Summary
Ce protocole présente une façon unique de générer des cultures cellulaires du système nerveux central à partir de cerveaux de souris embryonnaires du jour 17 pour la recherche en neuro(immuno)logie. Ce modèle peut être analysé à l’aide de diverses techniques expérimentales, notamment la RT-qPCR, la microscopie, l’ELISA et la cytométrie en flux.
Abstract
Les modèles du système nerveux central (SNC) doivent récapituler le réseau complexe de cellules interconnectées trouvé in vivo. Le SNC se compose principalement de neurones, d’astrocytes, d’oligodendrocytes et de microglies. En raison des efforts croissants pour remplacer et réduire l’utilisation animale, une variété de systèmes de culture cellulaire in vitro ont été développés pour explorer les propriétés cellulaires innées, ce qui permet le développement de thérapies pour les infections et les pathologies du SNC. Alors que certaines questions de recherche peuvent être abordées par des systèmes de culture cellulaire basés sur l’homme, tels que les cellules souches pluripotentes (induites), travailler avec des cellules humaines a ses propres limites en ce qui concerne la disponibilité, les coûts et l’éthique. Ici, nous décrivons un protocole unique pour isoler et cultiver des cellules à partir de cerveaux de souris embryonnaires. Les cultures de cellules neurales mixtes qui en résultent imitent plusieurs populations cellulaires et interactions trouvées dans le cerveau in vivo. Par rapport aux méthodes équivalentes actuelles, ce protocole imite plus étroitement les caractéristiques du cerveau et recueille également plus de cellules, permettant ainsi d’étudier plus de conditions expérimentales à partir d’une souris gravide. De plus, le protocole est relativement facile et hautement reproductible. Ces cultures ont été optimisées pour une utilisation à différentes échelles, y compris des cribles à haut débit à 96 puits, des analyses de microscopie à 24 puits et des cultures à 6 puits pour la cytométrie en flux et l’analyse de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR). Cette méthode de culture est un outil puissant pour étudier l’infection et l’immunité dans le contexte d’une partie de la complexité du SNC avec la commodité des méthodes in vitro .
Introduction
Il est essentiel d’améliorer notre compréhension du système nerveux central (SNC) pour améliorer les options thérapeutiques pour de nombreuses maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives. Le SNC, un réseau complexe de cellules interconnectées dans le cerveau, la moelle épinière et les nerfs optiques, comprend des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et leurs cellules immunitaires innées, la microglie1. Une approche in vitro peut souvent réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour effectuer des recherches significatives; Cependant, la nature complexe du SNC rend impossible la récapitulation de la situation in vivo à l’aide de lignées cellulaires. Les cultures de cellules neurales mixtes constituent un outil de recherche extrêmement précieux pour étudier les questions de neuro(immuno)logie dans un modèle pertinent, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R) 2,3.
Thomson et al. ont décrit une méthode de culture cellulaire utilisant des cellules prénatales de la moelle épinière qui se différencient en tous les principaux types de cellules du SNCsusmentionnés 4. Ce système a également la formation de synapses, les axones myélinisés et les nœuds de Ranvier. La principale limitation de cette méthode de culture est que, étant la moelle épinière, elle ne modélise pas utilement le cerveau, et les rendements cellulaires du jour embryonnaire 13 (E13) de la moelle épinière se contractent. Ainsi, cela limite le nombre de conditions expérimentales qui peuvent être étudiées. Par conséquent, cette étude visait à développer un nouveau système de culture cellulaire qui récapitule les caractéristiques du cerveau avec un rendement cellulaire accru pour réduire les besoins des animaux.
