Summary
Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.
Abstract
Modellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) moeten het complexe netwerk van onderling verbonden cellen in vivo samenvatten.Het CZS bestaat voornamelijk uit neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en microglia. Vanwege de toenemende inspanningen om het gebruik van dieren te vervangen en te verminderen, zijn er verschillende in vitro celkweeksystemen ontwikkeld om aangeboren celeigenschappen te onderzoeken, die de ontwikkeling van therapieën voor CZS-infecties en pathologieën mogelijk maken. Hoewel bepaalde onderzoeksvragen kunnen worden aangepakt door op mensen gebaseerde celkweeksystemen, zoals (geïnduceerde) pluripotente stamcellen, heeft het werken met menselijke cellen zijn eigen beperkingen met betrekking tot beschikbaarheid, kosten en ethiek. Hier beschrijven we een uniek protocol voor het isoleren en kweken van cellen uit embryonale muizenhersenen. De resulterende gemengde neurale celculturen bootsen verschillende celpopulaties en interacties na die in vivo in de hersenen worden aangetroffen. In vergelijking met de huidige equivalente methoden bootst dit protocol de kenmerken van de hersenen beter na en verzamelt het ook meer cellen, waardoor meer experimentele omstandigheden van één zwangere muis kunnen worden onderzocht. Verder is het protocol relatief eenvoudig en zeer reproduceerbaar. Deze culturen zijn geoptimaliseerd voor gebruik op verschillende schalen, waaronder 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analyse en 6-well culturen voor flow cytometrie en reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analyse. Deze kweekmethode is een krachtig hulpmiddel om infectie en immuniteit te onderzoeken binnen de context van een deel van de complexiteit van het CZS met het gemak van in vitro methoden.
Introduction
Het verbeteren van ons begrip van het centrale zenuwstelsel (CZS) is van cruciaal belang om de therapeutische opties voor veel neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten te verbeteren. Het CZS, een complex netwerk van onderling verbonden cellen in de hersenen, het ruggenmerg en de oogzenuwen, bestaat uit neuronen, oligodendrocyten, astrocyten en hun aangeboren immuuncellen, de microglia1. Een in vitro aanpak kan vaak het aantal muizen dat nodig is om zinvol onderzoek uit te voeren drastisch verminderen; de complexe aard van het CZS maakt het echter onmogelijk om de in vivo situatie samen te vatten met behulp van cellijnen. Gemengde neurale celculturen bieden een uiterst waardevol onderzoeksinstrument om neuro(immuno)logie vragen te onderzoeken in een relevant model, in lijn met de Replacement, Reduction and Refinement (3Rs) principes 2,3.
Thomson et al. beschreven een celkweekmethode met behulp van prenatale ruggenmergcellen die differentiëren in alle bovengenoemde hoofdtypen van CZS-cellen4. Dit systeem heeft ook synapsvorming, gemyeliniseerde axonen en knooppunten van Ranvier. De belangrijkste beperking van deze kweekmethode is dat het, omdat het ruggenmerg is, de hersenen niet nuttig modelleert en dat de celopbrengsten van embryonale dag 13 (E13) ruggenmerg vernauwen. Dit beperkt dus het aantal experimentele omstandigheden dat kan worden onderzocht. Daarom was deze studie gericht op het ontwikkelen van een nieuw celkweeksysteem dat de kenmerken van de hersenen samenvat met een verhoogde celopbrengst om de vereisten voor dieren te verminderen.
