Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة فريدة لتوليد مزارع خلايا الجهاز العصبي المركزي من أدمغة الفئران الجنينية في اليوم 17 لأبحاث علم الأعصاب (المناعة). يمكن تحليل هذا النموذج باستخدام تقنيات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك RT-qPCR ، والفحص المجهري ، و ELISA ، وقياس التدفق الخلوي.
Abstract
يجب أن تلخص نماذج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الشبكة المعقدة للخلايا المترابطة الموجودة في الجسم الحي. يتكون الجهاز العصبي المركزي بشكل أساسي من الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة. نظرا للجهود المتزايدة لاستبدال وتقليل استخدام الحيوانات ، تم تطوير مجموعة متنوعة من أنظمة زراعة الخلايا في المختبر لاستكشاف خصائص الخلايا الفطرية ، والتي تسمح بتطوير علاجات لعدوى الجهاز العصبي المركزي وأمراضه. في حين أن بعض الأسئلة البحثية يمكن معالجتها من خلال أنظمة زراعة الخلايا البشرية ، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (المستحثة) ، فإن العمل مع الخلايا البشرية له حدوده الخاصة فيما يتعلق بالتوافر والتكاليف والأخلاق. هنا ، نصف بروتوكولا فريدا لعزل الخلايا وزراعتها من أدمغة الفئران الجنينية. تحاكي ثقافات الخلايا العصبية المختلطة الناتجة العديد من مجموعات الخلايا والتفاعلات الموجودة في الدماغ في الجسم الحي. بالمقارنة مع الطرق المكافئة الحالية ، يحاكي هذا البروتوكول بشكل أوثق خصائص الدماغ ويحصل أيضا على المزيد من الخلايا ، مما يسمح بفحص المزيد من الحالات التجريبية من فأر حامل واحد. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول سهل نسبيا وقابل للتكرار بدرجة كبيرة. تم تحسين هذه الثقافات للاستخدام على مستويات مختلفة ، بما في ذلك شاشات عالية الإنتاجية ذات 96 بئرا ، وتحليل مجهري 24 بئرا ، ومزارع 6 آبار لقياس التدفق الخلوي وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR). طريقة الاستزراع هذه هي أداة قوية للتحقيق في العدوى والمناعة في سياق بعض تعقيدات الجهاز العصبي المركزي مع راحة الطرق في المختبر .
Introduction
يعد تحسين فهمنا للجهاز العصبي المركزي (CNS) أمرا بالغ الأهمية لتحسين الخيارات العلاجية للعديد من الأمراض الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية. يتكون الجهاز العصبي المركزي ، وهو شبكة معقدة من الخلايا المترابطة داخل الدماغ والحبل الشوكي والأعصاب البصرية ، من الخلايا العصبية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، وخلاياها المناعية الفطرية ، الخلايا الدبقية الصغيرة1. يمكن للنهج في المختبر في كثير من الأحيان أن يقلل بشكل كبير من عدد الفئران المطلوبة لإجراء أبحاث ذات مغزى. ومع ذلك ، فإن الطبيعة المعقدة للجهاز العصبي المركزي تجعل من المستحيل تلخيص الوضع في الجسم الحي باستخدام خطوط الخلايا. توفر مزارع الخلايا العصبية المختلطة أداة بحث قيمة للغاية للتحقيق في أسئلة علم الأعصاب (المناعي) في نموذج ذي صلة ، بما يتماشى مع مبادئ الاستبدال والتخفيض والصقل (3Rs) 2,3.
وصف طومسون وآخرون طريقة زراعة الخلايا باستخدام خلايا الحبل الشوكي قبل الولادة التي تتمايز إلى جميع أنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي الرئيسية المذكورة أعلاه4. يحتوي هذا النظام أيضا على تكوين المشبك العصبي ، ومحاور الميالين ، وعقد رانفييه. القيد الرئيسي لطريقة الزراعة هذه هو أنه ، كونه الحبل الشوكي ، فإنه لا يصمم الدماغ بشكل مفيد ، وتنتج الخلية من الحبل الشوكي الجنيني في اليوم 13 (E13) تضيق. وبالتالي ، فإن هذا يحد من عدد الحالات التجريبية التي يمكن التحقيق فيها. لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نظام جديد لزراعة الخلايا يلخص خصائص الدماغ مع زيادة إنتاجية الخلايا لتقليل متطلبات الحيوانات.