En utilisant Thomson et al. comme point de départ, nous avons développé un modèle de culture cellulaire dérivé uniquement de cerveaux de souris prénatals. Ces cultures ont les mêmes populations cellulaires, l’interconnectivité et les mêmes options de traitement que les cultures de la moelle épinière, sauf qu’il y a moins de myélinisation en comparaison. Cependant, avoir un modèle in vitro du SNC avec un rendement cellulaire environ trois fois plus élevé est plus efficace, nécessitant moins de souris et moins de temps de traitement des embryons. Nous avons optimisé ce système de culture unique pour de multiples applications et échelles en aval, y compris l’utilisation de lamelles de couverture en verre pour l’analyse microscopique et de différentes tailles de plaques de puits en plastique, y compris des plaques de 96 puits pour la recherche à haut débit.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux étaient conformes aux lois et directives locales pour l’utilisation des animaux et ont été approuvées par le comité d’examen éthique local de l’Université de Glasgow. Les animaux ont été logés dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes conformément à la loi britannique de 1986 sur les procédures scientifiques sur les animaux, sous les auspices d’une licence de projet du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni. Pour cette étude, des souris adultes C57BL/6J élevées en interne ont été utilisées. L’utilisation de jeunes femmes (8-12 semaines) est recommandée en raison du taux de réussite plus élevé de la grossesse; Les mâles peuvent être réutilisés pour plusieurs cycles de reproduction. La figure 1 représente un aperçu schématique de la méthode décrite pour générer des cultures neuronales et gliales mixtes.
1. Préparation des consommables de culture tissulaire
- Préparer les assiettes et/ou les plats contenant des lamelles de microscopie à l’intérieur d’une enceinte de sécurité de classe 2. Stériliser tous les réactifs ou autoclaves pour assurer la stérilité pendant la période de culture.
- Ajouter le volume approprié de BA-PLL (13,2 μg/mL de poly-L-lysinehydrobromure [PLL] dans un tampon d’acide borique [BA] [50 mM d’acide borique, 12,5 mM de tétraborate de sodium, pH 8,5]; voir le tableau des matériaux) à chaque puits (1 000 μL/puits dans une plaque de 6 puits, 100 μL/puits dans une plaque de 96 puits; les volumes sont résumés dans le tableau 1). Pour les lames de couverture de microscopie, ajouter 20 ml de BA-PLL à une boîte de culture tissulaire de 9 cm de diamètre contenant 200 lamelles de couverture stériles et agiter pour répartir uniformément.
- Incuber à 37 °C pendant 1-2 h.
- Retirer la solution BA-PLL de chaque puits ou plat contenant des lames de couverture de microscopie et laver en ajoutant 20 ml d’eau stérile, en faisant tourbillonner les lames de couverture, puis en retirant l’eau. Répétez cette étape de lavage trois fois. Pour un plat contenant des lamelles de couverture, laissez de l’eau stérile dans la boîte de culture tissulaire lors du lavage final pour retirer facilement les lamelles de couverture.
- Retirer autant de liquide que possible avec une pipette stérile et laisser sécher pendant au moins 2 h à toute la nuit.
- Conservez les plaques revêtues à 4 °C jusqu’à 2 mois.
REMARQUE: La solution préparée d’acide borique avec poly-l-lysine (BA-PLL) peut être réutilisée jusqu’à trois fois, en ajoutant une nouvelle LPL à chaque fois. Conserver la BA-PLL à 4 °C. Les plats sont traités avec BA-PLL, car la LPL permet aux cellules de coller et de se développer. Sans ce traitement, les cellules se soulèveront après environ 1 semaine de culture et ne pourront plus se différencier.
2. Dissection de cerveaux embryonnaires E17
- Cologer une ou plusieurs souris femelles avec une souris mâle. Vérifiez quotidiennement les femelles pour un bouchon de mucus, indiquant que l’accouplement a eu lieu.
REMARQUE: Toute souris femelle « bouchée » doit être séparée du mâle pour assurer la date de début correcte de la gestation. Les souris peuvent être pesées pour confirmer la grossesse ou surveillées visuellement. - Abattre la souris gravide à E17 en utilisant des méthodes appropriées conformément aux directives et aux lois locales en matière de bien-être animal, par exemple, en augmentant la concentration de dioxyde de carbone (CO2), une surdose anesthésique mortelle ou une luxation du cou.