Met Thomson et al. als uitgangspunt ontwikkelden we een celkweekmodel dat puur was afgeleid van prenatale muizenhersenen. Deze culturen hebben dezelfde celpopulaties, interconnectiviteit en behandelingsopties als de ruggenmergculturen, behalve dat er in vergelijking minder myelinisatie is. Het hebben van een CZS in vitro model met een ongeveer drie keer hogere celopbrengst is echter efficiënter, waardoor minder muizen en minder tijd nodig zijn om embryo's te verwerken. We hebben dit unieke kweeksysteem geoptimaliseerd voor meerdere downstream-toepassingen en weegschalen, waaronder het gebruik van glazen afdekplaten voor microscopie-analyse en verschillende maten plastic putplaten, waaronder 96-putplaten voor onderzoek met hoge doorvoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven voldeden aan de lokale wetten en richtlijnen voor diergebruik en werden goedgekeurd door de lokale ethische beoordelingscommissie van de Universiteit van Glasgow. Dieren werden gehuisvest in specifieke pathogeenvrije omstandigheden in overeenstemming met de UK Animals Scientific Procedures Act 1986, onder auspiciën van een UK Home Office Project License. Voor deze studie werden in-house gefokte volwassen C57BL/6J muizen gebruikt. Het gebruik van jonge vrouwen (8-12 weken) wordt aanbevolen vanwege het hogere slagingspercentage van de zwangerschap; Mannetjes kunnen worden hergebruikt voor meerdere fokrondes. Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de beschreven methode om gemengde neuronale en gliale culturen te genereren.
1. Bereiding van de verbruiksartikelen voor weefselkweek
- Bereid de borden en/of schalen met microscopie coverslips in een klasse 2 veiligheidskast. Steriliseer alle reagentia of autoclaaf om steriliteit tijdens de kweekperiode te garanderen.
- Voeg het juiste volume BA-PLL (13,2 μg/ml poly-L-lysinehydrobromide [PLL] in boorzuurbuffer [BA] [50 mM boorzuur, 12,5 mM natriumtetraboraat, pH 8,5]; zie materiaaltabel) toe aan elke put (1.000 μl/put in een plaat met 6 putten, 100 μl/put in een plaat met 96 putten; de volumes zijn samengevat in tabel 1). Voeg voor microscopie coverslips 20 ml BA-PLL toe aan een weefselkweekschaal met een diameter van 9 cm met 200 steriele coverslips en draai om gelijkmatig te verdelen.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 1-2 uur.
- Verwijder de BA-PLL-oplossing uit elke put of schaal met microscopie-afdekzeilen en was door 20 ml steriel water toe te voegen, de dekzeilen te draaien en vervolgens het water te verwijderen. Herhaal deze wasstap drie keer. Voor een schaal met coverslips, laat u steriel water in de weefselkweekschaal op de laatste wasbeurt om de coverslips gemakkelijk te verwijderen.
- Verwijder zoveel mogelijk vloeistof met een steriele pipet en laat minstens 2 uur tot een nacht drogen.
- Bewaar de gecoate platen bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden.
OPMERKING: Het bereide boorzuur met poly-l-lysine (BA-PLL) oplossing kan tot drie keer worden hergebruikt, waarbij elke keer nieuwe PLL wordt toegevoegd. Bewaar de BA-PLL bij 4 °C. Gerechten worden behandeld met BA-PLL, omdat de PLL de cellen laat plakken en groeien. Zonder deze behandeling zullen de cellen na ongeveer 1 week kweek optillen en niet meer kunnen differentiëren.
2. Dissectie van E17 embryonale hersenen
- Co-house een of meerdere vrouwelijke muizen met een mannelijke muis. Controleer de vrouwtjes dagelijks op een slijmprop, wat aangeeft dat er paring heeft plaatsgevonden.
OPMERKING: Alle "aangesloten" vrouwelijke muizen moeten van het mannetje worden gescheiden om de juiste startdatum van de dracht te garanderen. Muizen kunnen worden gewogen om de zwangerschap te bevestigen of visueel worden gecontroleerd. - Ruim de zwangere muis op E17 met behulp van geschikte methoden in overeenstemming met de lokale richtlijnen en wetten voor dierenwelzijn, bijvoorbeeld door de kooldioxideconcentratie (CO2) te verhogen, een dodelijke overdosis anestheticum of dislocatie van de nek.
