Summary
Этот протокол представляет собой уникальный способ создания культур клеток центральной нервной системы из эмбрионального мозга мыши на 17-й день для нейро(иммуно)логических исследований. Эта модель может быть проанализирована с использованием различных экспериментальных методов, включая ОТ-кПЦР, микроскопию, ИФА и проточную цитометрию.
Abstract
Модели центральной нервной системы (ЦНС) должны повторять сложную сеть взаимосвязанных клеток, обнаруженных in vivo. ЦНС состоит в основном из нейронов, астроцитов, олигодендроцитов и микроглии. В связи с растущими усилиями по замене и сокращению использования животных были разработаны различные системы культивирования клеток in vitro для изучения свойств врожденных клеток, которые позволяют разрабатывать терапевтические средства для инфекций и патологий ЦНС. В то время как некоторые исследовательские вопросы могут быть решены с помощью систем культивирования клеток человека, таких как (индуцированные) плюрипотентные стволовые клетки, работа с клетками человека имеет свои собственные ограничения в отношении доступности, затрат и этики. Здесь мы описываем уникальный протокол выделения и культивирования клеток из эмбрионального мозга мыши. Полученные смешанные культуры нервных клеток имитируют несколько клеточных популяций и взаимодействий, обнаруженных в мозге in vivo. По сравнению с текущими эквивалентными методами, этот протокол более точно имитирует характеристики мозга, а также собирает больше клеток, что позволяет исследовать больше экспериментальных условий на одной беременной мыши. Кроме того, протокол относительно прост и легко воспроизводим. Эти культуры были оптимизированы для использования в различных масштабах, включая высокопроизводительные экраны на 96 лунок, 24-луночный микроскопический анализ и 6-луночные культуры для проточной цитометрии и количественного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР). Этот метод культивирования является мощным инструментом для исследования инфекции и иммунитета в контексте некоторой сложности ЦНС с удобством методов in vitro .
Introduction
Улучшение нашего понимания центральной нервной системы (ЦНС) имеет решающее значение для улучшения терапевтических возможностей для многих нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний. ЦНС, сложная сеть взаимосвязанных клеток в головном, спинном мозге и зрительных нервах, включает нейроны, олигодендроциты, астроциты и их врожденные иммунные клетки, микроглию1. Подход in vitro часто может резко сократить количество мышей, необходимых для проведения значимых исследований; однако сложная природа ЦНС делает невозможным повторение ситуации in vivo с использованием клеточных линий. Смешанные культуры нервных клеток представляют собой чрезвычайно ценный исследовательский инструмент для изучения вопросов нейро(иммуно)логии в соответствующей модели в соответствии с принципами замены, сокращения и уточнения (3R) 2,3.
Thomson et al. описали метод культивирования клеток с использованием пренатальных клеток спинного мозга, которые дифференцируются во все вышеупомянутые основные типы клеток ЦНС4. Эта система также имеет образование синапсов, миелинизированные аксоны и узлы Ранвье. Основным ограничением этого метода культивирования является то, что, будучи спинным мозгом, он не может с пользой моделировать головной мозг, и клетки, полученные на 13-й день эмбриона (E13), сжимают спинной мозг. Таким образом, это ограничивает количество экспериментальных условий, которые могут быть исследованы. Таким образом, это исследование было направлено на разработку новой системы клеточных культур, которая повторяет характеристики мозга с повышенным выходом клеток, чтобы снизить требования к животным.