NOTE: La méthode choisie ne doit pas perturber les embryons. Pour cette étude, l’exposition à une concentration croissante de dioxyde de carbone gazeux suivie de la confirmation de la mort par sectionnement de l’artère fémorale a été utilisée pour éliminer les mères gravides. - Placez la souris gravide abattue sur le dos sur une planche de dissection; Bien qu’il ne soit pas nécessaire de le cerner, cela pourrait faciliter la tâche des chercheurs inexpérimentés. Pincez la ligne médiane de l’abdomen à l’aide d’une pince. À l’aide de ciseaux tranchants, ouvrez l’abdomen à travers la peau et le péritoine sur la ligne médiane allant des organes génitaux à la cage thoracique, en prenant soin de ne pas percer l’utérus.
- L’utérus de souris a deux cornes, chacune contenant généralement un à cinq embryons. Retirez l’utérus contenant les embryons de la mère et placez-le immédiatement sur de la glace.
- Coupez le sac vitellin sur le côté des placentas, en prenant soin de ne pas endommager les embryons, et retirez les embryons de leur sac vitellin.
- Décapitant immédiatement les embryons. Ajouter les têtes décapitées dans un plat avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) sans calcium (Ca 2+) et magnésium (Mg2+) (HBSS-/-) sur glace.
NOTE: Si le génotypage est nécessaire, on peut enlever la queue à ce stade pour une analyse génétique. Lorsque plusieurs génotypes sont attendus, les têtes de chaque embryon doivent être conservées séparément pour la culture. - À l’aide de pinces inclinées, placez la tête sur le côté vers la gauche.
- Percez l’œil avec un bord de la pince, en tenant fermement le menton avec l’autre.
- En commençant par la nuque, déchirez doucement la peau du cuir chevelu le long de la ligne médiane vers le bout du museau.
- En entrant par la moelle épinière, visible comme un ovale blanc, utilisez les pinces inclinées pour ouvrir le crâne le long de la ligne médiane, exposant ainsi le cerveau.
- Décollez doucement le crâne sur le côté tourné vers le haut, exposant le cerveau.
- Soulevez le cerveau hors du crâne, en éliminant le crâne une fois que le cerveau a été complètement retiré.
- À l’aide de la pince, retirez les méninges, qui se distinguent par une fine membrane avec des vaisseaux sanguins denses.
- Placer la cervelle dans un bijou (voir le tableau des matières) contenant 2 mL de HBSS-/- sur glace.
- Répétez les étapes 2.6 à 2.13 avec les cerveaux restants, en ajoutant jusqu’à quatre cerveaux par bijou.
- Ajouter 250 μL de trypsine 10x au bijou et triturer la cervelle en secouant le bijou. Incuber pendant 15 min à 37 °C.
REMARQUE: Toutes les étapes à partir de ce moment doivent être effectuées dans une houlette de culture tissulaire stérile. - Décongeler 2 mL d’inhibiteur de la trypsine (SD) du soja (Leibovitz L-15, 0,52 mg/mL d’inhibiteur de la trypsine du soja, 40 μg/mL de DNase I, 3 mg/mL d’albumine sérique bovine [BSA] fraction V; voir le tableau des matières) à partir de -20 °C en le plaçant à 37 °C.
- Ajouter 2 mL d’inhibiteur du SD à chaque bijou contenant des cerveaux (par bijou contenant jusqu’à quatre cerveaux), en secouant à nouveau le bijou pour le disperser uniformément.
REMARQUE: L’inhibiteur SD diminue l’activité de la trypsine pour éviter la digestion inutile des échantillons et préserver la viabilité cellulaire. - Sans centrifugation, retirer 2 mL du surnageant de chaque bijou et transférer dans un tube à centrifuger de 15 mL, en prenant soin de ne pas transférer d’amas cellulaires.
- Triturer les cellules restantes dans le bijou avec une aiguille de 19 G fixée à une seringue de 5 ml en aspirant la suspension deux fois. Cela créera un mélange épais semblable à du mucus.
- Répétez deux fois de plus à l’aide d’une aiguille de 21 G. S’il reste des touffes, triturez une fois de plus avec l’aiguille de 21 G.
- Transférer les cellules du bijou dans le même tube à centrifuger de 15 ml (à partir de l’étape 2.18) à l’aide d’une aiguille de 23 g.
- Centrifuger à 200 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min.
- Retirer tout le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et le transférer dans un autre tube à centrifuger de 15 mL, en prenant soin de ne pas déranger la pastille lâche au fond contenant les cellules requises.
