Summary
Burada, ateşböceği lusiferazını kodlayan mRNA'yı kapsülleyen lipid nanopartiküllerini (LNP'ler) formüle etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu LNP'ler, HepG2 hücrelerinde in vitro ve C57BL / 6 farelerinde in vivo potansiyelleri açısından test edildi.
Abstract
Lipid nanopartikülleri (LNP'ler), Moderna ve Pfizer/BioNTech tarafından COVID-19 mRNA aşılarının başarılı bir şekilde geliştirilmesiyle son zamanlarda büyük ilgi görmüştür. Bu aşılar, mRNA-LNP terapötiklerinin etkinliğini göstermiş ve gelecekteki klinik uygulamalar için kapıyı açmıştır. mRNA-LNP sistemlerinde, LNP'ler, mRNA kargosunu nükleazlar tarafından bozulmaya karşı koruyan ve hücre içi iletimlerine aracılık eden dağıtım platformları olarak hizmet eder. LNP'ler tipik olarak dört bileşenden oluşur: iyonlaşabilir bir lipit, bir fosfolipid, kolesterol ve bir lipide bağlı polietilen glikol (PEG) konjugatı (lipid-PEG). Burada, ateşböceği lusiferazı kodlayan mRNA'yı kapsülleyen LNP'ler, LNP lipid bileşenlerini içeren organik fazın ve mRNA içeren sulu fazın mikroakışkan karışımı ile formüle edilir. Bu mRNA-LNP'ler daha sonra biyolüminesan plaka bazlı bir test kullanılarak HepG2 hücrelerinde transfeksiyon verimliliklerini değerlendirmek için in vitro olarak test edilir. Ek olarak, mRNA-LNP'ler, lateral kuyruk damarı yoluyla intravenöz bir enjeksiyonu takiben C57BL/6 farelerinde in vivo olarak değerlendirilir. Tüm vücut biyolüminesans görüntüleme, in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. mRNA-LNP özellikleri, HepG2 hücrelerindeki transfeksiyon etkinlikleri ve C57BL/6 farelerinde toplam ışıldayan akı için temsili sonuçlar gösterilmiştir.
Introduction
Lipid nanopartikülleri (LNP'ler) son yıllarda viral olmayan gen terapisi alanında büyük umut vaat etmektedir. 2018'de Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), kalıtsal transtirenin amiloidozu 1,2,3,4'ün tedavisi için ilk RNA interferansı (RNAi) terapötik olan Onpattro by Alnylam'ı onayladı. Bu, lipid nanopartikülleri ve RNA bazlı tedaviler için ileriye doğru atılmış önemli bir adımdı. Daha yakın zamanlarda, Moderna ve Pfizer/BioNTech, SARS-CoV-2 4,5'e karşı mRNA-LNP aşıları için FDA onayları aldı. Bu LNP bazlı nükleik asit tedavilerinin her birinde, LNP, kargosunu nükleazlar tarafından bozulmaya karşı korumaya ve güçlü hücre içi iletimi kolaylaştırmaya hizmet eder 6,7. LNP'ler RNAi tedavilerinde ve aşı uygulamalarında başarı elde ederken, mRNA-LNP'ler ayrıca protein replasman tedavilerinde8 kullanım için ve ayrıca Cas9 mRNA'nın birlikte verilmesi ve gen düzenleme için CRISPR-Cas9 sisteminin verilmesi için RNA'yı yönlendirmek için araştırılmıştır9. Bununla birlikte, tüm uygulamalar için uygun olan tek bir spesifik formülasyon yoktur ve LNP formülasyon parametrelerindeki ince değişiklikler, in vivo 8,10,11 gücünü ve biyolojik dağılımı büyük ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, her LNP bazlı tedavi için optimal formülasyonu belirlemek için bireysel mRNA-LNP'ler geliştirilmeli ve değerlendirilmelidir.