Используя Thomson et al. в качестве отправной точки, мы разработали модель клеточной культуры, полученную исключительно из пренатального мозга мыши. Эти культуры имеют те же клеточные популяции, взаимосвязь и варианты лечения, что и культуры спинного мозга, за исключением того, что по сравнению с ними миелинизация меньше. Однако наличие модели ЦНС in vitro с примерно в три раза более высоким выходом клеток является более эффективным, требуя меньшего количества мышей и меньшего времени на обработку эмбрионов. Мы оптимизировали эту уникальную систему культивирования для различных последующих применений и масштабов, в том числе с использованием стеклянных покровных стекол для микроскопического анализа и пластиковых луночных пластин различных размеров, включая 96-луночные планшеты для высокопроизводительных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных соответствовали местным законам и рекомендациям по использованию животных и были одобрены местным комитетом по этической экспертизе в Университете Глазго. Животные были размещены в особых условиях, свободных от патогенов, в соответствии с Законом Великобритании о научных процедурах животных 1986 года под эгидой лицензии на проект Министерства внутренних дел Великобритании. Для этого исследования были использованы взрослые мыши C57BL/6J, выведенные собственными силами. Использование молодым женщинам (8-12 недель) рекомендуется из-за более высокой успешности беременности; Самцов можно повторно использовать для нескольких раундов разведения. На фиг.1 представлен схематический обзор описанного способа получения смешанных культур нейронов и глии.
1. Подготовка расходных материалов для тканевых культур
- Подготовьте пластины и/или посуду, содержащие покровные стекла для микроскопии, в шкафу безопасности класса 2. Стерилизуйте все реагенты или автоклав, чтобы обеспечить стерильность в период культивирования.
- Добавьте соответствующий объем БА-ФАПЧ (13,2 мкг/мл поли-L-лизинегидробромида [ФАПЧ] в буфере борной кислоты [БА] [50 мМ борной кислоты, 12,5 мМ тетрабората натрия, рН 8,5]; см. Таблицу материалов) в каждую лунку (1000 мкл / лунка в 6-луночном планшете, 100 мкл / лунка в 96-луночном планшете; объемы обобщены в таблице 1). Для микроскопических покровных стекол добавьте 20 мл BA-PLL в чашку для культивирования тканей диаметром 9 см, содержащую 200 стерильных покровных стекол, и перемешайте для равномерного распределения.
- Инкубировать при 37 °C в течение 1-2 часов.
- Удалите раствор BA-PLL из каждой лунки или чашки, содержащей покровные стекла для микроскопии, и промойте, добавив 20 мл стерильной воды, взбалтывая покровные стекла, а затем удаляя воду. Повторите этот шаг стирки три раза. Для посуды, содержащей покровные стекла, оставьте стерильную воду в чашке для культивирования тканей при окончательной стирке, чтобы легко удалить покровные стекла.
- Удалите как можно больше жидкости стерильной пипеткой и дайте высохнуть не менее 2 часов на ночь.
- Храните пластины с покрытием при температуре 4 °C до 2 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовленную борную кислоту с раствором поли-l-лизина (BA-PLL) можно использовать повторно до трех раз, каждый раз добавляя новый ФАПЧ. Хранить BA-PLL при температуре 4 °C. Чашки обрабатываются BA-PLL, так как PLL позволяет клеткам прилипать и расти. Без этого лечения клетки поднимутся примерно через 1 неделю культивирования и больше не смогут дифференцироваться.
2. Вскрытие эмбрионального мозга Е17
- Разместите одну или несколько самок мышей вместе с мышью-самцом. Ежедневно проверяйте самок на наличие слизистой пробки, указывающей на то, что спаривание состоялось.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любые «заткнутые» самки мышей должны быть отделены от самца, чтобы обеспечить правильную дату начала беременности. Мышей можно взвешивать для подтверждения беременности или контролировать визуально. - Выбраковка беременной мыши на E17 с использованием соответствующих методов в соответствии с местными рекомендациями и законами о защите животных, например, путем повышения концентрации углекислого газа (CO2), передозировки смертельного анестетика или вывиха шеи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный метод не должен нарушать эмбрионы. Для этого исследования воздействие растущей концентрации углекислого газа с последующим подтверждением смерти путем разрыва бедренной артерии использовалось для отбраковки беременных маток. - Положите выбракованную беременную мышь на спину на доску для вскрытия; Хотя закрепление его не требуется, это может облегчить задачу неопытным исследователям. Ущипните среднюю линию живота с помощью щипцов. С помощью острых ножниц разрежьте живот через кожу и брюшину по средней линии от гениталий до грудной клетки, стараясь не проколоть матку.