- Centrifuger à nouveau le surnageant à 200 x g à TA pendant 5 min.
NOTE: Cette étape n’est pas essentielle, mais si l’on a besoin de nombreuses cellules ou a peu d’embryons, on pourrait effectuer cette étape pour récupérer autant de cellules que possible du surnageant. - À l’aide de 10 mL de média de placage (49 % de milieu aigle modifié de Dulbecco [DMEM], 1 % de pénicilline/streptomycine [Pen/Strep], 25 % de sérum de cheval, 25 % d’HBSS avec Ca 2+ et Mg2 + [HBSS+ /+]; voir le tableau des matières), combiner et remettre en suspension les deux pastilles ensemble pour créer une suspension cellulaire entière.
- Compter les cellules à l’aide de bleu de trypan et d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules numériques, et diluer la suspension cellulaire avec des particules à une concentration de 1,8 x 106 cellules/mL.
3. Placage des cellules
- Ajouter le volume requis de la suspension cellulaire au format requis tel qu’indiqué dans le tableau 1 : 1 000 μL par puits en format 6 puits, 50 μL par puits en format 96 puits ou 100 μL par lamelle de couverture.
- Incuber pendant 2-4 h à 37 °C avec 5%-7% CO2. Vérifiez que les cellules ont adhéré à l’aide d’un microscope inversé.
- Retirez le média et complétez avec un nouveau milieu de différenciation (DM+ : DM- incluant 10 μg/mL d’insuline. DM- : DMEM, 1 % Pen/Strep, hydrocortisone 50 nM, 10 ng/mL de biotine, 2,5 mL de supplément de milieu 100x N1; voir le tableau des matières). Les volumes sont détaillés dans le tableau 1. Appuyez sur les lamelles de couverture flottantes à l’aide d’un embout de pipette stérile.
4. Maintenir les cultures
REMARQUE: Ces cultures nécessitent une alimentation trois fois par semaine pour soutenir une croissance et une différenciation optimales. Les cultures atteindront une santé et une maturité optimales pour les expériences sur DIV (jours in vitro) 21. Les cellules peuvent être conservées en culture jusqu’à 28 jours, après quoi les cultures dégénèrent rapidement.
- Trois fois par semaine jusqu’à DIV12, remplacer une partie du surnageant par du DM+ frais en retirant 500 μL par puits en format 6 puits, 50 μL par puits en format 96 puits, ou 500 μL par antenne contenant trois lamelles de couverture, et en ajoutant 600 μL par puits en format 6 puits, 60 μL par puits en format 96 puits, ou 600 μL par antenne parabolique (tableau 1).
- Trois fois par semaine à partir de DIV13, remplacer une partie du surnageant par du DM- frais en retirant 500 μL par puits dans un format à 6 puits, 50 μL par puits dans un format 96 puits, ou 500 μL par antenne contenant trois lamelles de couverture, et en ajoutant 600 μL par puits dans un format 6 puits, 60 μL par puits dans un format 96 puits, ou 600 μL par antenne parabolique (tableau 1).
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Representative Results
Microscopie
Les cultures cultivées sur des lamelles de verre sont idéales pour être analysées par microscopie. Pour visualiser le développement des cultures, les lamelles de couverture ont été fixées dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4% à plusieurs points temporels de DIV0 (une fois les cellules attachées) à DIV28. Les cultures ont été colorées pour l’imagerie par immunofluorescence comme décrit précédemment5 en utilisant trois combinaisons de coloration différentes: NG2 (oligodendrocytes immatures) et nestine (cellules souches neuronales / progénitrices) comme marqueurs de développement, SMI31 (axones), MBP (myéline) et NeuN (corps cellulaire neuronal) comme marqueurs neuronaux, ou CNP (oligodendrocytes), GFAP (astrocytes) et Iba1 (microglie) comme marqueurs gliaux (Figure 2).