LNP'ler genellikle dört lipid bileşeni ile formüle edilir: iyonlaşabilir bir lipit, bir fosfolipid, kolesterol ve bir lipide bağlı polietilen-glikol (PEG) konjugatı (lipit-PEG)11,12,13. LNP'ler tarafından kolaylaştırılan güçlü hücre içi iletim, kısmen iyonlaşabilir lipid bileşeni12'ye dayanır. Bu bileşen fizyolojik pH'ta nötrdür, ancak endozom11'in asidik ortamında pozitif yüklü hale gelir. İyonik yükteki bu değişikliğin endozomal kaçışa önemli bir katkıda bulunduğu düşünülmektedir12,14,15. İyonize olabilen lipide ek olarak, fosfolipid (yardımcı lipid) bileşeni, yükün kapsüllenmesini iyileştirir ve endozomal kaçışa yardımcı olur, kolesterol stabilite sağlar ve membran füzyonunu arttırır ve lipid-PEG, dolaşımda LNP agregasyonunu ve opsonizasyonu en aza indirir10,11,14,16. LNP'yi formüle etmek için, bu lipit bileşenleri organik bir fazda, tipik olarak etanolde birleştirilir ve nükleik asit kargosunu içeren sulu bir faz ile karıştırılır. LNP formülasyon işlemi, çok sayıda fizikokimyasal özelliğe sahip birçok LNP formülasyonunu formüle etmek için farklı bileşenlerin kolayca ikame edilmesine ve farklı molar oranlarda birleştirilmesine izin vermesi bakımından çok yönlüdür10,17. Bununla birlikte, bu çok çeşitli LNP'leri keşfederken, karakterizasyon ve performanstaki farklılıkları doğru bir şekilde ölçmek için her formülasyonun standart bir prosedür kullanılarak değerlendirilmesi çok önemlidir.
Burada, mRNA-LNP'lerin formülasyonu ve hücrelerde ve hayvanlarda performanslarının değerlendirilmesi için eksiksiz iş akışı özetlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Yüzeyleri ve ekipmanı RNazlar ve DNA için bir yüzey dekontaminantı ile silerek mRNA-LNP'leri formüle ederken her zaman RNaz içermeyen koşulları koruyun. Yalnızca RNaz içermeyen uçlar ve reaktifler kullanın.
Tüm hayvan prosedürleri, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna ve Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Ön formülasyon hazırlığı
- Temiz bir 4 L'lik kabı 200-300 mL taze 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun.
- 1x PBS'lik bir beher elde etmek için beherdeki 10x PBS'yi ultra saf suyla 10 kat seyreltin. 1x PBS'nin son hacminin 2-3 L arasında olduğundan emin olun.
- LNP formülasyonu için uygun kapasiteye sahip diyaliz kasetlerini (20 kDa moleküler ağırlık kesme [MWCO]) nemlendirmek için doldurulmuş behere yerleştirin.
NOT: Diyaliz kasetleri kullanılmadan önce nemlendirilmesi için en az 2 dakika gerektirir. - Behere bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve kabı alüminyum folyo ile örtün.
- Kapalı kabı manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin. Karıştırma plakasını açın ve 300-400 rpm'de dönmeye ayarlayın.
- mRNA seyreltmesi için kullanılan 10 mM sitrik asit tamponunu oluşturmak için 100 mM sitrik asit tampon stoğunu (pH 3) ultra saf suyla 10 kat seyreltin.
- Her bir lipidi %100 etanol içinde çözerek C12-200 iyonize olabilen lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve lipid bağlantılı PEG (lipid-PEG) stok çözeltileri yapın. Lipid bileşenlerinin konsantrasyonları Tablo 1'de detaylandırılmıştır.
- Tamamen çözündüklerinden emin olmak için stok çözeltilerini 37 °C'de ısıtın ve karıştırın.
2. Lipid ve nükleik asit karışımlarının hazırlanması
- İstenen molar orana ve iyonlaşabilir lipid/mRNA ağırlık oranına göre gerekli iyonlaşabilir lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve lipit-PEG hacimlerini hesaplayın (Tablo 1). Formülasyon sırasında şırıngalardaki ölü hacmi hesaba katmak için organik fazın %10 ekstra hacmini hazırlayın.
- Farklı lipit bileşenlerinin hesaplanan hacimlerini konik bir tüpte birleştirin.
- Lipitleri% 100 etanol ile, LNP'nin nihai hacminin% 25'ini temsil eden son hacim V'ye seyreltin.
- İyonlaşabilir lipid/mRNA ağırlık oranına ve gereken toplam mRNA-LNP hacmine dayalı olarak formülasyon için gereken mRNA miktarını hesaplayın (Tablo 1).
- Ateşböceği lusiferaz kodlayan mRNA'yı buz üzerinde çözün.
- mRNA'yı, 10 mM sitrik asit tamponunda organik fazın hacminin üç katı olan 3V'luk son hacme seyreltin.
NOT: Her lipid hacmi, V, 3 V'ta seyreltilmiş mRNA için yeterli iyonize edilebilir lipid içermelidir. Bu, istenen iyonlaşabilir lipid / mRNA ağırlık oranına karşılık gelir.