باستخدام Thomson et al. كنقطة انطلاق ، قمنا بتطوير نموذج زراعة الخلايا المستمد فقط من أدمغة الفئران قبل الولادة. تحتوي هذه الثقافات على نفس مجموعات الخلايا والترابط وخيارات العلاج مثل مزارع الحبل الشوكي ، باستثناء وجود ميالين أقل بالمقارنة. ومع ذلك ، فإن وجود نموذج الجهاز العصبي المركزي في المختبر مع إنتاجية خلايا أعلى بثلاثة أضعاف تقريبا هو أكثر كفاءة ، ويتطلب عددا أقل من الفئران ووقتا أقل في معالجة الأجنة. لقد قمنا بتحسين نظام الاستزراع الفريد هذا للعديد من التطبيقات والمقاييس النهائية ، بما في ذلك استخدام أغطية زجاجية للتحليل المجهري وأحجام مختلفة من ألواح الآبار البلاستيكية ، بما في ذلك ألواح 96 بئرا للأبحاث عالية الإنتاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
امتثلت جميع التجارب على الحيوانات للقوانين والمبادئ التوجيهية المحلية لاستخدام الحيوانات ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية المحلية في جامعة غلاسكو. تم إيواء الحيوانات في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوانات في المملكة المتحدة لعام 1986 ، تحت رعاية ترخيص مشروع وزارة الداخلية في المملكة المتحدة. في هذه الدراسة ، تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6J المرباة في المنزل. يوصى باستخدام الإناث الشابات (8-12 أسبوعا) بسبب ارتفاع معدل نجاح الحمل ؛ يمكن إعادة استخدام الذكور لجولات متعددة من التكاثر. يمثل الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية للطريقة الموصوفة لتوليد ثقافات عصبية ودبقية مختلطة.
1. إعداد مستهلكات زراعة الأنسجة
- قم بإعداد الأطباق و / أو الأطباق التي تحتوي على أغطية مجهرية داخل خزانة أمان من الفئة 2. تعقيم جميع الكواشف أو الأوتوكلاف لضمان العقم خلال فترة الاستزراع.
- أضف الحجم المناسب من BA-PLL (13.2 ميكروغرام / مل بولي-L-ليسين هيدروبروميد [PLL] في محلول حمض البوريك [BA] [50 mM حمض البوريك ، 12.5 mM رباعي الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 8.5] ؛ انظر جدول المواد) إلى كل بئر (1000 ميكرولتر / بئر في صفيحة 6 آبار ، 100 ميكرولتر / بئر في لوحة 96 بئر ؛ يتم تلخيص الأحجام في الجدول 1). بالنسبة لأغطية الفحص المجهري ، أضف 20 مل من BA-PLL إلى طبق زراعة الأنسجة بقطر 9 سم يحتوي على 200 غطاء معقم ، وقم بالدوران لتوزيعها بالتساوي.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
- قم بإزالة محلول BA-PLL من كل بئر أو طبق يحتوي على أغطية مجهرية ، واغسله بإضافة 20 مل من الماء المعقم ، وتحريك أغطية الغطاء ، ثم إزالة الماء. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات. بالنسبة للطبق الذي يحتوي على أغطية ، اترك الماء المعقم في طبق زراعة الأنسجة في الغسيل النهائي لإزالة أغطية الغطاء بسهولة.
- قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل باستخدام ماصة معقمة واتركها تجف لمدة 2 ساعة على الأقل طوال الليل.
- تخزين لوحات المغلفة في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أشهر.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام حمض البوريك المحضر بمحلول بولي ل ليسين (BA-PLL) حتى ثلاث مرات ، مع إضافة PLL جديد في كل مرة. قم بتخزين BA-PLL في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يتم التعامل مع الأطباق باستخدام BA-PLL ، حيث يسمح PLL للخلايا بالالتصاق والنمو. بدون هذا العلاج ، سوف ترفع الخلايا بعد حوالي 1 أسبوع من الثقافة ولم تعد قادرة على التمايز.
2. تشريح الأدمغة الجنينية E17
- شارك في إيواء واحد أو عدة فئران أنثى مع فأر ذكر. تحقق من الإناث يوميا بحثا عن سدادة مخاطية ، مما يشير إلى حدوث التزاوج.
ملاحظة: يجب فصل أي إناث فئران "مسدودة" عن الذكر لضمان تاريخ البدء الصحيح للحمل. يمكن وزن الفئران لتأكيد الحمل أو مراقبتها بصريا. - إعدام الفأر الحامل في E17 باستخدام الطرق المناسبة وفقا لإرشادات وقوانين رعاية الحيوان المحلية ، على سبيل المثال ، عن طريق رفع تركيز ثاني أكسيد الكربون (CO2) ، أو جرعة زائدة من مخدر مميت ، أو خلع الرقبة.
ملاحظة: يجب ألا تؤدي الطريقة المختارة إلى تعطيل الأجنة. في هذه الدراسة ، تم استخدام التعرض لتركيز متزايد من غاز ثاني أكسيد الكربون متبوعا بتأكيد الوفاة عن طريق قطع الشريان الفخذي لإعدام السدود الحامل. - ضع الفأر الحامل الذي تم إعدامه على ظهره على لوح التشريح ؛ في حين أن تثبيته ليس مطلوبا ، إلا أنه قد يسهل الأمر على الباحثين عديمي الخبرة. قرصة خط الوسط من البطن باستخدام ملقط. باستخدام مقص حاد ، قم بفتح البطن من خلال الجلد والبريتوني فوق خط الوسط من الأعضاء التناسلية إلى القفص الصدري ، مع الحرص على عدم ثقب الرحم.