Les différents types de cellules ont été quantifiés à l’aide de pipelines CellProfiler (basés sur ′,6-diamidino-2-phénylindole-positif (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). Chaque point de données individuel a été généré à partir d’une moyenne de 10 images prises à partir de trois feuillets de couverture par point temporel. Pour la microglie, les neurones et les oligodendrocytes, le pourcentage de type cellulaire par cellule 4′,6-diamidino-2-phénylindole positive (DAPI+) a été calculé. Le champ de vision en pourcentage a été utilisé au lieu du nombre de cellules pour quantifier le nombre d’astrocytes. Cela était dû aux difficultés à différencier les cellules individuelles, car elles se chevauchaient fréquemment (Figure 2M,N). Les cultures ont atteint leur maturité maximale et leur densité cellulaire à DIV21, après quoi elles ont commencé à se dégrader (Figure 2N).
Il est important de noter que ces cultures peuvent facilement être traitées avec des médicaments, tels que des traitements potentiels, ou utilisées pour tracer des infections in vitro . Dans cet exemple, les cultures sur des lamelles de couverture ont été transférées dans une plaque de 24 puits et infectées par le virus hautement neurotrope Semliki Forest virus (SFV) (souche SFV6)6, qui exprime zsGreen dans les cellules infectées. Une multiplicité d’infection (MOI-le nombre de particules virales ajoutées par cellule) de 0,05, titrée sur les cellules de rein de bébé hamster (BHK), a été utilisée pour assurer une infection de faible intensité. Après 0-72 h post-infection (hpi), les cultures ont été fixées dans 4% PFA et colorées pour analyse par imagerie immunofluorescente. La figure 3 montre que, conformément à l’infection in vivo , le VSS infecte principalement les oligodendrocytes et les neurones6.
qRT-PCR
En plus de la microscopie, ces cultures du SNC peuvent être utilisées pour l’analyse par des méthodes moléculaires, telles que la RT-qPCR des réponses de l’ARNm au traitement. Pour étudier plus avant la réponse antivirale innée, des cultures sur plaque à 6 puits ont été traitées avec une gamme de doses de la puissante cytokine antivirale interféron bêta (IFN-β) pendant 24 heures. Les cultures ont été lysées avec du guanidium-thiocyanate / phénol, et l’ARN a été isolé, converti en ADNc et analysé par qPCR comme décrit précédemment7. En utilisant cette méthode, l’expression différentielle de nombreux gènes peut être mesurée. Ici, la régulation positive de Ccl5 a été quantifiée par rapport au gène d’entretien 18s. CCL5 est une cytokine chimiotactique (chimiokine) impliquée dans la réponse inflammatoire. Le traitement par IFN-β a entraîné une régulation positive de l’ARNm Ccl5 dans les cultures (Figure 4A).
Dosage immunoenzymatique (ELISA)
Le format de cultures à 96 puits est un excellent outil pour les criblages à haut débit des traitements. Pour déterminer si la régulation positive de l’ARNm Ccl5 entraîne l’expression de la protéine CCL5, CCL5 a été mesurée dans le surnageant des cultures par ELISA, conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Dans cet exemple, des cultures de 96 puits ont été traitées en double avec 27 doses supplémentaires d’IFN-β pour générer une courbe dose-réponse (figure 4B). En ligne avec l’expression accrue de l’ARNm (Figure 4A), il y avait une augmentation de CCL5 libéré dans le surnageant. Comme prévu, la figure 4C démontre une corrélation claire entre l’ARNm et l’expression des protéines.
Cytométrie de flux
La cytométrie de flux est un outil puissant pour étudier simultanément l’expression de nombreux marqueurs intra et/ou extracellulaires. Cependant, l’analyse de cultures complexes et hautement interactives par cytométrie en flux peut être difficile en raison des dommages cellulaires et de la mort lors du passage de cellules de la culture à une suspension unicellulaire pour le traitement et l’analyse. En comparant une variété de protocoles utilisant 0,05% -0,5% d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 1x-10x trypsine sans EDTA et un réactif de dissociation douce, il a été constaté qu’après avoir traité les cultures sur plaque à 6 puits avec 0,05% de trypsine-EDTA pendant 10 minutes à 37 ° C avec une agitation douce, les cellules ont été soulevées par trituration douce pour créer une suspension unicellulaire. En particulier pour l’analyse cytométrique en flux des cellules du SNC, il est essentiel d’être doux pendant la préparation des cellules, de minimiser les étapes de lavage et de prendre grand soin de maintenir les cellules à 4 ° C ou sur la glace en tout temps.