3. mRNA-LNP'lerin mikroakışkan formülasyonu
- RNazlar ve DNA için bir yüzey dekontaminantı ile hassas bir görev mendili püskürtün ve mikroakışkan aletin içini iyice silin.
- Yeni bir mikroakışkan kartuş açın ve giriş kanalları aşağı ve uzağa bakacak şekilde yerleştirin.
- Konik boru kolunun iki adet 15 mL konik boru tuttuğundan ve en sağa doğru konumda olduğundan emin olun.
- Tutucu üzerinde kapaklar kapalıyken iki adet steril 15 mL konik tüp yapılandırın.
- 5 mL'lik bir şırıngayı, 10 mM sitrik asit tamponunda seyreltilmiş mRNA içeren mRNA çözeltisiyle doldurun.
- 3 mL'lik bir şırıngayı, saf% 100 etanol içinde seyreltilmiş lipitleri içeren lipit çözeltisiyle doldurun.
- Mikroakışkan cihazdaki kartuş tutucuyu yukarı çevirin.
- mRNA içeren 5 mL'lik şırıngayı iğnesiz olarak kartuşun sol girişine yerleştirin.
- Lipid içeren 3 mL'lik şırıngayı iğnesiz olarak kartuşun sağ girişine yerleştirin.
- Kartuş tutucuyu tekrar aşağı çevirin ve mikroakışkan aletin kapağını kapatın.
- Cihazın arkasında bulunan anahtarı kullanarak mikroakışkan aleti açın.
- Hızlı Çalıştır'ı seçin.
- Takılan 5 mL ve 3 mL şırıngalar için doğru şırınga tiplerini seçin.
- mRNA-LNP formülasyonu için parametreleri Tablo 2'de açıklandığı gibi 3:1 sulu/organik akış hızı oranında girin.
- Bir sonraki ekrana gitmek için İleri düğmesine basın.
- Doğru parametrelerin girildiğini onaylayın.
- mRNA-LNP'leri formüle etmek için Başlat düğmesine basın.
4. mRNA-LNP'lerin formülasyon sonrası işlenmesi ve karakterizasyonu
- Sağ konik tüpte toplanan mRNA-LNP'leri önceden hidratlanmış diyaliz kasetlerine yükleyin.
NOT: mRNA-LNP'leri yüklerken kasetin zarını delmeyin veya zarar vermeyin. Membran hasar görürse, yükleme sırasında mRNA-LNP'ler kaybolacaktır.- mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini 1x PBS içeren behere geri yerleştirin ve en az 2 saat diyalize bırakın.
- Diyalizden sonra, mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini steril bir biyogüvenlik kabinine getirin ve iğneli bir şırınga kullanarak mRNA-LNP'leri çıkarın.
- 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak mRNA-LNP'leri steril olarak filtreleyin ve steril bir konik tüpte toplayın.
- Karakterizasyon amacıyla 65 μL mRNA-LNP çözeltisini 1.5 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin.
- Dinamik ışık saçılımı kullanarak hidrodinamik boyut ve polidispersite indeksinin ölçümü için bir küvette 10 μL mRNA-LNP'yi 990 μL 1x PBS'de 1:100 oranında seyreltin.
- Bir floresan testi (yani RiboGreen) kullanarak mRNA-LNP'lerin konsantrasyonunu ve kapsülleme verimliliğini değerlendirin.
- 20x TE tamponunu moleküler biyoloji suyu ile seyrelterek 1x TE tamponundan oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın.
- Triton X-100'ü 1x TE tamponu ile seyrelterek% 1 Triton X-100 tamponundan oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın.
- Reaktif stoğunu 1:200 oranında 1x TE tamponu ile seyrelterek floresan reaktifi hazırlayın.
- mRNA-LNP'leri 100x TE tamponunda 1:100 ve siyah duvarlı siyah tabanlı 96 oyuklu bir plakada 100 μL'de %1 Triton X-100 tamponu seyreltin.
- RNA standardını üreticinin talimatlarına göre seyrelterek düşük aralıklı bir standart eğri hazırlayın ve standart eğriyi 96 oyuklu plakada plakalayın.
- Seyreltilmiş mRNA-LNP veya seyreltilmiş standart içeren her bir oyuğa 100 μL seyreltilmiş floresan reaktif ekleyin.
- 96 oyuklu plakayı bir plaka okuyucunun içine yerleştirin ve 1 dakika çalkalayın, ardından 4 dakika bekleyin.
- Her bir kuyucuğun floresan yoğunluğunu, üreticinin protokolüne göre 480 nm/520 nm'lik bir uyarma/emisyonda ölçün.