- Матка мыши имеет два рога, каждый из которых обычно содержит от одного до пяти эмбрионов. Извлеките матку, содержащую эмбрионы, из матери и сразу же поместите ее на лед.
- Разрежьте желточный мешок сбоку от плаценты, стараясь не повредить эмбрионы, и извлеките эмбрионы из желточного мешка.
- Немедленно обезглавливают эмбрионы. Добавьте обезглавленные головы в чашку со сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) без кальция (Ca 2+) и магния (Mg2+) (HBSS-/-) на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется генотипирование, на этом этапе можно удалить хвост для генетического анализа. Когда ожидается несколько генотипов, головки каждого эмбриона следует хранить отдельно для культивирования. - Используя угловые щипцы, расположите голову на боку, обращенном влево.
- Проткните глаз одним краем щипцов, крепко придерживая подбородок другим.
- Начиная с затылка, аккуратно разорвите кожу кожи головы по средней линии к кончику морды.
- Войдя через спинной мозг, заметный как белый овал, используйте угловые щипцы, чтобы расколоть череп по средней линии, обнажив мозг.
- Аккуратно снимите череп со стороны, обращенной вверх, обнажая мозг.
- Извлеките мозг из черепа, избавившись от черепа, как только мозг будет полностью удален.
- С помощью щипцов удаляют мозговые оболочки, которые заметны как тонкая мембрана с плотными кровеносными сосудами.
- Поместите мозг в бижутерию (см. Таблицу материалов), содержащую 2 мл HBSS-/- на льду.
- Повторите шаги с 2.6 по 2.13 с оставшимися мозгами, добавив до четырех мозгов на бижутерию.
- Добавьте 250 мкл 10-кратного трипсина в бижутерию и тритуируйте мозг, встряхивая бижутерию. Выдерживать 15 мин при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, начиная с этого момента, должны выполняться в стерильном капюшоне для культивирования тканей. - Разморозьте 2 мл ингибитора трипсина (SD) сои (Leibovitz L-15, 0,52 мг/мл ингибитора трипсина из сои, 40 мкг/мл ДНКазы I, 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина [BSA] фракции V; см. Таблицу материалов) от -20 °C, поместив его при 37 °C.
- Добавьте 2 мл ингибитора SD к каждому бижутерии, содержащему мозг (на бижутерию, содержащую до четырех мозгов), снова встряхивая бижутерию, чтобы равномерно распределить ее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибитор SD снижает активность трипсина, предотвращая ненужное переваривание образцов и сохраняя жизнеспособность клеток. - Без центрифугирования удалите 2 мл надосадочной жидкости из каждого бижутерии и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл, стараясь не переносить клеточные сгустки.
- Тритуируйте оставшиеся клетки в бижутерии иглой 19 г, прикрепленной к шприцу объемом 5 мл, путем двойной аспирации суспензии. Это создаст густую слизеобразную смесь.
- Повторите еще дважды, используя иглу 21 G. Если остались комки, тритуируйте еще раз иглой 21 G.
- Перенесите клетки из бижутерии в ту же центрифужную пробирку объемом 15 мл (из шага 2.18) с помощью иглы 23 G.
- Центрифуга при 200 x g при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
- Удалите всю надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 5 мл и перенесите ее в другую центрифужную пробирку объемом 15 мл, стараясь не нарушить рыхлую гранулу на дне, содержащую необходимые клетки.
