Summary
Metanol kan brukes som et hjelpefast medium for retinale helmonteringspreparater og langtidslagring, noe som er nyttig for undersøkelse av retinale ganglionceller.
Abstract
Retinal ganglionceller (RGC), som er projeksjonsnevronene i netthinnen, forplanter ekstern visuell informasjon til hjernen. Patologiske endringer i RGC har et nært forhold til mange retinal degenerative sykdommer. Helmontert retinal immunfarging brukes ofte i eksperimentelle studier på RGC for å evaluere utviklingsmessige og patologiske forhold i netthinnen. Under noen omstendigheter kan noen verdifulle netthinneprøver, som de fra transgene mus, måtte oppbevares i lang tid uten å påvirke morfologien eller antall RGC. For troverdige og reproduserbare eksperimentelle resultater er det viktig å bruke et effektivt konserverende medium. Her beskriver vi effekten av metanol som et hjelpefast medium for netthinnepreparater og langtidslagring. Kort sagt, under isolasjonsprosessen pipetteres kald metanol (-20 ° C) på overflaten av netthinnen for å bidra til å fikse vevet og lette deres permeabilitet, og deretter kan netthinnene lagres i kald metanol (-20 ° C) før de blir immunfarget. Denne protokollen beskriver arbeidsflyten for netthinneisolasjon og lagringsprotokoll for vevsprøver, noe som er nyttig og praktisk for undersøkelse av RGC.
Introduction
Retinal ganglionceller (RGC) er de eneste projeksjonsnevronene i netthinnen, og de integrerer og overfører utvendig visuell informasjon til hjernen1. Mange neurodegenerative sykdommer som glaukom og traumatisk optisk nevropati er preget av irreversibel skade og tap av RGC 2,3. Analyse av morfologiske og kvantitative endringer av RGC er et avgjørende skritt for å bestemme hvordan nevrodegenerative sykdommer utvikler og fremmer 4,5.
Indirekte immunfluorescensanalyse er en allment akseptert metode for å overvåke fordelingen av proteiner og celletelling. I laboratoriet brukes helmontert retinal immunfarging ofte i eksperimentelle studier på RGC for å evaluere de fysiologiske og patologiske forholdene i netthinnen6. De vanligste markørene som brukes til RGC-kvantifisering i hele netthinnen inkluderer Brn3a, RNA-bindende protein med multippel skjøting (RBPMS), og så videre 7,8. Karakterisering av mengden og fordelingen av RGC krever høyverdig helmontert retinal immunfarging. Generelt, i immunfargingsprotokoller, blir retina nedsenket i kjemiske fikseringsmidler før de inkuberes i antistoffer. Ideelle fikseringsmidler bør ikke endre cellens form, epitopenes tilgjengelighet eller affinitet for antistoffer, eller vevets lineære dimensjoner 9,10.
På grunn av den komplekse strukturen i netthinnen, er problemer som retinal sårbarhet og folding, samt noen vanlige vanskeligheter, inkludert cellekrymping og uklare kjerner, utsatt for å oppstå når man lager en helmontert retinal patch, som har en negativ innvirkning på eksperimentell forskning. I tillegg er ikke alle retinas immunfarget umiddelbart, spesielt når det gjelder retinas av transgene mus med dyre priser som er av dyrebar opprinnelse, noe som nødvendiggjør bevaring av de ekstra retinalprøvene for videre bruk.
Den passende fikserende løsningen kan fikse vevet raskt, unngå vevsautolyse, bevare normal morfologi og struktur av vevscellene, og holde antigeniteten til proteiner og andre stoffer10. For tiden har formaldehydbasert fiksering blitt mye brukt i forskjellige vev, inkludert separerte netthinner, hemisected eyecups og hele øyeboller10. Vevskrymping og morfologisk endring av celler er de to kritiske utfordringene som oppstår etter nedsenking i formaldehyd11. I tillegg kommer modifiserte fikseringsformuleringer i økende grad frem for å maksimere retensjonen av de opprinnelige egenskapene til netthinnen og målcellene 9,10. Ulike retinal fikseringsbehandlinger kan påvirke retinalstrukturen, proteinimmunogenisitet, fluorescenseksitasjon og dempingsslukkingssyklus forskjellig12,13. Netthinner festet med Davidsons løsning er mer morfologisk intakte sammenlignet med de som er festet med formalin, men Davidsons løsning er mindre kompatibel med noen antistoffer, for eksempel mikroglialmarkørionisert kalsiumbindende adaptermolekyl 112. Med tanke på den skjøre naturen til netthinnen, vil forskerne naturlig lure på om retinal integritet, samt egenskapene og morfologien til målcellene, vil endres etter langvarig lagring. Imidlertid er mulige effekter av fikseringsløsning på retinal og RGC-cellemorfologi etter lagring i flere måneder rapportert i sjeldne tilfeller. Optimalisering av retinal fiksering er kritisk for evaluering og bevaring av RGC.