- Floresan değerlerini konsantrasyonlara dönüştürmek için standart eğriyi kullanın.
- LNP'lerin TE tamponunda (kapsüllenmemiş mRNA) seyreltilmesinden elde edilen değeri, LNP'lerin %1 Triton X-100'de (toplam mRNA) seyreltilmesinden elde edilen değerden çıkararak ve LNP'lerin %1 Triton X-100'de seyreltilmesinden elde edilen değere bölerek kapsülleme verimliliğini hesaplayın, denklem 4.4'e göre.
- Hücre ve hayvan çalışmaları için kullanılan mRNA-LNP konsantrasyonunu, TE tamponunda (kapsüllenmemiş mRNA) LNP'lerin seyreltilmesinden elde edilen değeri, LNP'lerin %1 Triton X-100'de (toplam mRNA) seyreltilmesinden elde edilen değerden çıkararak hesaplayın.
- 6-(p-toluidino)-2-naftalinsülfonil klorür (TNS) testi yaparak mRNA-LNP'lerinpKA'sını ölçün.
- Ultra saf suda 0.16 mM'lik bir TNS çözeltisi oluşturarak TNS reaktifini hazırlayın.
NOT: Reaktifi kullanırken, bozulmayı önlemek için buz üzerinde ve ışıktan uzak tuttuğunuzdan emin olun. - 0,5'lik artışlarla 2 ila 12 arasında değişen farklı pH değerlerine ayarlanmış 150 mM sodyum klorür, 20 mM sodyum fosfat, 25 mM amonyum sitrat ve 20 mM amonyum asetat tamponlu çözeltiler hazırlayın.
- Siyah duvarlı siyah tabanlı 96 oyuklu bir plakada her bir pH ayarlı tampon çözeltisine 2,5 μL LNP ekleyin.
- Nihai TNS konsantrasyonu 6 μM olacak şekilde her bir oyuğa TNS reaktifi ekleyin.
- 96 oyuklu plakayı karanlık bir yerde 5 dakika inkübe edin.
- Bir floresan plaka okuyucu kullanarak 322 nm/431 nm'lik bir uyarma/emisyonda floresansı ölçün.
- Verileri sigmoidal bir eğriye sığdırın ve maksimum yoğunluğun %50'sinin gözlemlendiğipH'ı bulmak için uygun denklemi kullanarak p K a'yı hesaplayın.
- Ultra saf suda 0.16 mM'lik bir TNS çözeltisi oluşturarak TNS reaktifini hazırlayın.
- mRNA-LNP hidrodinamik boyutu, PDI, kapsülleme verimliliği ve pKa için temsili sonuçlar Tablo 3'te gösterilmektedir.
5. HepG2 hücrelerinin in vitro transfeksiyonu
NOT: HeLa hücreleri veya HEK-293T hücreleri gibi çeşitli diğer hücre hatları, LNP'lerin transfeksiyon verimliliğini in vitro olarak değerlendirmek için kullanılabilir. LNP transfeksiyon çalışmalarından önce tüm hücreler mikoplazma için negatif test yapmalıdır.
- Plaka: 100 μL tam hücre kültürü ortamında beyaz duvarlı şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 5.000 HepG2 hücresi (DMEM% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir)
- Hücreleri, 37 ° C ve% 5 CO 2'de kontrollü bir CO2 inkübatörde gece boyunca yapışmaya bırakın.
- mRNA-LNP'leri tam hücre kültürü ortamında seyreltin, böylece toplam doz 100 μL olarak verilir.
- Tüm ortamı kuyulardan çıkarın.
- Hücreleri, istenen dozlarda tam hücre kültürü ortamında seyreltilmiş mRNA-LNP'ler veya tam ortam (kontrol) ile tedavi edin.
- Tedavi edilen hücreleri içeren 96 oyuklu plakayı 24 saat boyunca kontrollü CO2 inkübatörüne geri yerleştirin.
- Bir lusiferaz testi yaparak transfeksiyon verimliliğini değerlendirin.
- Lusiferaz reaktifini ve 1x hücre lizis tamponunu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
- Hücreleri içeren 96 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve bir biyogüvenlik kabinine getirin.
- Hücre kültürü ortamını 96 oyuklu plakanın her oyuğundan çıkarın.
- Her bir oyuğa 20 μL 1x lizis tamponu ve ardından önceden hazırlanmış 100 μL lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin.
- Plakayı ışıktan koruyun ve her bir kuyucuğun biyolüminesan sinyalini ölçmek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin.