- Снова центрифугируйте надосадочную жидкость при 200 x g при RT в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является существенным, но если требуется много клеток или мало эмбрионов, можно выполнить этот шаг, чтобы извлечь как можно больше клеток из надосадочной жидкости. - Используя 10 мл гальванических сред (PM) (49% модифицированной орлиной среды Дульбекко [DMEM], 1% пенициллина/стрептомицина [Pen/Strep], 25% лошадиной сыворотки, 25% HBSS с Ca 2+ и Mg2 + [HBSS+ /+]; см. Таблицу материалов), объедините и ресуспендируйте две гранулы вместе, чтобы создать целую клеточную суспензию.
- Подсчитайте клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра или цифрового счетчика клеток и разбавьте клеточную суспензию PM до концентрации 1,8 x 106 клеток / мл.
3. Покрытие ячеек
- Добавьте требуемый объем суспензии ячейки к требуемому формату, как указано в таблице 1: 1000 мкл на лунку в 6-луночном формате, 50 мкл на лунку в 96-луночном формате или 100 мкл на покровное стекло.
- Инкубировать в течение 2-4 ч при 37 °C с 5%-7%CO2. Проверьте прилипание клеток с помощью инвертированного микроскопа.
- Удалите среду и долейте ее новой дифференцировочной средой (СД+: СД, включая инсулин 10 мкг/мл. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 нМ гидрокортизон, 10 нг/мл биотина, 2,5 мл 100x N1 добавки среды; см. Таблицу материалов). Объемы приведены в таблице 1. Прижмите все плавающие покровные стекла стерильным наконечником пипетки.
4. Уход за культурами
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти культуры требуют подкормки три раза в неделю для поддержания оптимального роста и дифференциации. Культуры достигнут оптимального здоровья и зрелости для экспериментов на DIV (дни in vitro) 21. Клетки могут храниться в культуре до 28 дней, после чего культуры быстро вырождаются.
- Три раза в неделю до DIV12 заменяйте часть надосадочной жидкости свежим DM+, удаляя 500 мкл на лунку в 6-луночном формате, 50 мкл на лунку в 96-луночном формате или 500 мкл на посуду, содержащую три покровных стекла, и добавляя 600 мкл на лунку в 6-луночном формате, 60 мкл на лунку в 96-луночном формате, или 600 мкл на чашку с покровным стеклом (таблица 1).
- Три раза в неделю, начиная с DIV13, заменяйте часть надосадочной жидкости свежим DM-, удаляя 500 мкл на лунку в 6-луночном формате, 50 мкл на лунку в 96-луночном формате или 500 мкл на чашку, содержащую три покровных стекла, и добавляя 600 мкл на лунку в 6-луночном формате, 60 мкл на лунку в 96-луночном формате, или 600 мкл на чашку с покровным стеклом (таблица 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микроскопия
Культуры, выращенные на стеклянных покровных стеклах, идеально подходят для анализа с помощью микроскопии. Чтобы визуализировать развитие культур, покровные стекла фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в нескольких временных точках от DIV0 (после присоединения клеток) до DIV28. Культуры окрашивали для иммунофлуоресцентной визуализации, как описаноранее 5 , с использованием трех различных комбинаций окрашивания: NG2 (незрелые олигодендроциты) и нестин (нейрональные стволовые/клетки-предшественники) в качестве маркеров развития, SMI31 (аксоны), MBP (миелин) и NeuN (тело нейронной клетки) в качестве нейрональных маркеров или CNP (олигодендроциты), GFAP (астроциты) и Iba1 (микроглия) в качестве глиальных маркеров (рис. 2).
Различные типы клеток были количественно определены с использованием конвейеров CellProfiler (на основе ′,6-диамидино-2-фенилиндол-положительного (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). Каждая отдельная точка данных была сгенерирована в среднем из 10 изображений, сделанных с трех обложек за каждый момент времени. Для микроглии, нейронов и олигодендроцитов был рассчитан процент типа клеток на 4',6-диамидино-2-фенилиндол-положительную (DAPI+) клетку. Процентное поле зрения использовалось вместо количества клеток для количественной оценки количества астроцитов. Это было связано с трудностями дифференциации отдельных клеток, поскольку они часто перекрывались (рис. 2M, N). Культуры достигли пика зрелости и плотности клеток при DIV21, после чего культуры начали разлагаться (рис. 2N).