- يحتوي رحم الفأر على قرنين ، يحتوي كل منهما عادة على واحد إلى خمسة أجنة. قم بإزالة الرحم الذي يحتوي على الأجنة من الأم وضعه على الفور على الجليد.
- قطع كيس الصفار على جانب المشيمة ، مع الحرص على عدم إتلاف الأجنة ، وإزالة الأجنة من كيس صفار البيض.
- قطع رأس الأجنة على الفور. أضف الرؤوس مقطوعة الرأس إلى طبق مع محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) بدون الكالسيوم (Ca 2+) والمغنيسيوم (Mg2+) (HBSS-/-) على الثلج.
ملاحظة: إذا كان التنميط الجيني مطلوبا ، يمكن للمرء إزالة الذيل في هذه المرحلة للتحليل الجيني. عندما يتوقع وجود أنماط وراثية متعددة ، يجب الاحتفاظ برؤوس كل جنين بشكل منفصل للزراعة. - باستخدام ملقط بزاوية ، ضع الرأس على جانبه المواجه لليسار.
- بيرس العين مع حافة واحدة من ملقط ، عقد بقوة الذقن مع الآخر.
- بدءا من القفا ، قم بتمزيق جلد فروة الرأس برفق على طول خط الوسط باتجاه طرف الخطم.
- عند الدخول من خلال الحبل الشوكي ، الذي يمكن ملاحظته كشكل بيضاوي أبيض ، استخدم الملقط المائل لفتح الجمجمة على طول خط الوسط ، مما يؤدي إلى كشف الدماغ.
- قشر الجمجمة برفق بعيدا على الجانب المواجه لأعلى ، وكشف الدماغ.
- ارفع الدماغ من الجمجمة ، وتخلص من الجمجمة بمجرد إزالة الدماغ بالكامل.
- باستخدام الملقط ، قم بإزالة السحايا ، والتي يمكن ملاحظتها كغشاء رقيق مع أوعية دموية كثيفة.
- ضع الأدمغة في بيجو (انظر جدول المواد) يحتوي على 2 مل من HBSS-/- على الثلج.
- كرر الخطوات من 2.6 إلى 2.13 مع الأدمغة المتبقية ، مع إضافة ما يصل إلى أربعة أدمغة لكل بيجو.
- أضف 250 ميكرولتر من 10x تربسين إلى بيجو وسحن الأدمغة عن طريق هز بيجو. احتضان لمدة 15 دقيقة على 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات من هذه النقطة فصاعدا في غطاء زراعة الأنسجة المعقمة. - ذوبان 2 مل من مثبطات تربسين فول الصويا (Leibovitz L-15، 0.52 ملغ/مل مثبط التربسين من فول الصويا، 40 ميكروغرام/مل DNase I، 3 ملغ/مل من ألبومين مصل البقر [BSA] الجزء الخامس؛ انظر جدول المواد) من -20 درجة مئوية بوضعه عند 37 درجة مئوية.
- أضف 2 مل من مثبطات SD إلى كل بيجو يحتوي على أدمغة (لكل بيجو يحتوي على ما يصل إلى أربعة أدمغة) ، وهز بيجو مرة أخرى لتفريقه بالتساوي.
ملاحظة: يقلل مثبط SD من نشاط التربسين لمنع الهضم غير الضروري للعينات والحفاظ على صلاحية الخلية. - بدون طرد مركزي ، قم بإزالة 2 مل من المادة الطافية من كل بيجو وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، مع الحرص على عدم نقل كتل الخلايا.
- سحن الخلايا المتبقية في بيجو بإبرة 19 جم متصلة بحقنة سعة 5 مل عن طريق استنشاق المعلق مرتين. سيؤدي ذلك إلى إنشاء خليط سميك يشبه المخاط.
- كرر مرتين أخريين باستخدام إبرة 21 جرام. إذا كانت هناك كتل متبقية ، فقم بالسحن مرة أخرى بإبرة 21 جرام.
- انقل الخلايا من bijou إلى نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل (من الخطوة 2.18) باستخدام إبرة 23 جرام.
- جهاز طرد مركزي عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة كل المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي آخر سعة 15 مل ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات السائبة في الجزء السفلي التي تحتوي على الخلايا المطلوبة.
- أجهزة الطرد المركزي الطافية مرة أخرى في 200 × غرام في RT لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: هذه الخطوة ليست ضرورية ، ولكن إذا كان المرء يحتاج إلى العديد من الخلايا أو لديه عدد قليل من الأجنة ، فيمكن للمرء تنفيذ هذه الخطوة لاستعادة أكبر عدد ممكن من الخلايا من المادة الطافية. - باستخدام 10 مل من وسائط الطلاء (PM) (49٪ وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين [قلم / سترب] ، 25٪ مصل حصان ، 25٪ HBSS مع Ca 2+ و Mg2+ [HBSS +/+] ؛ انظر جدول المواد) ، ادمج الكريتين وأعد تعليقهما معا لإنشاء تعليق خلية كاملة.
- عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق وإما مقياس الدم أو عداد الخلايا الرقمية ، وقم بتخفيف تعليق الخلية باستخدام PM إلى تركيز 1.8 × 106 خلايا / مل.
3. تصفيح الخلايا
- أضف الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى التنسيق المطلوب كما هو مفصل في الجدول 1: 1000 ميكرولتر لكل بئر في شكل 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر لكل بئر في شكل 96 بئرا ، أو 100 ميكرولتر لكل غطاء جانبي.
- احتضان لمدة 2-4 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ -7٪ CO2. تحقق من أن الخلايا قد التصقت باستخدام مجهر مقلوب.
- قم بإزالة الوسائط وقم بتعبئتها بوسائط تمايز جديدة (DM +: DM- بما في ذلك 10 ميكروغرام / مل من الأنسولين. DM-: DMEM ، 1٪ قلم / بكتيريا ، 50 نانومتر هيدروكورتيزون ، 10 نانوغرام / مل بيوتين ، 2.5 مل 100x N1 مكمل إعلامي ؛ انظر جدول المواد). المجلدات مفصلة في الجدول 1. اضغط لأسفل على أي أغطية عائمة باستخدام طرف ماصة معقم.
4. الحفاظ على الثقافات
ملاحظة: تتطلب هذه الثقافات التغذية ثلاث مرات أسبوعيا لدعم النمو الأمثل والتمايز. ستصل الثقافات إلى الصحة والنضج الأمثل للتجارب على DIV (أيام في المختبر) 21. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى 28 يوما ، وبعد ذلك تتدهور الثقافات بسرعة.
- ثلاث مرات في الأسبوع حتى DIV12 ، استبدل جزءا من المادة الطافية ب DM + طازج عن طريق إزالة 500 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئرا ، أو 500 ميكرولتر لكل طبق يحتوي على ثلاث أغطية ، وإضافة 600 ميكرولتر لكل بئر في شكل 6 آبار ، 60 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئر ، أو 600 ميكرولتر لكل طبق غطاء منزلق (الجدول 1).
- ثلاث مرات في الأسبوع من DIV13 فصاعدا ، استبدل جزءا من المادة الطافية ب DM- طازج عن طريق إزالة 500 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئرا ، أو 500 ميكرولتر لكل طبق يحتوي على ثلاث أغطية ، وإضافة 600 ميكرولتر لكل بئر في شكل 6 آبار ، 60 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئر ، أو 600 ميكرولتر لكل طبق غطاء منزلق (الجدول 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مجهريه
تعتبر الثقافات المزروعة على أغطية زجاجية مثالية للتحليل عن طريق الفحص المجهري. لتصور تطور الثقافات ، تم تثبيت قسائم الغطاء في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في نقاط زمنية متعددة من DIV0 (بمجرد إرفاق الخلايا) حتى DIV28. تم تلطيخ الثقافات للتصوير المناعي كما هو موضح سابقا5 باستخدام ثلاث مجموعات تلطيخ مختلفة: NG2 (الخلايا قليلة التغصن غير الناضجة) و nestin (الخلايا الجذعية العصبية / السلفية) كعلامات تنموية ، SMI31 (محاور) ، MBP (المايلين) ، و NeuN (جسم الخلية العصبية) كعلامات عصبية ، أو CNP (oligodendrocytes) ، GFAP (الخلايا النجمية) ، و Iba1 (الخلايا الدبقية الصغيرة) كعلامات دبقية (الشكل 2).
تم قياس أنواع الخلايا المختلفة باستخدام خطوط أنابيب CellProfiler (بناء على ′,6-diamidino-2-phenylindole-positive (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). تم إنشاء كل نقطة بيانات فردية من متوسط 10 صور مأخوذة من ثلاث قسائم تغطية لكل نقطة زمنية. بالنسبة للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والخلايا قليلة التغصن ، تم حساب النسبة المئوية لنوع الخلية لكل خلية 4 ′،6-diamidino-2-phenylindsole إيجابية (DAPI +). تم استخدام مجال النسبة المئوية للعرض بدلا من عدد الخلايا لتحديد عدد الخلايا النجمية. كان هذا بسبب صعوبات التمييز بين الخلايا الفردية لأنها تتداخل بشكل متكرر (الشكل 2M ، N). وصلت الثقافات إلى ذروة النضج وكثافة الخلايا في DIV21 ، وبعد ذلك بدأت الثقافات في التدهور (الشكل 2N).