NOT: HepG2 hücrelerinin önceden formüle edilmiş C12-200 mRNA-LNP'ler ile tedavisini gösteren temsili sonuçlar Şekil 1'de gösterilmektedir.
6. Kuyruk damarı enjeksiyonunu takiben farelerde mRNA-LNP'lerin in vivo değerlendirmesi
- mRNA-LNP çözeltisini steril 1x PBS ile seyreltin, böylece 20 g'lık bir fare için yaklaşık 0,1 mg/kg'lık bir vücut ağırlığı dozuna karşılık gelen 100 μL'lik bir kuyruk damarı enjeksiyon hacminde 2 μg toplam mRNA bulunur.
- Her fareyi onaylanmış bir yöntem kullanarak kısıtlayın ve kuyruğu% 70 alkolle nemlendirilmiş bir bezle silin.
- 29 G'lik bir insülin şırıngasını 100 μL mRNA-LNP (2 μg) veya 100 μL 1x PBS ile doldurun. Şırıngadaki kabarcıkları çıkarın.
- İğneyi, eğimi yukarı bakacak şekilde farenin yan kuyruk damarına sokun ve 100 μL mRNA-LNP veya 1x PBS'yi yavaşça enjekte edin.
- İğneyi çıkarın ve hemostaz elde edilene kadar basınç uygulayın.
- Enjeksiyondan 6 saat sonra steril 1x PBS'de 15 mg / mL d-lusiferin potasyum tuzu stok çözeltisi hazırlayın.
- In vivo görüntüleme sistemini (IVIS) açın ve görüntüleme yazılımını açın.
- Enstrümanı veri toplamaya hazırlamak için Başlat'a basın.
- Lüminesans'ın yanındaki kutuyu işaretleyin ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın. Görüntülenen fare sayısı için doğru görüş alanının seçildiğinden emin olun.
- Daha önce tedavi edilen farelere intraperitoneal olarak 200 μL d-lusiferin (vücut ağırlığının kg'ı başına 150 mg lusiferin) uygulayın.
- Fareleri %2,5 izofluran ve 2,0 L/dk oksijen akış hızına ayarlanmış bir anestezi odasına yerleştirin.
- mRNA-LNP ile tedavi edilen fareleri görüntülemeden önce lusiferaz sinyalinin stabilize olması için 10 dakika bekleyin.
- Farelerin tamamen uyuşturulduğundan emin olun ve görüntüleme odasının içindeki burun konileri yoluyla izofluran uygulamak için anestezi hattını yönlendirin.
- Fareleri burun konilerine aktarın ve karınları açıkta kalacak şekilde sırt üstü olduklarından emin olun.
- Oda kapısını kapatın ve biyolüminesans görüntüleri elde etmek için yazılımdaki Al düğmesine tıklayın.
NOT: mRNA-LNP veya 1X PBS tedavisini takiben fare tüm vücut görüntülemesi için temsili sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mRNA-LNP'ler, ortalama hidrodinamik çapı 76.16 nm ve polidispersite indeksi 0.098 olan bir mikroakışkan alet kullanılarak formüle edildi. mRNA-LNP'lerin pKa'sı , TNS testi18 yapılarak 5.75 olarak bulundu. Bu mRNA-LNP'ler için kapsülleme verimliliği, modifiye floresan testi ve denklem 4.4 kullanılarak %92.3 olarak hesaplandı. Hücre tedavisi ve hayvan dozu için kullanılan toplam RNA konsantrasyonu 40.24 ng / μL idi. Bu değer, modifiye floresan deneyi19'dan, özellikle LNP'lerin %1 Triton X-100 ve 1x TE tamponu ile seyreltilmesiyle elde edilen floresansın belirli konsantrasyonlara dönüştürülmesinden ve kapsüllenmiş mRNA miktarının hesaplanmasından elde edilmiştir.
Denklem 4.4
CTX = %1 Triton X-100 içinde seyreltilmiş LNP'lerden mRNA konsantrasyonu
C TE = 1x TE tamponunda seyreltilmiş LNP'lerden mRNA konsantrasyonu
Kuyu başına 5.000 HepG2 hücresinin farklı dozlarda mRNA-LNP ile muamelesi üzerine artan dozlarla artan biyolüminesans gözlenmiştir. Bu çalışmada kullanılan en düşük dozda (5 ng/kuyu) lusiferaz ekspresyonu kolayca tespit edildi. Bununla birlikte, diğer hücre hatları, dozlar arasında lüminesanstaki farklılıkları kolayca görmek için farklı miktarlarda mRNA-LNP gerektirebilir.