OPMERKING: De gekozen methode mag de embryo's niet verstoren. Voor deze studie werd blootstelling aan een stijgende concentratie koolstofdioxidegas gevolgd door bevestiging van de dood door het doorsnijden van de dijbeenslagader gebruikt om zwangere moederdieren te ruimen. - Plaats de geruimde, zwangere muis op zijn rug op een snijbord; Hoewel het vastpinnen niet nodig is, kan het het voor onervaren onderzoekers gemakkelijker maken. Knijp met een tang in de middellijn van de buik. Knip met een scherpe schaar de buik open door de huid en het peritoneum over de middellijn van de genitaliën naar de ribbenkast, waarbij u voorzichtig bent om de baarmoeder niet te doorboren.
- De baarmoeder van de muis heeft twee hoorns, die elk meestal één tot vijf embryo's bevatten. Verwijder de baarmoeder met de embryo's van de moeder en plaats deze onmiddellijk op ijs.
- Snijd door de dooierzak aan de zijkant van de placenta's, zorg ervoor dat u de embryo's niet beschadigt en verwijder de embryo's uit hun dooierzak.
- Onthoofd de embryo's onmiddellijk. Voeg de onthoofde koppen toe aan een schaal met Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium (Ca 2+) en magnesium (Mg2+) (HBSS-/-) op ijs.
OPMERKING: Als genotypering vereist is, kan men de staart in dit stadium verwijderen voor genetische analyse. Wanneer meerdere genotypen worden verwacht, moeten de koppen van elk embryo apart worden gehouden voor het kweken. - Plaats met een schuine tang het hoofd op zijn kant naar links.
- Doorboor het oog met de ene rand van de tang en houd de kin stevig vast met de andere.
- Begin bij de nek en scheur de huid van de hoofdhuid voorzichtig langs de middellijn naar de punt van de snuit.
- Als je door het ruggenmerg binnenkomt, merkbaar als een witte ovaal, gebruik je de schuine tang om de schedel langs de middellijn open te breken, waardoor de hersenen worden blootgesteld.
- Pel de schedel voorzichtig weg aan de kant die naar boven is gericht, waardoor de hersenen worden blootgesteld.
- Til de hersenen uit de schedel en gooi de schedel weg zodra de hersenen volledig zijn verwijderd.
- Verwijder met behulp van de tang de hersenvliezen, die merkbaar zijn als een dun membraan met dichte bloedvaten.
- Plaats de hersenen in een bijou (zie Tabel van Materialen) met daarin 2 ml HBSS-/- op ijs.
- Herhaal stap 2.6 tot 2.13 met de resterende hersenen, waarbij je maximaal vier hersenen per bijou optelt.
- Voeg 250 μL 10x trypsine toe aan de bijou en trituleer de hersenen door de bijou te schudden. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
OPMERKING: Alle stappen vanaf dit punt moeten worden uitgevoerd in een steriele weefselkweekkap. - Ontdooi 2 ml soja-trypsine (SD)-remmer (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml trypsineremmer uit sojabonen, 40 μg/ml DNase I, 3 mg/ml runderserumalbumine [BSA]-fractie V; zie materiaaltabel) van -20 °C door deze bij 37 °C te plaatsen.
- Voeg 2 ml SD-remmer toe aan elke bijou bevattende hersenen (per bijou met maximaal vier hersenen), schud de bijou opnieuw om deze gelijkmatig te verspreiden.
OPMERKING: SD-remmer vermindert de trypsine-activiteit om onnodige vertering van de monsters te voorkomen en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. - Verwijder zonder centrifugatie 2 ml van het supernatant uit elke bijou en breng het over in een centrifugebuis van 15 ml, waarbij u voorzichtig moet zijn om geen celklonten over te brengen.
- Trituleer de resterende cellen in de bijou met een naald van 19 G bevestigd aan een spuit van 5 ml door de suspensie tweemaal aan te zuigen. Hierdoor ontstaat een dik slijmachtig mengsel.