الأهم من ذلك ، يمكن بسهولة علاج هذه الثقافات بالأدوية ، مثل العلاجات المحتملة ، أو استخدامها لتتبع العدوى في المختبر . في هذا المثال ، تم نقل الثقافات على أغطية إلى صفيحة من 24 بئرا وأصيبت بفيروس Semliki Forest (SFV) (سلالة SFV6) 6 ، والذي يعبر عن zsGreen في الخلايا المصابة. تم استخدام تعدد العدوى (MOI - عدد جزيئات الفيروس المضافة لكل خلية) من 0.05 ، كما تمت معايرته على خلايا كلى الهامستر الصغيرة (BHK) ، لضمان انخفاض مستوى العدوى. بعد 0-72 ساعة بعد الإصابة (hpi) ، تم تثبيت الثقافات في 4٪ PFA وتلطيخها للتحليل بواسطة التصوير المناعي. يوضح الشكل 3 أنه ، تمشيا مع العدوى في الجسم الحي ، يصيب SFV بشكل أساسي الخلايا قليلة التغصن والخلايا العصبية6.
qRT-PCR
بالإضافة إلى الفحص المجهري ، يمكن استخدام مزارع الجهاز العصبي المركزي هذه للتحليل بالطرق الجزيئية ، مثل RT-qPCR لاستجابات mRNA للعلاج. لمزيد من التحقيق في الاستجابة الفطرية المضادة للفيروسات ، تمت معالجة مزارع الصفائح المكونة من 6 آبار بمجموعة من جرعات السيتوكين بيتا المضاد للفيروسات (IFN-β) لمدة 24 ساعة. تم تحليل الثقافات باستخدام جوانيديوم-ثيوسيانات / الفينول ، وتم عزل الحمض النووي الريبي وتحويله إلى cDNA وتحليله بواسطة qPCR كما هو موضح سابقا7. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن قياس التعبير التفاضلي للعديد من الجينات. هنا ، تم قياس تنظيم Ccl5 كميا مقابل جين التدبير المنزلي 18s. CCL5 هو سيتوكين كيميائي (كيموكين) يشارك في الاستجابة الالتهابية. أدى العلاج ب IFN-β إلى زيادة تنظيم Ccl5 mRNA في الثقافات (الشكل 4 أ).
مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
يعد تنسيق الثقافات المكون من 96 بئرا أداة ممتازة لفحوصات عالية الإنتاجية للعلاجات. للتحقق مما إذا كان تنظيم Ccl5 mRNA يؤدي إلى التعبير عن بروتين CCL5 ، تم قياس CCL5 في طاف الثقافات بواسطة ELISA ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). في هذا المثال ، تمت معالجة 96 مزرعة بئر في نسختين مع 27 جرعة إضافية من IFN-β لتوليد منحنى استجابة الجرعة (الشكل 4B). تماشيا مع زيادة تعبير mRNA (الشكل 4A) ، كانت هناك زيادة في CCL5 المنطلق في المادة الطافية. كما هو متوقع ، يوضح الشكل 4C وجود علاقة واضحة بين mRNA وتعبير البروتين.
قياس التدفق الخلوي
يعد قياس التدفق الخلوي أداة قوية للتحقيق في وقت واحد في التعبير عن العديد من العلامات داخل و / أو خارج الخلية. ومع ذلك ، فإن تحليل الثقافات المعقدة والتفاعلية للغاية عن طريق قياس التدفق الخلوي يمكن أن يكون صعبا بسبب تلف الخلايا وموتها عند أخذ الخلايا من المزرعة إلى تعليق خلية واحدة للمعالجة والتحليل. بمقارنة مجموعة متنوعة من البروتوكولات باستخدام 0.05٪ -0.5٪ حمض التربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، 1x-10x تربسين بدون EDTA ، وكاشف تفكك لطيف ، وجد أنه بعد معالجة مزارع الألواح المكونة من 6 آبار بنسبة 0.05٪ من التربسين-EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع التقليب اللطيف ، تم رفع الخلايا بتثليج لطيف لإنشاء تعليق أحادي الخلية. خاصة بالنسبة لتحليل التدفق الخلوي لخلايا الجهاز العصبي المركزي ، من الأهمية بمكان أن تكون لطيفا أثناء تحضير الخلية ، وتقليل خطوات الغسيل ، والحرص الشديد على إبقاء الخلايا عند 4 درجات مئوية أو على الجليد في جميع الأوقات.