Fareler 2 μg mRNA-LNP ile tedavi edildi ve 6 saat sonra tüm vücut biyolüminesansı açısından değerlendirildi. C12-200 mRNA-LNP'ler ağırlıklı olarak karaciğeri20 transfekte ettiğinden, formüle edilmiş LNP'lerimizle tedavi edilen farelerin üst karnında güçlü bir biyolüminesan sinyal gözlendi. Görüntüleme yazılımı kullanılarak, toplam ışıldayan akıyı hesaplamak için karaciğer sinyallerinin etrafına ilgi bölgeleri çizildi. Bu deneyde, toplam ışıldayan akı yaklaşık 5 x 109 idi, bu da bu LNP formülasyonu 4,21 ile yapılan diğer çalışmalarla tutarlıdır.
Tablo 1: Organik faz bileşimi. Bireysel lipid stok çözeltilerinin konsantrasyonları ve her bir bileşenin 1.3 mL organik faza katkıda bulunduğu hacimler açıklanmaktadır. Lipitler 35/16 / 46.5 / 2.5 (C12-200: DOPE: Kolesterol: C14-PEG2000) molar oranında birleştirilir. Formülasyon sırasında şırınga ölü hacimlerini hesaba katmak için% 10'luk bir ekstra hacim hazırlandı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: 3:1 sulu / organik akış hızı oranında mRNA-LNP formülasyonu için mikroakışkan cihaz ayarları. 10 mM sitrik asit tamponu içinde seyreltilmiş mRNA içeren 5 mL'lik şırınga merkez kanala, lipid içeren 3 mL'lik şırınga ise sağ kanala yerleştirildi. LNP'ler, iyonlaşabilir lipid:mRNA'nın 10:1 ağırlık oranında formüle edildi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: Dinamik ışık saçılımı, modifiye edilmiş bir floresan testi ve bir 2-(p-toluidino) naftalin-6-sülfonik asit (TNS) testi ile belirlenen mRNA-LNP karakterizasyon verileri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 1: Ateşböceği lusiferaz mRNA-LNP ile tedavi edilen HepG2 hücreleri. Genel olarak, 5,000 HepG2 hücresi, 96 oyuklu bir plakada oyuk başına ekildi ve gece boyunca yapışmasına izin verildi. Hücreler, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de kültürlendi. Hücre kültürü ortamı, hücreler 5 ng, 10 ng ve 20 ng dozlarında, ateşböceği lusiferaz kodlayan mRNA'yı (100 μL hücre kültürü ortamında) kapsülleyen C12-200 içeren bir LNP formülasyonu ile muamele edilmeden önce çıkarıldı. Tedaviden 24 saat sonra, hücre kültürü ortamı çıkarıldı ve 100 μL lusiferaz tahlil reaktifi eklenmeden önce hücrelere 20 μL 1x lizis tamponu eklendi. Her bir kuyucuktan biyolüminesans, 5 dakikalık bir inkübasyon periyodunu takiben bir plaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Kat artışları, işlenmemiş HepG2 hücrelerinden oluşan kontrol kuyucuklarına göre çizilir. İstatistiksel anlamlılık, post-hoc Tukey testi ile tek yönlü varyans analizi kullanılarak değerlendirildi. ns, önemli değil; , p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ateşböceği lusiferaz mRNA-LNP ile tedavi edilen C57BL/6 fareleri. Bu çalışmada, 100 μL veya 100 μL 1x PBS'de 2 μg toplam mRNA-LNP, lateral kuyruk veni yoluyla C57BL/6 farelerine uygulandı. (A) mRNA-LNP veya 1X PBS ile tedavi edilen farelerin tüm vücut biyolüminesansı, uygulamadan 6 saat sonra in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanılarak ölçülmüştür. Tüm vücut görüntülerini analiz etmek ve elde etmek için IVIS Spectrum Living Image yazılımı kullanıldı. N = 3 olur. (B) Toplam ışıldayan akı ölçüldü ve çizildi. İstatistiksel anlamlılık iki kuyruklu Student t-testi kullanılarak değerlendirildi. **, p < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iş akışıyla, çeşitli mRNA-LNP'ler in vitro ve in vivo verimlilikleri için formüle edilebilir ve test edilebilir. İyonlaşabilir lipitler ve eksipiyanlar, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip mRNA-LNP'ler üretmek için farklı molar oranlarda ve farklı iyonlaşabilir lipid / mRNA ağırlık oranlarında değiştirilebilir ve birleştirilebilir22. Burada, molar oranı 35/16/46.5/2.5 (iyonlaşabilir lipid: yardımcı lipid: kolesterol: lipid-PEG) olan C12-200 mRNA-LNP'leri 10:1 iyonize edilebilir lipid / mRNA ağırlık oranında formüle ettik. Bu LNP'ler, HepG2 hücrelerinde in vitro ve C57BL / 6 farelerinde in vivo transfeksiyon etkinlikleri açısından test edildi. C12-200 mRNA-LNP'ler, ticari olarak temin edilebilen bir mikroakışkan alet kullanılarak mikroakışkan karıştırma yoluyla sentezlendi. LNP'leri formüle etmek için pipet karıştırma veya T-bağlantı karıştırma 4 gibi diğer formülasyon yöntemleri kullanılabilse de, mikroakışkan karıştırma, genellikle daha küçük, daha az polidispers olan ve daha yüksek kapsülleme verimliliğine sahip mRNA-LNP'leri formüle eder 4,13,23,24.