- Herhaal dit nog twee keer met een naald van 21 G. Als er klontjes overblijven, trituleer dan nogmaals met de naald van 21 G.
- Breng de cellen van de bijou over naar dezelfde centrifugebuis van 15 ml (uit stap 2.18) met behulp van een naald van 23 G.
- Centrifugeer op 200 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.
- Verwijder al het supernatant met behulp van een serologische pipet van 5 ml en breng het over naar een andere centrifugebuis van 15 ml, waarbij u voorzichtig moet zijn om de losse pellet aan de onderkant met de vereiste cellen niet te verstoren.
- Centrifugeer het supernatant opnieuw op 200 x g bij RT gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Deze stap is niet essentieel, maar als men veel cellen nodig heeft of weinig embryo's heeft, kan men deze stap uitvoeren om zoveel mogelijk cellen van het supernatant te herstellen. - Gebruik 10 ml plating media (PM) (49% Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium [DMEM], 1% penicilline/streptomycine [Pen/Strep], 25% paardenserum, 25% HBSS met Ca 2+ en Mg2 + [HBSS+ /+]; zie Materiaaltabel), combineer en resuspensie van de twee pellets samen om een hele celsuspensie te creëren.
- Tel de cellen met trypan blauw en een hemocytometer of digitale celteller en verdun de celsuspensie met PM tot een concentratie van 1,8 x 106 cellen / ml.
3. De cellen plateren
- Voeg het vereiste volume van de celsuspensie toe aan het vereiste formaat zoals beschreven in tabel 1: 1.000 μL per put in 6-well-formaat, 50 μL per put in 96-well-formaat of 100 μL per coverslip.
- Incubeer gedurende 2-4 uur bij 37 °C met 5%-7% CO2. Controleer of de cellen zich hebben vastgehecht met behulp van een omgekeerde microscoop.
- Verwijder de media en vul aan met nieuwe differentiatiemedia (DM+: DM- inclusief 10 μg/ml insuline. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM hydrocortison, 10 ng/ml biotine, 2,5 ml 100x N1 mediasupplement; zie Materiaaltabel). De volumes zijn opgenomen in tabel 1. Druk eventuele zwevende coverslips naar beneden met behulp van een steriele pipetpunt.
4. Behoud van de culturen
OPMERKING: Deze culturen moeten driemaal per week worden gevoerd om optimale groei en differentiatie te ondersteunen. De culturen zullen een optimale gezondheid en rijpheid bereiken voor experimenten op DIV (dagen in vitro) 21. Cellen kunnen tot 28 dagen in cultuur worden gehouden, waarna de culturen snel degenereren.
- Vervang drie keer per week tot DIV12 een deel van het supernatant door vers DM+ door 500 μL per put in 6-well-formaat, 50 μL per put in 96-well-formaat, of 500 μL per gerecht met drie coverslips, te verwijderen en 600 μL per put toe te voegen in 6-well-formaat, 60 μL per put in 96-well-formaat, of 600 μL per afdekplaat (tabel 1).
- Vervang vanaf DIV13 drie keer per week een deel van het supernatant door vers DM- door 500 μL per put in 6-well-formaat te verwijderen, 50 μL per put in 96-well-formaat, of 500 μL per gerecht met drie coverslips, en 600 μL per put toe te voegen in 6-well-formaat, 60 μL per put in 96-well-formaat, of 600 μL per afdekplaat (tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microscopie
Culturen gekweekt op glazen dekplaten zijn ideaal om te analyseren door middel van microscopie. Om de ontwikkeling van de culturen te visualiseren, werden de coverslips gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) op meerdere tijdstippen van DIV0 (zodra cellen waren bevestigd) tot DIV28. De culturen werden gekleurd voor immunofluorescentiebeeldvorming zoals eerder beschreven5 met behulp van drie verschillende kleurcombinaties: NG2 (onrijpe oligodendrocyten) en nestine (neuronale stam / voorlopercellen) als ontwikkelingsmarkers, SMI31 (axonen), MBP (myeline) en NeuN (neuroncellichaam) als neuronale markers, of CNP (oligodendrocyten), GFAP (astrocyten) en Iba1 (microglia) als gliale markers (figuur 2).