Vi gir en detaljert beskrivelse av en pålitelig og teknisk enkel metode som vi bruker for helmontering murine retinal farging. Vår metode legger vekt på riktig forberedelse og lagring av retina for RGC-undersøkelse, med tanke på behovet for langsiktig lagring av retinalvev, samt spesifikke aspekter ved fluorofordannelse eller nedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trinn utføres ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Alle C57BL/6J-mus som ble brukt ble hentet fra Laboratory Animal Center ved Wuhan University, og alle relaterte eksperimenter ble godkjent av komiteen for etikk for dyreforsøk ved Wuhan University. Alle anstrengelser ble gjort for å minimere musens lidelse.
1. Enukleasjon og fiksering av øynene
- Euthanize musene med karbondioksid kvælning, og enucleate øyebollet forsiktig ved hjelp av tannløse pinsett.
- Skyll øyebollet en gang i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Punkter øyebollet med en sprøytenål på hornhinnen under et mikroskop (okular WF: 10x / 22; kontinuerlig forstørrelsesmål: 0,67x-4,5x) for å akselerere fikseringen i øyebollet og forbedre fikseringseffektiviteten.
- Overfør til en 24-brønns plate inneholdende 4% paraformaldehyd (PFA).
- Fest øyeeplet i 4% PFA i 45 minutter, og overfør det deretter til 1x PBS for å fjerne overflødig PFA (vask tre ganger, 5 min / tid) umiddelbart.
2. Retina isolasjon og flattning
- Overfør øyeeplet til et glassglass, og plasser det under et dissekerende mikroskop (okular WF: 10x / 22; kontinuerlig forstørrelse mål: 0,67x-4,5x).
- Hold tangen i den ene hånden, og bruk den til å klemme kanten av hornhinnen for å forhindre øyebevegelse. Bruk den andre hånden til å holde dissekerende saks og skjær rundt hornhinnen på ca. 1 mm dybde gjennom corneoscleral limbus. Fjern linsen og glasslegemet.
- Hold den optiske platen i midten, og bruk dissekerende saks, kutt netthinnen radialt langs de fire kvadranter, og når omtrent 2/3 av radiusen til netthinnen.
- Klem en av sklerkantene ved hjelp av tannede tang. Med den andre hånden, hold kanten av sclera med untoothed tang, og flytt fra der sclera er festet av tanntangen mot bunnen av sclera. Skrell netthinnen forsiktig.
- Trekk av PBS med en pipette (200 μL) for å skylle og fukte netthinnen, og fjern deretter overflødig PBS med et lite stykke absorberende papir. Hvis nødvendig, flat netthinnen forsiktig med en liten børste.
- Sakte pipette kald metanol (forkjølt i en -20 ° C fryser) dråpe for dråpe på den indre overflaten av netthinnen (volumet av metanol er ikke løst, så lenge netthinnen kan være helt dekket av metanol). Netthinnen blir hvit og utvikler økt fasthet.
- Flat forsiktig netthinnen, og fjern urenheter som gjenværende pigmentmembraner og glasslegemet med små børster. Inverter netthinnen ved hjelp av små børster, og gjenta den ovennevnte prosessen.
- Overfør metanolbehandlet retina til en brønn på en 24-brønnsplate, og hold den gjennomvåt i metanol.
- Oppbevar den ved -20 ° C i 1-2 timer for umiddelbar immunfarging, eller la netthinnen i metanol, og oppbevar den ved -20 ° C for langtidslagring.
- Fjern metanolen fra 24-brønnplaten, og skyll netthinnen med 1x PBS.