mRNA-LNP'lerin ticari olarak temin edilebilen mikroakışkan cihazla formülasyonu, LNP'lerin basit ve esnek formülasyonuna izin verir. Bir çalışmanın başlangıcındaki akış hızı, şırınga iticileri tam hıza hızlandıkça ayarlanan hedef akış hızından farklıdır. Bu, değişken parçacık özelliklerine ve tutarsız sonuçlara yol açabilir. Bunun üstesinden gelmek için, mikroakışkan cihaz, bir formülasyonun başında ve sonunda formüle edilen LNP'leri, kararlı durum koşullarında formüle edilen LNP'lerden ayrı olarak atık olarak toplamak üzere tasarlanmıştır. Bu, polidispersiteyi azaltabilir ve daha tutarlı partikül özelliklerine yol açabilir. Başlangıç atığı, üretici kılavuzuna göre formülasyon için kullanılan şırıngaların kombinasyonuna göre hesaplanabilir. Bununla birlikte, son atık aynı derecede kararlı olmayan akış koşulları yaşamaz, bu nedenle üreticinin tavsiyesine göre tüm şırınga kombinasyonları için hacim genellikle 0,05 mL'ye ayarlanır.
Organik ve sulu fazların doğru hacimlerini hazırlarken şırınga ve tüplerdeki ölü hacmi hesaba katmak çok önemlidir. Her faz için %10 ekstra hacim hazırlanması, istenen minimum LNP hacminin formüle edilebilmesini sağlar. Bu protokolde, 0.7 mL atık ile toplam 4.7 mL'lik bir formülasyon hacmi girildi ve kararlı durum koşullarında 4 mL LNP toplandı. Bununla birlikte, formülasyon için 1.3 mL organik faz ve 3.9 mL sulu faz hazırlandı. Bu, 5 mL'lik şırınganın 3,6 mL'lik işarete kadar doldurulabilmesini ve 3 mL'lik şırınganın 1,2 mL'lik işarete kadar doldurulabilmesini sağlar. Hacim şırıngalardaki işaretlere ulaşırsa, mikroakışkan cihazda kullanılan hacim özellikleri güvenli girişlerdir. "BAŞLAT" düğmesine basmadan önceki son ekran, tüm parametrelerin doğru olduğundan emin olmak için çok önemlidir. Şırınga tipleri, şırıngalardaki hacimler, dağıtılacak hacimler, şırınga yerleşimi ve akış hızları üzerinde son bir kontrol yapmak önemlidir.
mRNA-LNP'lerin formülasyonundan sonra, diyaliz adımının akılda tutulması gereken birkaç önemli hususu vardır. Kullanılan diyaliz kasetleri, LNP'lerin yüklenebilmesi için minimum 2 dakikalık bir hidrasyon süresi gerektirir. Bu, membran esnekliğini arttırır ve numune eklendikçe membranın daha kolay ayarlanmasını sağlar. Ek olarak, diyaliz kasetlerine mRNA-LNP'ler yüklenirken membranlara zarar vermemeye veya delinmemeye özen gösterilmelidir. Membranlar delinir veya hasar görürse, formüle edilmiş mRNA-LNP'ler yükleme sırasında kolayca kaybolabilir.