Pour évaluer la viabilité et les types cellulaires de cette suspension unicellulaire, les cellules ont été colorées avec un colorant de viabilité et des anticorps marqués par fluorescence contre CD45, CD11b, O4, ACSA-2 et CD24 pour permettre la visualisation de chaque population cellulaire individuelle dans les cultures8 (Figure 5). Environ 70% de viabilité cellulaire a été obtenue par cette méthode, avec une moyenne d’environ 2 x 10 6 cellules simples viables par plaque de6 puits (Figure 5C). Conformément aux résultats de la microscopie (Figure 2N), il y avait un grand nombre de microglies, de neurones et d’astrocytes, tandis que les oligodendrocytes étaient les moins abondants.
Figure 1: Vue d’ensemble schématique de la méthode décrite pour générer des cultures neuronales et gliales mixtes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Cultures E17 du SNC colorées pour les marqueurs cellulaires d’imagerie par immunofluorescence au fil du temps. Les cellules ont été fixées avec 4% de PFA avant d’être perméabilisées et colorées pour visualiser différentes populations. Images représentatives des marqueurs de développement NG2 (cellules précurseurs des oligodendrocytes) et de la nestine (cellules neuronales et précurseurs gliales), des marqueurs neuronaux SMI31 (axones), MBP (myéline) et NeuN (corps cellulaire neuronal) et (C, F, I, L, O) marqueurs gliaux CNP (oligodendrocytes), GFAP (astrocytes) et Iba1 (microglie). Barres d’échelle = 50 μm. (P) Nombre de DAPI par mm2, n = 3, chaque n provenant de triplicates techniques de 10 images par triplicate. (Q) Nombre de cellules en pourcentage de cellules DAPI+ (microglies, oligodendrocytes et neurones) et en pourcentage du champ de vision (astrocytes), n = 3, chaque n provenant de triplicates techniques de 10 images par triplicate. Les barres d’erreur sont ± erreur type de la moyenne (SEM). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Infection par le virus de la forêt Semliki (VSS) des cultures E17 du SNC au fil du temps. Images représentatives de cultures témoins non infectées (A, C, E, G) et de cultures infectées par 0,05 MOI SFV (B, D, F, H). Les cellules ont été infectées pendant 0-48 h et colorées avec CNP (marqueur oligodendrocytes) et NeuN (marqueur neuronal) (A-D) ou GFAP (marqueur astrocytaire) et Iba1 (marqueur microglial) (E-H). Les flèches blanches indiquent une cellule infectée. Cette souche de SFV exprime la protéine fluorescente verte zsGreen pour permettre le traçage de l’infection virale. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : ARNm CCL5 et expression protéique de cultures E17 du SNC après traitement par IFN-β. Les cellules ont été traitées sous forme de plaque à 6 puits (ARNm) ou de plaque à 96 puits (protéine) pendant 24 heures avec une gamme de doses d’IFN-β. (A) Expression de l’ARNm Ccl5 après traitement avec 0-100 ng/mL d’IFN-β, n biologique = 2, chacun provenant de triplicates techniques. (B) Concentration de CCL5 dans le surnageant après un traitement IFNβ de 0 à 100 ng/mL, biologique n = 1, tiré de triplicates techniques. (C) Régulation positive de l’ARNm cellulaire Ccl5 par rapport à la concentration de protéine CCL5 dans le surnageant avec une courbe de tendance logarithmique. Les barres d’erreur sont ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Stratégie de contrôle de cytométrie en flux pour générer des populations unicellulaires à partir de cultures E17 du SNC. Les cellules ont été dissociées à l’aide de trypsine-EDTA à 0,05%, colorées avec des anticorps appropriés et triées en populations cellulaires individuelles. (A-C) Stratégie de contrôle pour trier les cellules uniques vivantes. (D) Stratégie de sélection pour la microglie (CD45+ CD11b+). (E) Stratégie de sélection des oligodendrocytes (CD45- CD11b- O4+). (F) Stratégie de tri des astrocytes (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+ CD24+) et des neurones (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) Des populations cellulaires individuelles superposées les unes aux autres, montrant des populations discrètes. (H) Types de cellules individuelles en pourcentage du total des cellules triées, n = 4. Les barres d’erreur sont ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Format requis | BA-PLL/puits | De l’eau pour le lavage | Cellules volumiques dans les milieux de placage (PM) à plaquer | Recharger les médias | Retirer/ajouter lors de l’alimentation des cultures (3x/semaine) |
| Format 6 puits (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL de média |
| +600 μL DM+ | +600 μL MS+/- | ||||
| Format 96 puits (0,32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL de DM+ | -50 μL de média |
| +60 μL DM+/- | |||||
| Bordereau de couverture en format plat | 20 mL par 200 lamelles | 20 mL | 100 μL par lamelle de couverture | +600 μL DM+ | -500 μL de média |
| +300 μL PM | +600 μL MS+/- |
Tableau 1 : Volumes requis pour la préparation des plastiques enduits de culture tissulaire.
