إنشاء مزارع مختلطة للخلايا العصبية والدبقية من أدمغة الفئران الجنينية لدراسة العدوى والمناعة الفطرية
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة فريدة لتوليد مزارع خلايا الجهاز العصبي المركزي من أدمغة الفئران الجنينية في اليوم 17 لأبحاث علم الأعصاب (المناعة). يمكن تحليل هذا النموذج باستخدام تقنيات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك RT-qPCR ، والفحص المجهري ، و ELISA ، وقياس التدفق الخلوي.
Abstract
يجب أن تلخص نماذج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الشبكة المعقدة للخلايا المترابطة الموجودة في الجسم الحي. يتكون الجهاز العصبي المركزي بشكل أساسي من الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة. نظرا للجهود المتزايدة لاستبدال وتقليل استخدام الحيوانات ، تم تطوير مجموعة متنوعة من أنظمة زراعة الخلايا في المختبر لاستكشاف خصائص الخلايا الفطرية ، والتي تسمح بتطوير علاجات لعدوى الجهاز العصبي المركزي وأمراضه. في حين أن بعض الأسئلة البحثية يمكن معالجتها من خلال أنظمة زراعة الخلايا البشرية ، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (المستحثة) ، فإن العمل مع الخلايا البشرية له حدوده الخاصة فيما يتعلق بالتوافر والتكاليف والأخلاق. هنا ، نصف بروتوكولا فريدا لعزل الخلايا وزراعتها من أدمغة الفئران الجنينية. تحاكي ثقافات الخلايا العصبية المختلطة الناتجة العديد من مجموعات الخلايا والتفاعلات الموجودة في الدماغ في الجسم الحي. بالمقارنة مع الطرق المكافئة الحالية ، يحاكي هذا البروتوكول بشكل أوثق خصائص الدماغ ويحصل أيضا على المزيد من الخلايا ، مما يسمح بفحص المزيد من الحالات التجريبية من فأر حامل واحد. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول سهل نسبيا وقابل للتكرار بدرجة كبيرة. تم تحسين هذه الثقافات للاستخدام على مستويات مختلفة ، بما في ذلك شاشات عالية الإنتاجية ذات 96 بئرا ، وتحليل مجهري 24 بئرا ، ومزارع 6 آبار لقياس التدفق الخلوي وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR). طريقة الاستزراع هذه هي أداة قوية للتحقيق في العدوى والمناعة في سياق بعض تعقيدات الجهاز العصبي المركزي مع راحة الطرق في المختبر .
Introduction
يعد تحسين فهمنا للجهاز العصبي المركزي (CNS) أمرا بالغ الأهمية لتحسين الخيارات العلاجية للعديد من الأمراض الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية. يتكون الجهاز العصبي المركزي ، وهو شبكة معقدة من الخلايا المترابطة داخل الدماغ والحبل الشوكي والأعصاب البصرية ، من الخلايا العصبية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، وخلاياها المناعية الفطرية ، الخلايا الدبقية الصغيرة1. يمكن للنهج في المختبر في كثير من الأحيان أن يقلل بشكل كبير من عدد الفئران المطلوبة لإجراء أبحاث ذات مغزى. ومع ذلك ، فإن الطبيعة المعقدة للجهاز العصبي المركزي تجعل من المستحيل تلخيص الوضع في الجسم الحي باستخدام خطوط الخلايا. توفر مزارع الخلايا العصبية المختلطة أداة بحث قيمة للغاية للتحقيق في أسئلة علم الأعصاب (المناعي) في نموذج ذي صلة ، بما يتماشى مع مبادئ الاستبدال والتخفيض والصقل (3Rs) 2,3.
وصف طومسون وآخرون طريقة زراعة الخلايا باستخدام خلايا الحبل الشوكي قبل الولادة التي تتمايز إلى جميع أنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي الرئيسية المذكورة أعلاه4. يحتوي هذا النظام أيضا على تكوين المشبك العصبي ، ومحاور الميالين ، وعقد رانفييه. القيد الرئيسي لطريقة الزراعة هذه هو أنه ، كونه الحبل الشوكي ، فإنه لا يصمم الدماغ بشكل مفيد ، وتنتج الخلية من الحبل الشوكي الجنيني في اليوم 13 (E13) تضيق. وبالتالي ، فإن هذا يحد من عدد الحالات التجريبية التي يمكن التحقيق فيها. لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نظام جديد لزراعة الخلايا يلخص خصائص الدماغ مع زيادة إنتاجية الخلايا لتقليل متطلبات الحيوانات.
باستخدام Thomson et al. كنقطة انطلاق ، قمنا بتطوير نموذج زراعة الخلايا المستمد فقط من أدمغة الفئران قبل الولادة. تحتوي هذه الثقافات على نفس مجموعات الخلايا والترابط وخيارات العلاج مثل مزارع الحبل الشوكي ، باستثناء وجود ميالين أقل بالمقارنة. ومع ذلك ، فإن وجود نموذج الجهاز العصبي المركزي في المختبر مع إنتاجية خلايا أعلى بثلاثة أضعاف تقريبا هو أكثر كفاءة ، ويتطلب عددا أقل من الفئران ووقتا أقل في معالجة الأجنة. لقد قمنا بتحسين نظام الاستزراع الفريد هذا للعديد من التطبيقات والمقاييس النهائية ، بما في ذلك استخدام أغطية زجاجية للتحليل المجهري وأحجام مختلفة من ألواح الآبار البلاستيكية ، بما في ذلك ألواح 96 بئرا للأبحاث عالية الإنتاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجهاز العصبي المركزي عبارة عن شبكة معقدة تمتد من الدماغ وصولا إلى الحبل الشوكي وتتكون من العديد من أنواع الخلايا ، والخلايا العصبية في الغالب ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا الدبقيةالصغيرة 1. نظرا لأن كل خلية لها دور مهم في الحفاظ على التوازن وتوليد است…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء مختبرات إدغار ولينينجتون ، ولا سيما البروفيسور كريس لينينجتون ، والدكتورة ديانا أرسيني ، والدكتورة كاتيا موكليش ، على نصائحهم وتعليقاتهم المفيدة ومساعدتهم في تغذية الثقافات أثناء إنشاء هذه الثقافات. نتوجه بشكر خاص إلى الدكتور Muecklisch لتوفير نقاط البداية لخطوط أنابيب Cell Profiler. تم دعم هذا العمل من قبل جمعية التصلب المتعدد (المنحة 122) ومؤسسة يوري ولورنا تشيرناجوفسكي إلى MP. تمويل جامعة غلاسكو ل JC و MP ؛ و Wellcome Trust (217093 / Z / 19 / Z) ومجلس البحوث الطبية (MRV0109721) إلى GJG.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).