Bu protokolde, HepG2 hücrelerinde mRNA-LNP'lerin in vitro etkinliğini test ettik. Bununla birlikte, diğer hücre tipleri mRNA-LNP transfeksiyon verimliliği için test edilebilir. Yapışık olmayan hücreler kullanılıyorsa, 96 oyuklu plaka, hücre kültürü ortamının25 herhangi bir şekilde çıkarılmasından önce 5 dakika boyunca 500 g'da santrifüjleme gerektirir. Bu, ortamın çıkarılması sırasında herhangi bir hücre kaybını en aza indirir. Hücreler ayrıca herhangi bir LNP transfeksiyon çalışmasından önce mikoplazma varlığı açısından test edilmelidir. Hücreler mikoplazma için pozitif test ederse, tutarlı sonuçlar elde etmek ve farklı LNP formülasyonlarını karşılaştırmak zor olacaktır. Ek olarak, birincil hücreler, hücre hatlarına kıyasla toksisite olmadan transfeksiyonu ölçmek için daha yüksek dozlarda LNP gerektirebilir. Hem primer hücrelerde hem de hücre hatlarında değişen dozlarda in vitro mRNA-LNP toksisitesini değerlendirmek için lusiferaz bazlı bir canlılık testikullanılabilir 18.
Aynı mRNA-LNP formülasyonu ile tedaviyi takiben farklı farelerde tutarlı biyolüminesans ölçümleri elde etmenin en önemli adımlarından biri, d-lusiferinin intraperitoneal enjeksiyonu ile IVIS ölçümü arasındaki sürenin tutarlı olmasını sağlamaktır26. Bu zaman aralığı, elde edilen biyolüminesan sinyalin kararlılığını etkiler. Sinyaldeki dalgalanmaların en aza indirilmesi için zaman aralığının yeterince uzun olması gerekir. D-lusiferin enjeksiyonunu takiben farelerin her dakika görüntülendiği bir ön deney yapılabilir. Sinyalin düzleşmeye başladığı zaman aralığı, transfeksiyon deneyi için en uygun olanıdır. Bu protokolde, görüntüleme için yaygın olarak gerçekleştirilen 150 mg d-lusiferin/kg vücut ağırlığı enjeksiyonunu takiben 10 dakikalık bir aralık stabil lüminesans sinyallerine izin verdi27,28.
Ek olarak, bu protokolde kullanılan mRNA-LNP dozu (0.1 mg mRNA/kg vücut ağırlığı), toksisite ve terapötik etkinliği değerlendirmek için kullanılan dozlara kıyasla küçüktür29,30. Bu daha küçük dozlar, elde edilen ışıldayan sinyali aşırı doyurmazken, benzersiz mRNA-LNP formülasyonlarının potansiyellerindeki farklılıkları değerlendirmeye yardımcı olur. Bununla birlikte, potansiyel mRNA-LNP toksisitesini ölçmek için bu doz arttırılabilir. Örneğin, karaciğer toksisitesi, mRNA-LNP enjeksiyonunu takiben farklı zaman noktalarında serumdaki alanin transaminaz, aspartat transaminaz ve alkalin fosfataz seviyelerinin ölçülmesiyle değerlendirilebilir31,32,33. Bu enzimler normalde serumda düşük seviyelerde bulunur, ancak karaciğer hasarının bir sonucu olarak artar. Serumdaki bu enzimlerin miktarını ölçmek için ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılabilir.
Bu örnekte, ateşböceği lusiferaz kodlayan mRNA'yı kullandık, ancak diğer raportör mRNA'lar, gücü değerlendirmek için LNP'lere formüle edilebilir. Yeşil floresan proteini (GFP) veya mCherry'yi kodlayan mRNA'lar, mRNA-LNP tedavisini takiben hücreye özgü iletimi araştırmak için kullanılabilir34,35. İlgilenilen dokulardan tek hücreli bir süspansiyon üretilebilir ve GFP + veya mCherry + hücreleri akış sitometri analizi ile değerlendirilebilir. Ek olarak, mRNA-LNP'ler, serumda eritropoietin salgılanması yoluyla karaciğer transfeksiyonunu ölçmek için eritropoietin kodlayan mRNA ile formüle edilebilir 8,36,37. Ai9 farelerinde, Cre rekombinazı kodlayan mRNA'nın verilmesi, farklı hücre popülasyonlarına mRNA-LNP iletimini araştırmak için başka bir yöntem olarak hizmet edebilen sağlam tdTomato floresansını indükler38,39,40. Bu iş akışının gösterilmesi yoluyla, mRNA-LNP formülasyonunun, mRNA terapötikleri için yeni fikirleri ve olasılıkları keşfederken araştırmacılar için bir engel olmaktan çıkmasını umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
M.J.M., ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü'nden (DP2 TR002776), Scientific Interface'de (CASI) Burroughs Wellcome Fund Kariyer Ödülü'nden, ABD Ulusal Bilim Vakfı KARİYER ödülünden (CBET-2145491) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 ve NIDDK R01 DK123049) ek fon sağladığını kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