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Discussion
Le SNC est un réseau complexe qui s’étend du cerveau à la moelle épinière et se compose de nombreux types de cellules, principalement des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et des microglies1. Comme chaque cellule a un rôle important dans le maintien de l’homéostasie et la génération de réponses appropriées aux défis du SNC 9,10,11, un système de culture qui contient tous ces types de cellules est un outil utile et polyvalent pour étudier comment le cerveau pourrait réagir à un stimulus. La capacité d’étudier ces cellules, et leurs interactions, dans un contexte in vitro signifie qu’une grande variété de techniques peuvent être utilisées pour étudier facilement diverses questions expérimentales. Nous avons décrit une méthode rapide et efficace pour obtenir et cultiver les principaux types de cellules du SNC à partir du cerveau prénatal, qui peut imiter des populations cellulaires individuelles dans le cerveau de souris adulte12.
Les protocoles précédemment établis pour générer des cultures du SNC utilisent la moelle épinière E13.5 4,5. En plus d’avoir un modèle adapté pour la moelle épinière, il est très pertinent d’avoir un modèle qui récapitule le cerveau. Par conséquent, les cerveaux de ces souris E13.5 ont été utilisés à l’origine pour générer les cultures du SNC décrites ici en utilisant le même protocole. Cependant, après DIV14, les cellules ont commencé à former de grands agrégats avec des corps cellulaires neuronaux densément emballés. Bien que les astrocytes étaient présents, il n’est pas clair s’ils étaient répartis uniformément. Il n’est pas clair si les cellules au centre de ces corps cellulaires recevraient suffisamment de nutriments et d’oxygène du milieu de culture comme le feraient les cellules à l’extérieur. Lorsqu’ils souffrent de privation d’oxygène et de nutriments, les neurones sont susceptibles de passer par l’apoptose et de libérer des signaux de stress aux cellules gliales13, ce qui pourrait conduire à un phénotype pro-inflammatoire14. On pensait que la neurogenèse était une cause probable de ces agrégats densément emballés, et cette phase s’atténue par E1715. Lorsque des cerveaux d’embryons de souris E17 ont été utilisés, les cellules formaient toujours des réseaux, mais ne se regroupaient pas dans les grands agrégats observés dans E13.5, et étaient donc considérés comme un âge plus approprié pour les cultures cérébrales à générer.
La technique actuelle permet également d’obtenir un plus grand nombre de cellules obtenues à partir d’une grossesse (en moyenne 1 x 10 7 cellules/cerveau contre 3-4 x 106 cellules/moelle épinière)7. Pour une souris enceinte moyenne avec 8 à 10 embryons, cela correspond à jusqu’à 54 conditions expérimentales différentes dans le format de plaque à 6 puits, ou 150 conditions expérimentales pour la microscopie (contre 19 et 64, respectivement, de la moelle épinière). En tant que telles, ces cultures du SNC sont un excellent outil pour réduire le nombre requis de souris16. En particulier, le format à 96 puits peut être facilement utilisé pour les essais à haut débit, tels que la sélection de candidats médicaments avant les tests sur les animaux, réduisant considérablement le nombre d’animaux requis pour de telles études. Nous espérons que cela améliorera le faible taux de réussite des tests de médicaments contre le SNC chez les animaux et améliorera la traduction en essais cliniques chez l’homme17,18.