لتقييم الجدوى وأنواع الخلايا في هذا التعليق أحادي الخلية ، تم تلطيخ الخلايا بصبغة قابلية للحياة وأجسام مضادة موسومة بالفلورسنت ضد CD45 و CD11b و O4 و ACSA-2 و CD24 للسماح بتصور كل مجموعة خلايا فردية في الثقافات8 (الشكل 5). تم الحصول على حوالي 70٪ من صلاحية الخلية من هذه الطريقة ، بمتوسط حوالي 2 × 10 6 خلايا مفردة قابلة للحياة لكل لوحة ذات6 آبار (الشكل 5C). تماشيا مع نتائج الفحص المجهري (الشكل 2N) ، كانت هناك أعداد كبيرة من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والخلايا النجمية ، بينما كانت الخلايا قليلة التغصن هي الأقل وفرة.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الطريقة الموصوفة لتوليد مزارع عصبية ودبقية مختلطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مزارع E17 للجهاز العصبي المركزي ملطخة بعلامات خلايا التصوير المناعي بمرور الوقت. تم إصلاح الخلايا بنسبة 4٪ PFA قبل أن تتخلل وتلطخ لتصور مجموعات سكانية مختلفة. صور تمثيلية للعلامات التنموية (A ، D ، G ، J ، M) NG2 (خلايا سلائف oligodendrocyte) و nestin (خلايا السلائف العصبية والدبقية) ، (B ، E ، H ، K ، N) العلامات العصبية SMI31 (المحاور) ، MBP (المايلين) ، و NeuN (جسم الخلية العصبية) ، و (C ، F ، I ، L ، O) العلامات الدبقية CNP (oligodendrocytes) ، GFAP (الخلايا النجمية) ، و Iba1 (الخلايا الدبقية الصغيرة). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. (P) عدد DAPI لكل مم2 ، n = 3 ، كل n من ثلاث نسخ تقنية من 10 صور لكل ثلاث نسخ. (Q) يتم حساب الخلايا كنسبة مئوية من خلايا DAPI + (الخلايا الدبقية الصغيرة ، oligodendrocytes ، والخلايا العصبية) والنسبة المئوية لمجال الرؤية (الخلايا النجمية) ، n = 3 ، كل n من ثلاث نسخ تقنية من 10 صور لكل ثلاث نسخ. أشرطة الخطأ هي ± خطأ قياسي للمتوسط (SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عدوى فيروس غابة سيمليكي (SFV) لمزارع الجهاز العصبي المركزي E17 بمرور الوقت. صور تمثيلية لمزارع السيطرة غير المصابة (A ، C ، E ، G) والثقافات المصابة ب 0.05 MOI SFV (B ، D ، F ، H). أصيبت الخلايا لمدة 0-48 ساعة وملطخة ب CNP (علامة oligodendrocyte) و NeuN (علامة الخلايا العصبية) (A-D) أو GFAP (علامة الخلايا النجمية) و Iba1 (علامة الخلايا الدبقية الصغيرة) (E-H). تشير الأسهم البيضاء إلى خلية مصابة. تعبر هذه السلالة من SFV عن البروتين الفلوري الأخضر zsGreen لتمكين تتبع العدوى الفيروسية. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: CCL5 mRNA والتعبير البروتيني لمزارع E17 CNS بعد العلاج ب IFN-β. تمت معالجة الخلايا في شكل لوحة 6 آبار (mRNA) أو 96 لوحة بئر (بروتين) لمدة 24 ساعة مع مجموعة من جرعات IFN-β. (أ) التعبير عن Ccl5 mRNA بعد العلاج ب 0-100 نانوغرام / مل IFN-β ، بيولوجيا n = 2 ، كل منها مأخوذ من ثلاث نسخ تقنية. (ب) تركيز CCL5 في المادة الطافية بعد معالجة 0-100 نانوغرام / مل IFNβ ، البيولوجية n = 1 ، مأخوذة من ثلاث نسخ تقنية. (ج) زيادة تنظيم mRNA Ccl5 الخلوي مقابل تركيز بروتين CCL5 في المادة الطافية ذات خط الاتجاه اللوغاريتمي. أشرطة الخطأ ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: استراتيجية بوابة قياس التدفق الخلوي لتوليد مجموعات أحادية الخلية من مزارع الجهاز العصبي المركزي E17. تم فصل الخلايا باستخدام 0.05٪ من التربسين-EDTA ، ملطخة بالأجسام المضادة المناسبة ، وفرزها إلى مجموعات خلايا فردية. (أ-ج) استراتيجية البوابات لفرز الخلايا الحية المفردة. (د) استراتيجية لاختيار الخلايا الدبقية الصغيرة (CD45+ CD11b+). ه: استراتيجية اختيار الخلايا قليلة التغصن (CD45- CD11b- O4+). (F) استراتيجية لفرز الخلايا النجمية (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+ CD24+) والخلايا العصبية (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (ز) تجمعات الخلايا الفردية متراكبة بعضها على بعض، وتظهر تجمعات سكانية منفصلة. (H) أنواع الخلايا الفردية كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا التي تم فرزها ، n = 4. أشرطة الخطأ ± SEM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الشكل المطلوب | BA-PLL / بئر | ماء للغسيل | خلايا الحجم في وسائط الطلاء (PM) للطلاء | تعبئة وسائل الإعلام | إزالة / إضافة عند تغذية الثقافات (3x / أسبوع) |