3. Immunfluorescerende farging av RGC
- Overfør netthinnen forsiktig til en 24-brønns hemagglutineringsplate med en plastisk Pasteur-pipette, og blokker i 5% PBS-TX-BSA (5 g bovint serumalbuminpulver oppløst i 100 ml 1x PBST-løsning; PBST dannes ved å tilsette 10 ml Triton X-100 til 2000 ml 1 x PBS) ved romtemperatur i 4 timer eller over natten ved 4 °C. Hold ganglionsiden opp.
- Fjern PBS-TX-BSA og inkuber netthinnen ved 4 °C i 48-96 timer, og tilsett 100 μL av det valgte primære antistoffet (marsvin anti-RBPMS antistoff) ved bruk av en 1:400 fortynning.
- Fjern det primære antistoffet, og skyll netthinnen tre ganger (20 min hver) med 1x PBS, rist ved romtemperatur.
- Inkuber netthinnen med lett risting over natten ved 4 °C med 100 μL av tilsvarende sekundært antistoff (se materialtabell), cyanin Cy3 affiniPure eselanti-marsvin IgG (H+L), ved bruk av en fortynning på 1:400.
- Skyll netthinnen med 1x PBS tre ganger (20 min hver).
- Legg netthinnen flatt på lysbildet med ganglioncellelaget vendt oppover, slipp en passende mengde antifluorescensslukkemiddel rundt netthinnen med en pipette, og dekk lysbildet med en deksel (vær forsiktig så du ikke har bobler).
MERK: For å bestemme riktig mengde antifluorescensslukker, sørg for at den dekker hele netthinnen. Deretter dekker du lysbildet uten å la netthinnen flyte og bevege seg lett. - Forsegl lysbildet rundt med et tetningsmiddel for å forhindre at det beveger seg. Oppbevar prøvene ved -20 °C, og beskytt dem mot lys.
- Bilde netthinnen ved hjelp av et fluorescens / konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter disseksjon skal netthinnen se ut som en flat firkløver. I denne studien, ved å bruke protokollen skissert ovenfor, ble netthinnen hvit etter at metanol ble tilsatt (figur 1). I mellomtiden endret netthinnen seg fra myk til bøyelig og flat. Deretter ble RGC-ene merket med anti-RBPMS8. Fire bildefelt ble tatt i hele netthinnen (n = 3) ved hjelp av et konfokalmikroskop (okular: 10x; mål: 40x). Representative visninger av visualiserte RGC av netthinnen før metanolbehandling og etter 12 måneders langtidskonservering i metanol, er vist i figur 2. Fluorescensintensiteten viste ingen signifikante endringer. Metanolkonservering påvirket ikke RGC-immunfargingen.
Figur 1: Netthinneforandringer etter metanolbehandling. (A) Før metanolbehandling. (B) Etter metanolbehandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekt av metanol på retinal ganglioncelle (RGC) immunfarging. (A) Netthinnen uten metanolbehandling. (B) Netthinnen med 12 måneders lagring i metanol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiksering er et viktig skritt for å bevare netthinnen, noe som kan påvirke eventuelle påfølgende RGC-undersøkelser basert på morfologi. Vellykket fiksering fanger raskt strukturen og tilstanden til retinaene i det øyeblikket de utsettes for fikseringsmediet, noe som er kritisk for videre analyse. Selv om formaldehyd har vært ansett som et av de vanligste fikseringsmidlene for vevs- og cellefiksering og konservering, fungerer ikke formaldehyd alene alltid godt som det optimale kjemiske fiksativet for noen undersøkelser10,14. Ulike typer fikseringsmidler har varierende kapasitet til å utfelle aminosyrer og nukleotider, stabilisere proteiner og opprettholde cellemorfologi15. Ved å bruke blandinger av begge typer fikseringsmidler, kan styrken til hver utnyttes fullt ut16,17. Metanol brukes ofte i mange fikseringsprosedyrer før vevet er nyfrosset eller innebygd i ideelle skjærematerialer16,18. For helmonterte eksperimenter brukes 100% kald (-20 ° C) metanol for å oppnå retinal prøvefiksering, noe som hjelper prøvepermeabiliseringen for den påfølgende fluorescensbaserte avbildningen19.