Les cultures atteignent leur maturité maximale par DIV21. Le nombre de cellules augmente jusqu’à ce point temporel, après quoi les cellules commencent à dégénérer avec un nombre décroissant de chaque type de cellule. Cela a été mesuré à la fois en examinant le nombre de cellules quantifiées (Figure 2N) ainsi que le nombre de noyaux pyknotiques (colorations DAPI denses) (Figure 2M). Bien que les marqueurs de développement nestine et NG2 soient toujours exprimés sur DIV14 (Figure 2G) et DIV21 (Figure 2J), cela est dû au fait que certains astrocytes passent par l’astrogliose, qui régule à la hausse la nidoxine19, tandis que certains oligodendrocytes ne sont pas complètement matures et expriment donc encore une partie NG220. D’après la validation par microscopie, seule une petite partie des cellules expriment encore des marqueurs de développement par rapport aux cellules complètement matures par DIV21 (Figure 2I,L); Par conséquent, les cultures sont largement matures à ce moment-là. Il convient de noter qu’in vivo, la densité de la microglie est très variable à travers le SNC murin. Le niveau de microglie, tel que défini par l’expression Iba1 à l’aide de la microscopie, se situe à l’extrémité supérieure de cette densité dans nos cultures12. Le pourcentage élevé de microglies qui survivent à la procédure de cytométrie en flux est probablement dû au fait que la microglie est plus robuste que les autres cellules du SNC, qui ont généralement des extensions délicates, et sont donc plus susceptibles d’être endommagées lors de la préparation de la cytométrie en flux.
Il ne faut que 3 semaines après la dissection jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour l’expérimentation, ce qui est plus court que la plupart des méthodes in vitro basées sur l’homme, telles que les organoïdes ou les modèles induits dérivés de cellules souches pluripotentes21. Tant que la recherche in vivo est nécessaire pour assurer l’innocuité de nouveaux traitements, l’utilisation de méthodes de culture cellulaire in vitro comme la nôtre aidera à tester efficacement la toxicité et l’efficacité avant les essais sur les animaux, réduisant ainsi les besoins en animaux et améliorant l’application de la recherche in vitro à in vivo. Espérons que cela conduira éventuellement à une application plus efficace aux essais cliniques sur l’homme. En fin de compte, ces cultures ont été créées pour permettre l’étude du SNC. Alors que les systèmes in vitro ne peuvent pas exprimer pleinement la complexité du SNC, les cultures primaires dérivées de cellules représentent plus précisément les propriétés in vivo du SNC22,23. Les approches in vitro peuvent permettre une approche plus réductrice pour étudier le SNC en l’absence de cellules immunitaires infiltrantes24 et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique25. La suppression de cette couche de complexité peut faciliter le démêlage des mécanismes. En tant que tel, le système de culture actuel est un outil utile pour répondre aux questions de recherche qui complètent la recherche animale in vivo.
La capacité de prélever, d’isoler et de cultiver des cellules du SNC a déjà grandement fait progresser notre compréhension du SNCinné 16. Cet article démontre la dissection du cerveau de souris E17 et la trituration et la culture résultantes des cellules pour générer un système de culture cellulaire contenant tous les principaux types de cellules du SNC. De multiples techniques moléculaires ont été utilisées sur ces cultures, mettant en évidence l’efficacité de ces cultures pour étudier le SNC.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres des laboratoires Edgar et Linington, en particulier le professeur Chris Linington, le Dr Diana Arseni et le Dr Katja Muecklisch, pour leurs conseils, leurs commentaires utiles et leur aide pour nourrir les cultures pendant que nous mettons en place ces cultures. Nous remercions tout particulièrement le Dr Muecklisch d’avoir fourni les points de départ des pipelines Cell Profiler. Ce travail a été soutenu par la Société de la SP (subvention 122) et la Fondation Yuri et Lorna Chernajovsky à MP; Financement de l’Université de Glasgow à JC et MP; et Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) et Medical Research Council (MRV0109721) à GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