| 6 تنسيق جيد (9.6cm2) | 1000 ميكرولتر | 1000 ميكرولتر | 1000 ميكرولتر | -400 ميكرولتر | -500 ميكرولتر الوسائط |
| +600 ميكرولتر DM+ | +600 ميكرولتر DM+/- | ||||
| 96 شكل بئر (0.32 سم2) | 100 ميكرولتر | 100 ميكرولتر | 50 ميكرولتر | +60 ميكرولتر DM+ | -50 ميكرولتر الوسائط |
| +60 ميكرولتر DM+/- | |||||
| غطاء في شكل طبق | 20 مل لكل 200 غطاء | 20 مل | 100 ميكرولتر لكل غطاء | +600 ميكرولتر DM+ | -500 ميكرولتر الوسائط |
| +300 ميكرولتر مساء | +600 ميكرولتر DM+/- |
الجدول 1: الكميات المطلوبة لإعداد البلاستيك زراعة الأنسجة المغلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجهاز العصبي المركزي عبارة عن شبكة معقدة تمتد من الدماغ وصولا إلى الحبل الشوكي وتتكون من العديد من أنواع الخلايا ، والخلايا العصبية في الغالب ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا الدبقيةالصغيرة 1. نظرا لأن كل خلية لها دور مهم في الحفاظ على التوازن وتوليد استجابات مناسبة للتحديات في الجهاز العصبي المركزي9،10،11 ، فإن نظام الثقافة الذي يحتوي على كل أنواع الخلايا هذه يعد أداة مفيدة ومتعددة الاستخدامات للتحقق من كيفية تفاعل الدماغ مع المثير. إن القدرة على دراسة هذه الخلايا وتفاعلاتها في سياق المختبر تعني أنه يمكن استخدام مجموعة كبيرة ومتنوعة من التقنيات للتحقيق في الأسئلة التجريبية المختلفة بسهولة. لقد حددنا طريقة سريعة وفعالة للحصول على أنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي الرئيسية واستزراعها من دماغ ما قبل الولادة ، والتي يمكن أن تحاكي مجموعات الخلايا الفردية في دماغ الفأر البالغ12.
تستخدم البروتوكولات الموضوعة سابقا لتوليد ثقافات الجهاز العصبي المركزي الحبال الشوكية E13.5 4,5. بالإضافة إلى وجود نموذج مناسب للحبل الشوكي ، من المهم للغاية أن يكون لديك نموذج يلخص الدماغ. لذلك ، تم استخدام أدمغة من هذه الفئران E13.5 في الأصل لتوليد ثقافات الجهاز العصبي المركزي الموصوفة هنا باستخدام نفس البروتوكول. ومع ذلك ، بعد DIV14 ، بدأت الخلايا في تكوين مجاميع كبيرة مع أجسام خلايا عصبية مكتظة بكثافة. بينما كانت الخلايا النجمية موجودة ، ليس من الواضح ما إذا كانت موزعة بالتساوي. من غير الواضح ما إذا كانت الخلايا الموجودة في وسط أجسام الخلايا هذه ستتلقى ما يكفي من العناصر الغذائية والأكسجين من وسط المزرعة كما تفعل الخلايا الخارجية. عند التعرض للحرمان من الأكسجين والمغذيات ، تكون الخلايا العصبية عرضة للمرور عبر موت الخلايا المبرمج وإطلاق إشارات الإجهاد إلى الخلايا الدبقية13 ، مما قد يؤدي إلى النمط الظاهري14 الالتهابي. كان يعتقد أن تكوين الخلايا العصبية هو السبب المحتمل لهذه المجاميع المعبأة بكثافة ، وتنحسر هذه المرحلة بواسطة E1715. عندما تم استخدام أدمغة من أجنة الفئران E17 ، كانت الخلايا لا تزال تشكل شبكات ولكنها لم تتجمع في المجاميع الكبيرة التي شوهدت في E13.5 ، وبالتالي كانت تعتبر عمرا أكثر ملاءمة لمزارع الدماغ التي سيتم إنشاؤها منها.
تؤدي التقنية الحالية أيضا إلى عدد أكبر من الخلايا التي تم الحصول عليها من حمل واحد (بمتوسط 1 × 107 خلايا / دماغ مقارنة ب 3-4 × 106 خلايا / الحبل الشوكي)7. بالنسبة للفأر الحامل العادي الذي لديه 8-10 أجنة ، يرتبط هذا بما يصل إلى 54 حالة تجريبية مختلفة في شكل لوحة 6 آبار ، أو 150 حالة تجريبية للفحص المجهري (مقارنة ب 19 و 64 ، على التوالي ، من الحبل الشوكي). على هذا النحو ، تعد مزارع الجهاز العصبي المركزي هذه أداة رائعة لتقليل العدد المطلوب من الفئران16. على وجه الخصوص ، يمكن استخدام تنسيق 96 بئرا بسهولة للمقايسات عالية الإنتاجية ، مثل تمكين فحص الأدوية المرشحة قبل الاختبار على الحيوانات ، مما يقلل بشكل كبير من عدد الحيوانات المطلوبة لمثل هذه الدراسات. نأمل أن يؤدي ذلك إلى تحسين معدل النجاح المنخفض لاختبار أدوية الجهاز العصبي المركزي في الحيوانات وتحسين الترجمة إلى التجارب السريرية في البشر17,18.