Важно отметить, что эти культуры можно легко лечить лекарствами, такими как потенциальные терапевтические средства, или использовать для отслеживания инфекций in vitro . В этом примере культуры на покровных стеклах были перенесены на 24-луночную пластину и инфицированы высоконейротропным вирусом Semliki Forest virus (SFV) (штамм SFV6)6, который экспрессирует zsGreen в инфицированных клетках. Кратность инфекции (MOI - количество вирусных частиц, добавленных в клетку) 0,05, титрованная на клетках почек детеныша хомяка (BHK), использовалась для обеспечения низкого уровня инфекции. Через 0-72 ч после инфицирования (hpi) культуры фиксировали в 4% PFA и окрашивали для анализа с помощью иммунофлуоресцентной визуализации. На рисунке 3 показано, что, в соответствии с инфекцией in vivo , SFV в основном инфицирует олигодендроциты и нейроны6.
к-ОТ-ПЦР
Помимо микроскопии, эти культуры ЦНС можно использовать для анализа молекулярными методами, такими как ОТ-кПЦР ответов мРНК на лечение. Для дальнейшего изучения врожденного противовирусного ответа 6-луночные культуры планшетов обрабатывали рядом доз мощного противовирусного цитокина интерферона бета (ИФН-β) в течение 24 часов. Культуры лизировали гуанидий-тиоцианатом/фенолом, а РНК выделяли, превращали в кДНК и анализировали с помощью кПЦР, как описано ранее7. С помощью этого метода можно измерить дифференциальную экспрессию многих генов. Здесь активация Ccl5 была количественно определена по отношению к гену домашнего хозяйства 18s. CCL5 представляет собой хемотаксический цитокин (хемокин), участвующий в воспалительной реакции. Лечение ИФН-β приводило к повышению регуляции мРНК Ccl5 в культурах (рис. 4A).
Иммуноферментный анализ (ИФА)
96-луночный формат культур является отличным инструментом для высокопроизводительных скринингов обработок. Чтобы выяснить, приводит ли активация мРНК Ccl5 к экспрессии белка CCL5, CCL5 измеряли в надосадочной жидкости культур методом ИФА в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). В этом примере 96-луночные культуры обрабатывали в двух экземплярах 27 инкрементными дозами ИФН-β для получения кривой доза-реакция (рис. 4B). В соответствии с повышенной экспрессией мРНК (рис. 4A) наблюдалось увеличение CCL5, высвобождаемого в надосадочной жидкости. Как и ожидалось, рисунок 4C демонстрирует четкую корреляцию между мРНК и экспрессией белка.
Проточная цитометрия
Проточная цитометрия является мощным инструментом для одновременного исследования экспрессии многих внутри- и/или внеклеточных маркеров. Однако анализ сложных, высокоинтерактивных культур с помощью проточной цитометрии может быть сложным из-за повреждения и гибели клеток при переносе клеток из культуры в одноклеточную суспензию для обработки и анализа. Сравнивая различные протоколы с использованием 0,05%-0,5% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1x-10x трипсина без ЭДТА и реагента для мягкой диссоциации, было обнаружено, что после обработки 6-луночных планшетных культур 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 10 мин при 37 ° C с мягким перемешиванием клетки поднимали с помощью мягкого растирания для создания одноклеточной суспензии. Особенно для проточного цитометрического анализа клеток ЦНС очень важно быть осторожным во время подготовки клеток, свести к минимуму этапы промывки и проявлять большую осторожность, чтобы клетки постоянно находились при температуре 4 ° C или на льду.
