhamento dinâmico de luz, ensaio de fluorescência modificado e ensaio com ácido 2-(p-toluidino) naftaleno-6-sulfônico (TNS). Clique aqui para baixar esta tabela.
Figura 1: Células HepG2 tratadas com mRNA-LNP de luciferase de vagalume. No total, 5.000 células HepG2 foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços e deixadas aderir durante a noite. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. O meio de cultura celular foi removido antes que as células fossem tratadas com doses de 5 ng, 10 ng e 20 ng de uma formulação de LNP contendo C12-200 encapsulando mRNA codificador de luciferase de vagalume (em 100 μL de meio de cultura celular). Após 24 h do tratamento, o meio de cultura celular foi removido e 20 μL de tampão de lise 1x foram adicionados às células antes da adição de 100 μL do reagente para o ensaio de luciferase. A bioluminescência de cada poço foi medida usando um leitor de placas após um período de incubação de 5 min. Os aumentos de dobras são plotados em relação aos poços de controle que consistiam de células HepG2 não tratadas. A significância estatística foi avaliada por meio de ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey. ns, não significativo; , p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Camundongos C57BL/6 tratados com mRNA-LNP de luciferase de vagalume. Neste trabalho, 2 μg de RNAm-LNP total em 100 μL ou 100 μL de 1x PBS foram administrados a camundongos C57BL/6 através da veia caudal lateral. (A) A bioluminescência de corpo inteiro dos camundongos tratados com mRNA-LNP ou 1X PBS foi medida usando o sistema de imagem in vivo (IVIS) 6 h após a administração. O software IVIS Spectrum Living Image foi utilizado para analisar e adquirir as imagens de corpo inteiro. N = 3. (B) O fluxo luminescente total foi quantificado e plotado. A significância estatística foi avaliada pelo teste t de Student bicaudal. **, p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Com esse fluxo de trabalho, uma variedade de mRNA-LNPs pode ser formulada e testada quanto à sua eficiência in vitro e in vivo. Lipídios ionizáveis e excipientes podem ser trocados e combinados em diferentes razões molares e diferentes razões de peso de lipídios ionizáveis para RNAm para produzir RNAm-LNPs com diferentes propriedades físico-químicas22. Aqui, formulamos C12-200 mRNA-LNPs com uma razão molar de 35/16/46,5/2,5 (lipídio ionizável:lipídio auxiliar:colesterol:lipídio-PEG) em uma razão de peso de 10:1 de lipídio ionizável para mRNA. Esses LNPs foram testados quanto à eficiência de transfecção in vitro em células HepG2 e in vivo em camundongos C57BL/6. Os C12-200 mRNA-LNPs foram sintetizados por mistura microfluídica usando um instrumento microfluídico comercialmente disponível. Embora outros métodos de formulação possam ser usados para formular LNPs, como a mistura de pipetas ou a mistura de junção T 4, a mistura microfluídica formula mRNA-LNPs que são geralmente menores, menos polidispersos e têm maior eficiência de encapsulação 4,13,23,24.
A formulação de mRNA-LNPs com o instrumento microfluídico comercialmente disponível permite a formulação simples e flexível de LNPs. A taxa de fluxo no início de uma corrida varia da taxa de fluxo alvo definida à medida que os empurradores de seringa aceleram até a velocidade máxima. Isso pode levar a características de partículas variáveis e resultados inconsistentes. Para superar isso, o instrumento microfluídico foi projetado para coletar os LNPs formulados no início e no final de uma formulação como resíduos separadamente dos LNPs formulados em condições de estado estacionário. Isso pode diminuir a polidispersidade e levar a propriedades de partículas mais consistentes. O resíduo inicial pode ser calculado com base na combinação de seringas que estão sendo usadas para a formulação, de acordo com o manual do fabricante. No entanto, o resíduo final não experimenta o mesmo grau de condições de fluxo não estacionário, de modo que o volume é frequentemente ajustado para 0,05 mL para todas as combinações de seringas, de acordo com a recomendação do fabricante.
É fundamental contabilizar o volume morto em seringas e tubos ao preparar os volumes corretos das fases orgânica e aquosa. A preparação de 10% do volume extra de cada fase garante que o volume mínimo de LNP desejado possa ser formulado. Nesse protocolo, um volume total de formulação de 4,7 mL foi inserido com 0,7 mL de resíduo, resultando em 4 mL de LNP coletados em condições de estado estável. Entretanto, 1,3 mL da fase orgânica e 3,9 mL da fase aquosa foram preparados para formulação. Isso garante que a seringa de 5 mL possa ser preenchida até a marca de 3,6 mL e a seringa de 3 mL possa ser preenchida até a marca de 1,2 mL. Se o volume atingir as marcas nas seringas, as especificações de volume usadas no instrumento microfluídico são entradas seguras. A tela final antes de pressionar o botão "START" é crucial para garantir que todos os parâmetros estejam corretos. É importante fazer uma verificação final dos tipos de seringas, dos volumes nas seringas, dos volumes a serem dispensados, da colocação da seringa e das vazões.