تصل الثقافات إلى ذروة النضج بواسطة DIV21. يزداد عدد الخلايا حتى هذه النقطة الزمنية ، وبعد ذلك تبدأ الخلايا في التدهور مع تناقص أعداد كل نوع من الخلايا. تم قياس ذلك من خلال النظر إلى أرقام الخلايا الكمية (الشكل 2N) وكذلك عدد نوى pyknotic (بقع DAPI الكثيفة) (الشكل 2M). في حين أن العلامات التنموية nestin و NG2 لا تزال معبرة على DIV14 (الشكل 2G) و DIV21 (الشكل 2J) ، فإن هذا يرجع إلى أن بعض الخلايا النجمية تمر بداء نجمي ، والذي ينظم العش19 ، في حين أن بعض الخلايا قليلة التغصن ليست ناضجة تماما وبالتالي لا تزال تعبر عن بعض NG220. استنادا إلى التحقق من صحة الفحص المجهري ، لا يزال جزء صغير فقط من الخلايا يعبر عن علامات النمو مقارنة بالخلايا الناضجة تماما بواسطة DIV21 (الشكل 2I ، L) ؛ لذلك ، تنضج الثقافات إلى حد كبير بحلول هذا الوقت. وتجدر الإشارة إلى أن كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي متغيرة للغاية عبر الجهاز العصبي المركزي الفأر. مستوى الخلايا الدبقية الصغيرة ، كما هو محدد بواسطة تعبير Iba1 باستخدام الفحص المجهري ، هو في النهاية العالية لهذه الكثافة في ثقافاتنا12. من المحتمل أن تكون النسبة العالية من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنجو من إجراء قياس التدفق الخلوي بسبب كون الخلايا الدبقية الصغيرة أكثر قوة من خلايا الجهاز العصبي المركزي الأخرى ، والتي لها امتدادات دقيقة بشكل عام ، وبالتالي فهي أكثر عرضة للتلف أثناء تحضير قياس التدفق الخلوي.
يستغرق الأمر 3 أسابيع فقط بعد التشريح حتى تصبح الخلايا جاهزة للتجربة ، وهي أقصر من معظم الطرق البشرية في المختبر ، مثل المواد العضوية أو النماذج المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثةمتعددة القدرات 21. طالما أن البحث في الجسم الحي مطلوب لضمان سلامة العلاجات الجديدة ، فإن استخدام طرق زراعة الخلايا في المختبر مثل طريقتنا سيساعد في اختبار السمية والفعالية بكفاءة قبل الاختبار على الحيوانات ، مما يقلل من متطلبات الحيوانات ويعزز ترجمة البحث من المختبر إلى في الجسم الحي. نأمل أن يؤدي هذا في النهاية إلى ترجمة أكثر كفاءة للتجارب السريرية القائمة على الإنسان أيضا. في النهاية ، تم إنشاء هذه الثقافات للسماح بدراسة الجهاز العصبي المركزي. بينما لا يمكن للأنظمة في المختبر التعبير بشكل كامل عن تعقيد الجهاز العصبي المركزي ، فإن الثقافات الأولية المشتقة من الخلايا تمثل بدقة أكبر خصائص الجهاز العصبي المركزي في الجسم الحي 22,23. يمكن أن تسمح الأساليب في المختبر باتباع نهج أكثر اختزالا للتحقيق في الجهاز العصبي المركزي في غياب الخلايا المناعية المتسللة24 وسلامة حاجز الدم في الدماغ25. يمكن أن تؤدي إزالة هذه الطبقة من التعقيد إلى تسهيل كشف الآليات. على هذا النحو ، فإن نظام الاستزراع الحالي هو أداة مفيدة للإجابة على أسئلة البحث التي تكمل أبحاث الحيوانات في الجسم الحي.
إن القدرة على حصاد خلايا الجهاز العصبي المركزي وعزلها واستزراعها قد عززت بالفعل بشكل كبير فهمنا للجهاز العصبي المركزيالفطري 16. توضح هذه المقالة تشريح أدمغة الفئران E17 وما ينتج عن ذلك من تثليج وزراعة الخلايا لتوليد نظام زراعة الخلايا الذي يحتوي على جميع أنواع الخلايا الرئيسية في الجهاز العصبي المركزي. تم استخدام تقنيات جزيئية متعددة في هذه الثقافات ، مما يدل على فعالية هذه الثقافات في التحقيق في الجهاز العصبي المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر أعضاء مختبرات إدغار ولينينجتون ، ولا سيما البروفيسور كريس لينينجتون ، والدكتورة ديانا أرسيني ، والدكتورة كاتيا موكليش ، على نصائحهم وتعليقاتهم المفيدة ومساعدتهم في تغذية الثقافات أثناء إنشاء هذه الثقافات. نتوجه بشكر خاص إلى الدكتور Muecklisch لتوفير نقاط البداية لخطوط أنابيب Cell Profiler. تم دعم هذا العمل من قبل جمعية التصلب المتعدد (المنحة 122) ومؤسسة يوري ولورنا تشيرناجوفسكي إلى MP. تمويل جامعة غلاسكو ل JC و MP ؛ و Wellcome Trust (217093 / Z / 19 / Z) ومجلس البحوث الطبية (MRV0109721) إلى GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