Чтобы оценить жизнеспособность и типы клеток в этой одноклеточной суспензии, клетки окрашивали красителем жизнеспособности и флуоресцентно меченными антителами против CD45, CD11b, O4, ACSA-2 и CD24, чтобы можно было визуализировать каждую отдельную клеточную популяцию в культурах8 (рис. 5). С помощью этого метода было получено около 70% жизнеспособности клеток, в среднем примерно 2 x 10 6 жизнеспособных одиночных клеток на 6-луночную пластину (рис. 5C). В соответствии с результатами микроскопии (рис. 2N), было обнаружено большое количество микроглии, нейронов и астроцитов, в то время как олигодендроциты были наименее многочисленными.
Рисунок 1: Схематический обзор описанного способа получения смешанных нейрональных и глиальных культур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Культуры ЦНС E17, окрашенные для иммунофлуоресцентной визуализации клеточных маркеров с течением времени. Клетки фиксировали 4% PFA перед пермеабилизацией и окрашиванием для визуализации различных популяций. Репрезентативные изображения (A, D, G, J, M) маркеров развития NG2 (клетки-предшественники олигодендроцитов) и нестина (нейрональные и глиальные клетки-предшественники), (B, E, H, K, N) нейронных маркеров SMI31 (аксоны), MBP (миелин) и NeuN (тело нейронной клетки) и (C, F, I, L, O) глиальные маркеры CNP (олигодендроциты), GFAP (астроциты) и Iba1 (микроглия). Масштабные линейки = 50 мкм. (P) Количество DAPI на мм2, n = 3, каждое n из технических троек по 10 изображений в тройке. (Q) Количество клеток в процентах от DAPI+ клеток (микроглии, олигодендроцитов и нейронов) и процентах поля зрения (астроциты), n = 3, каждое n из технических троек по 10 изображений в тройке. Полосы погрешностей - это стандартная погрешность ±среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Заражение культур ЦНС E17 вирусом леса Семлики (SFV) с течением времени. Репрезентативные изображения неинфицированных контрольных культур (A, C, E, G) и культур, инфицированных 0,05 MOI SFV (B, D, F, H). Клетки инфицировали в течение 0-48 ч и окрашивали CNP (маркер олигодендроцитов) и NeuN (маркер нейронов) (A-D) или GFAP (маркер астроцитов) и Iba1 (маркер микроглии) (E-H). Белые стрелки указывают на зараженную клетку. Этот штамм SFV экспрессирует зеленый флуоресцентный белок zsGreen, чтобы обеспечить отслеживание вирусной инфекции. Масштабные линейки = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Экспрессия мРНК CCL5 и белка культур ЦНС E17 после лечения ИФН-β. Клетки обрабатывали в 6-луночном планшетном формате (мРНК) или 96-луночном планшетном формате (белок) в течение 24 ч с диапазоном доз ИФН-β. (A) Экспрессия мРНК Ccl5 после обработки 0-100 нг / мл ИФН-β, биологический n = 2, каждый из которых взят из технических трипликатов. (B) Концентрация CCL5 в надосадочной жидкости после обработки 0-100 нг/мл ИФНβ, биологическая n = 1, взятая из технических трипликатов. (C) Активация клеточной мРНК Ccl5 по сравнению с концентрацией белка CCL5 в надосадочной жидкости с логарифмической линией тренда. Полосы ошибок находятся ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Стратегия стробирования проточной цитометрии для создания одноклеточных популяций из культур ЦНС E17. Клетки диссоциировали с использованием 0,05% трипсина-ЭДТА, окрашивали соответствующими антителами и сортировали по отдельным клеточным популяциям. (А-С) Стратегия стробирования для сортировки живых одиночных ячеек. (D) Стратегия выбора микроглии (CD45+ CD11b+). (E) Стратегия отбора олигодендроцитов (CD45-CD11b-O4+). (F) Стратегия сортировки астроцитов (CD45-CD11b-O4-ACSA-2+, CD24+) и нейронов (CD45-CD11b-O4-ACSA-2-CD24+). (G) Отдельные клеточные популяции, наложенные друг на друга, показывая дискретные популяции. (H) Отдельные типы ячеек в процентах от общего числа отсортированных ячеек, n = 4. Полосы погрешностей находятся ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Обязательный формат | BA-PLL/скважина | Вода для умывания | Объемные ячейки в гальванических средах (PM) для пластинчатого покрытия | Пополнение СМИ | Удалять/добавлять при подкормке культур (3 раза в неделю) |