En viktig fordel med metanolfiksering er at det muliggjør enkel konservering. I denne protokollen tilsettes metanol gradvis på forsiden og baksiden av netthinnen ved -20 °C etter at netthinnen er flatt. Det kan lett observeres at fargen på netthinnen raskt endres fra gjennomsiktig til melkehvit, og urenhetene blir tydeligere. Det skal bemerkes at netthinnen skal forsiktig flates med en børste for å forhindre krølling rundt den under metanoldryppingsprosessen. Etter metanolbehandlingen øker den totale seigheten til netthinnen, noe som reduserer vanskeligheten med å fjerne urenheter og overføre netthinnen. Etterfiksering med metanol er mer praktisk for å bevare netthinner som har blitt litt forhåndsfiksert med PFA. Men når fastheten i netthinnen er forbedret, vil fastheten til glasslegemet og andre urenheter også øke tilsvarende. Man kan prøve å forsiktig fjerne noen urenheter som er enkle å fjerne før man bruker metanol, og deretter fjerne de resterende urenhetene etter drypptilsetning av metanol, noe som er lettere å utføre. Tidlig fjerning av urenheter krever nok praksis og erfaring. Det anbefales å forsiktig børste den gjenværende glasslegemet på netthinnen radialt utover fra optisk plate.
I denne protokollen, etter behandlingen, blir netthinnen dynket i metanol og plassert i en -20 ° C fryser i noen tid før den påfølgende forseglingen, og andre behandlinger kan ytterligere øke seigheten til netthinnen. Det er imidlertid vanskelig å angi en nøyaktig hvor lang tid som vil være universelt optimal for nedsenkningsfiksering. Ved behov kan netthinnen lagres i kald metanol i lange perioder.
I dette arbeidet, med den presenterte metodikken, ble virkningen av lagring i metanol på RGC-farging - en avgjørende teknikk i retinale kvalitative og kvantitative evalueringer - undersøkt. ved bruk av metanol ble fluorescensintensiteten til RGC, som ville påvirke resultatene av kvalitativ og kvantitativ testing, ikke endret under immunfarging. Netthinnene kunne oppbevares på ubestemt tid i en konserverende løsning, kald (-20 °C) metanol, i minst 12 måneder før farging. I tillegg viste vår tidligere studie ingen signifikant forskjell i RGC-overlevelsesrate i optisk nerveknuse musemodell etter langtidslagring i metanol, og metanolkonservering hadde også liten innvirkning på den kvantitative analysen av retinal vaskulatur og retinal hypoksi i oksygenindusert retinopati modell20. Vi anbefaler å bruke 4% PFA og kald (-20 °C) metanol sekvensielt for prøvepreparering, samt å ta i bruk metanolfiksering for lagringsstrategier i laboratoriet. En begrensning er at analysene ikke fullt ut viser subtile morfologiske endringer på dendritt- eller aksonalt nivå, selv om tettheten av RGC og morfologien til soma ikke ser ut til å endreseg 21,22. Det skal bemerkes at vi i denne protokollen bare testet RBPMS for RGC-er. Videre verifisering av forskjellige RGC-proteiner (f.eks. Brn3a, nevronkjerner, neurofilament-L) vil gi et mer robust resultat. Videre har protokollen også potensial til å bli brukt på alle andre celletyper i netthinnen som trenger videre forskning. Imidlertid kan langvarig innånding eller direkte kutan eksponering for metanol forårsake toksiske effekter på menneskekroppen. Derfor er det nødvendig å ta gode forholdsregler i prosessen med å bruke metanol.
Vår metode legger stor vekt på å bruke metanolfiksering til lagring av netthinner for RGC-undersøkelser og fremhever viktige hensyn angående RGC-kvantifisering og fluorescensintensitet. Denne protokollen gir en enkel og praktisk metode for å tilfredsstille nødvendigheten av å bevare retinalprøver for videre bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er ikke klar over noen tilknytninger, medlemskap, finansiering eller økonomiske beholdninger som kan påvirke objektiviteten til denne studien.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Hubei Key Laboratories Opening Project (tilskudd nr. 2021KFY055), Natural Science Foundation of Hubei Province (grant no. 2020CFB240), og Fundamental Research Funds for the Central Universities (stipend nr. 2042020kf0065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