Após a formulação dos RNAm-LNPs, a etapa de diálise tem algumas considerações importantes a serem consideradas. Os de diálise utilizados requerem um tempo mínimo de hidratação de 2 min antes que os LNPs possam ser carregados. Isso aumenta a flexibilidade da membrana e permite que a membrana se ajuste mais prontamente à medida que a amostra é adicionada. Além disso, deve-se tomar cuidado para não danificar ou perfurar as membranas dos de diálise durante o carregamento com mRNA-LNPs. Se as membranas ficarem puncionadas ou danificadas, os mRNA-LNPs formulados podem ser facilmente perdidos após a carga.
Neste protocolo, testamos a eficiência in vitro de RNAm-LNPs em células HepG2. No entanto, outros tipos celulares podem ser testados quanto à eficiência da transfecção de RNAm-LNP. Se células não aderentes estiverem sendo usadas, a placa de 96 poços requer centrifugação a 500 g por 5 min antes de qualquer remoção do meio de cultura celular25. Isso minimiza qualquer perda de células durante a remoção do meio. As células também devem ser testadas para a presença de micoplasma antes de qualquer estudo de transfecção do LNP. Será difícil obter resultados consistentes e comparar diferentes formulações de LNP se as células forem positivas para micoplasma. Além disso, as células primárias podem requerer doses mais altas de LNP para medir a transfecção sem toxicidade em comparação com as linhagens celulares. Um ensaio de viabilidade baseado em luciferase pode ser usado para avaliar a toxicidade do RNAm-LNP in vitro em doses variáveis tanto em células primárias quanto em linhagens celulares18.
Um dos passos mais importantes na obtenção de medidas consistentes de bioluminescência em diferentes camundongos após o tratamento com a mesma formulação de mRNA-LNP é garantir que o tempo entre a injeção intraperitoneal de d-luciferina e a medição do IVIS seja consistente26. Esse intervalo de tempo influencia a estabilidade do sinal bioluminescente obtido. O intervalo de tempo precisa ser longo o suficiente para que quaisquer flutuações no sinal sejam minimizadas. Um experimento preliminar pode ser executado em que os camundongos são fotografados a cada minuto após a injeção de d-luciferina. O intervalo de tempo em que o sinal começa a se estabilizar é o mais adequado para o experimento de transfecção. Nesse protocolo, um intervalo de 10 min permitiu sinais de luminescência estáveis após a injeção de 150 mg de d-luciferina/kg de peso corporal, que é comumente realizada para exames de imagem27,28.
Além disso, a dose de RNAm-LNP utilizada nesse protocolo (0,1 mg de RNAm/kg de peso corporal) é pequena em comparação com as doses utilizadas para avaliar toxicidade e eficácia terapêutica29,30. Essas doses menores ajudam a avaliar diferenças nas potências de formulações únicas de mRNA-LNP, sem saturar demais o sinal luminescente obtido. No entanto, essa dose pode ser aumentada para medir a toxicidade potencial do RNAm-LNP. Por exemplo, a toxicidade hepática pode ser avaliada quantificando-se os níveis de alanina transaminase, aspartato transaminase e fosfatase alcalina no soro em diferentes momentos após a injeção de RNAm-LNP31,32,33. Estas enzimas são normalmente encontradas em níveis baixos no soro, mas estão aumentadas como resultado de danos no fígado. Kits disponíveis comercialmente podem ser usados para quantificar a quantidade dessas enzimas no soro.
Neste exemplo, usamos mRNA codificador de luciferase de vagalume, mas outros mRNAs de repórteres podem ser formulados em LNPs para avaliar a potência. Os mRNAs que codificam para proteína fluorescente verde (GFP) ou mCherry podem ser empregados para investigar a liberação célula-específica após o tratamento com mRNA-LNP34,35. Uma suspensão unicelular pode ser produzida a partir de tecidos de interesse, e células GFP+ ou mCherry+ podem ser avaliadas por citometria de fluxo. Além disso, os RNAm-LNPs podem ser formulados com o mRNA que codifica para eritropoetina para medir a transfecção hepática através da secreção de eritropoetina no soro8,36,37. Em camundongos Ai9, a liberação de RNAm que codifica a Cre recombinase induz fluorescência robusta de tdTomato, o que pode servir como outro método para investigar a liberação de RNAm-LNP para diferentes populações celulares38,39,40. Através da demonstração desse fluxo de trabalho, é nossa esperança que a formulação de mRNA-LNP deixe de ser uma barreira para os pesquisadores à medida que exploram novas ideias e possibilidades para a terapêutica de mRNA.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
M.J.M. reconhece o apoio de um Prêmio Novo Inovador do Diretor do National Institutes of Health (NIH) dos EUA (DP2 TR002776), um Prêmio de Carreira do Fundo Burroughs Wellcome na Interface Científica (CASI), um prêmio CAREER da Fundação Nacional de Ciência dos EUA (CBET-2145491) e financiamento adicional dos Institutos Nacionais de Saúde (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 e NIDDK R01 DK123049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
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