| Формат 6 лунок (9.6cm2) | 1000 мкл | 1000 мкл | 1000 мкл | -400 мкл | -500 мкл носителя |
| +600 мкл DM+ | +600 мкл ДМ+/- | ||||
| Формат 96 лунок (0,32см2) | 100 мкл | 100 мкл | 50 мкл | +60 мкл DM+ | -50 мкл Носитель |
| +60 мкл DM+/- | |||||
| Покровное стекло в формате посуды | 20 мл на 200 покровных стекол | 20 мл | 100 мкл на покровное стекло | +600 мкл DM+ | -500 мкл носителя |
| +300 мкл ПМ | +600 мкл ДМ+/- |
Таблица 1: Объемы, необходимые для приготовления покрытых культуральных культур тканей пластиками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ЦНС представляет собой сложную сеть, которая простирается от головного мозга до спинного мозга и состоит из многих типов клеток, преимущественно нейронов, олигодендроцитов, астроцитов и микроглии1. Поскольку каждая клетка играет важную роль в поддержании гомеостаза и выработке соответствующих ответов на вызовы в ЦНС 9,10,11, культуральная система, содержащая все эти типы клеток, является полезным и универсальным инструментом для исследования того, как мозг может реагировать на стимул. Возможность изучать эти клетки и их взаимодействия в контексте in vitro означает, что для легкого исследования различных экспериментальных вопросов можно использовать большое разнообразие методов. Мы изложили быстрый и эффективный метод получения и культивирования основных типов клеток ЦНС из пренатального мозга, который может имитировать отдельные клеточные популяции в мозге взрослой мыши12.
Ранее установленные протоколы генерации культур ЦНС используют E13.5 спинного мозга 4,5. В дополнение к подходящей модели для спинного мозга, очень важно иметь модель, которая повторяет мозг. Таким образом, мозг этих мышей E13.5 первоначально использовался для генерации культур ЦНС, описанных здесь, с использованием того же протокола. Однако после DIV14 клетки начали образовывать большие агрегаты с плотно упакованными телами нейронов. Хотя астроциты присутствовали, неясно, были ли они распределены равномерно. Неясно, будут ли клетки в центре этих клеточных тел получать достаточное количество питательных веществ и кислорода из питательной среды, как клетки снаружи. Испытывая недостаток кислорода и питательных веществ, нейроны могут проходить апоптоз и высвобождать сигналы стресса в глиальные клетки13, что может привести к провоспалительному фенотипу14. Считалось, что нейрогенез является вероятной причиной этих плотно упакованных агрегатов, и эта фаза стихает к E1715. Когда использовались мозги эмбрионов мышей E17, клетки все еще образовывали сети, но не группировались в большие агрегаты, наблюдаемые в E13.5, и поэтому считались более подходящим возрастом для создания культур мозга.
Современный метод также приводит к большему количеству клеток, полученных за одну беременность (в среднем 1 x 10 7 клеток / мозг по сравнению с 3-4 x 106 клетками / спинной мозг)7. Для средней беременной мыши с 8-10 эмбрионами это коррелирует с 54 различными экспериментальными условиями в формате 6-луночной пластины или 150 экспериментальными условиями для микроскопии (по сравнению с 19 и 64 соответственно из спинного мозга). Таким образом, эти культуры ЦНС являются отличным инструментом для уменьшения необходимого количества мышей16. В частности, 96-луночный формат может быть легко использован для высокопроизводительных анализов, таких как возможность скрининга кандидатов на лекарства перед тестированием на животных, что значительно сокращает количество животных, необходимых для таких исследований. Мы надеемся, что это улучшит низкий уровень успеха тестирования лекарств ЦНС на животных и улучшит перевод в клинические испытания на людях17,18.
Культуры достигают пика зрелости к DIV21. Количество клеток увеличивается до этого момента времени, после чего клетки начинают дегенерировать с уменьшением количества клеток каждого типа. Это было измерено как путем просмотра количественного количества клеток (рис. 2N), так и количества пикнотических ядер (плотных пятен DAPI) (рис. 2M). В то время как маркеры развития нестин и NG2 все еще экспрессируются на DIV14 (рис. 2G) и DIV21 (рис. 2J), это связано с тем, что некоторые астроциты проходят через астроглиоз, который активирует нестин19, в то время как некоторые олигодендроциты не полностью зрелы и, следовательно, все еще экспрессируют некоторое количество NG2 20. Основываясь на проверке микроскопии, только небольшая часть клеток по-прежнему экспрессирует маркеры развития по сравнению с полностью зрелыми клетками DIV21 (рис. 2I, L); Поэтому культуры к этому времени в значительной степени созревают. Следует отметить, что in vivo плотность микроглии сильно варьируется в ЦНС мыши. Уровень микроглии, определяемый экспрессией Iba1 с помощью микроскопии, находится на верхнем уровне этой плотности в наших культурах12. Высокий процент микроглии, которые выживают после процедуры проточной цитометрии, вероятно, связан с тем, что микроглия более устойчива, чем другие клетки ЦНС, которые, как правило, имеют деликатные расширения и, следовательно, с большей вероятностью будут повреждены во время подготовки к проточной цитометрии.
После вскрытия требуется всего 3 недели, пока клетки не будут готовы к экспериментам, что короче, чем у большинства человеческих методов in vitro, таких как органоиды или модели индуцированных плюрипотентных стволовых клеток21. До тех пор, пока исследования in vivo необходимы для обеспечения безопасности новых терапевтических средств, использование методов культивирования клеток in vitro, таких как наш, поможет эффективно протестировать токсичность и эффективность перед тестированием на животных, снижая потребность в животных и улучшая перевод исследований из in vitro в in vivo. Будем надеяться, что это в конечном итоге приведет к более эффективному переводу на клинические испытания на людях. В конечном счете, эти культуры были созданы, чтобы позволить изучать ЦНС. В то время как системы in vitro не могут полностью выразить сложность ЦНС, первичные клеточные культуры более точно представляют свойства ЦНС in vivo 22,23. Подходы in vitro могут позволить использовать более редуктивный подход к исследованию ЦНС в отсутствие инфильтрирующих иммунных клеток24 и целостности гематоэнцефалического барьера25. Устранение этого уровня сложности может облегчить разгадку механизмов. Таким образом, нынешняя система культивирования является полезным инструментом для ответа на исследовательские вопросы, которые дополняют исследования in vivo на животных.
Способность собирать, изолировать и культивировать клетки ЦНС уже значительно продвинула наше понимание врожденной ЦНС16. В этой статье демонстрируется вскрытие мозга мыши E17 и результирующее растирание и культивирование клеток для создания системы клеточных культур, содержащей все основные типы клеток ЦНС. На этих культурах было использовано несколько молекулярных методов, демонстрирующих эффективность этих культур для исследования ЦНС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Эдгара и Линингтона, в частности профессора Криса Линингтона, доктора Диану Арсени и доктора Катю Мюклиш, за их советы, полезные комментарии и помощь в кормлении культур, пока мы создавали эти культуры. Особая благодарность д-ру Мюклишу (Dr. Muecklisch) за то, что он предоставил отправные точки для конвейеров Cell Profiler. Работа выполнена при поддержке Общества рассеянного склероза (грант 122) и Фонда Юрия и Лорны Чернайовских при МП; Университет Глазго финансирует JC и MP; и Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) и Совет по медицинским исследованиям (MRV0109721) в GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