De verschillende celtypen werden gekwantificeerd met behulp van CellProfiler-pijplijnen (gebaseerd op ′,6-diamidino-2-fenylindool-positief (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). Elk afzonderlijk gegevenspunt werd gegenereerd uit gemiddeld 10 afbeeldingen uit drie coverslips per tijdspunt. Voor microglia, neuronen en oligodendrocyten werd het percentage celtype per 4′,6-diamidino-2-fenylindool-positieve (DAPI+) cel berekend. Het procentuele gezichtsveld werd gebruikt in plaats van het aantal cellen voor het kwantificeren van het aantal astrocyten. Dit was te wijten aan moeilijkheden om onderscheid te maken tussen de afzonderlijke cellen omdat ze elkaar vaak overlapten (figuur 2M,N). De culturen bereikten piekrijpheid en celdichtheid bij DIV21, waarna de culturen begonnen af te breken (figuur 2N).
Belangrijk is dat deze culturen gemakkelijk kunnen worden behandeld met medicijnen, zoals potentiële therapieën, of kunnen worden gebruikt om in vitro infecties op te sporen. In dit voorbeeld werden culturen op coverslips overgebracht naar een 24-well plaat en geïnfecteerd met het zeer neurotrope virus Semliki Forest virus (SFV) (stam SFV6)6, dat zsGreen tot expressie brengt in geïnfecteerde cellen. Een veelvoud van infectie (MOI - het aantal virusdeeltjes toegevoegd per cel) van 0,05, zoals getitreerd op babyhamsterniercellen (BHK), werd gebruikt om infectie op laag niveau te garanderen. Na 0-72 h na infectie (hpi) werden culturen gefixeerd in 4% PFA en gekleurd voor analyse door immunofluorescente beeldvorming. Figuur 3 illustreert dat SFV, in lijn met in vivo infectie, voornamelijk oligodendrocyten en neuronen infecteert6.
qRT-PCR
Naast microscopie kunnen deze CZS-culturen worden gebruikt voor analyse met moleculaire methoden, zoals RT-qPCR van mRNA-reacties op de behandeling. Om de aangeboren antivirale respons verder te onderzoeken, werden 6-well plaatculturen behandeld met een reeks doses van het krachtige antivirale cytokine interferon bèta (IFN-β) gedurende 24 uur. Culturen werden gelyseerd met guanidium-thiocyanaat / fenol en het RNA werd geïsoleerd, omgezet in cDNA en geanalyseerd door qPCR zoals eerder beschreven7. Met behulp van deze methode kan de differentiële expressie van veel genen worden gemeten. Hier werd de upregulatie van Ccl5 gekwantificeerd tegen het huishoudgen 18s. CCL5 is een chemotactisch cytokine (chemokine) dat betrokken is bij de ontstekingsreactie. IFN-β behandeling resulteerde in een upregulatie van Ccl5 mRNA in de culturen (figuur 4A).
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Het 96-well formaat van culturen is een uitstekend hulpmiddel voor high throughput screenings van behandelingen. Om te onderzoeken of de upregulatie van Ccl5-mRNA resulteert in de expressie van CCL5-eiwit, werd CCL5 gemeten in het supernatant van de culturen door ELISA, volgens de instructies van de fabrikant (zie tabel met materialen). In dit voorbeeld werden 96-putculturen in tweevoud behandeld met 27 incrementele doses IFN-β om een dosis-responscurve te genereren (figuur 4B). In lijn met de verhoogde mRNA-expressie (figuur 4A) was er een toename van CCL5 die vrijkwam in het supernatant. Zoals verwacht toont figuur 4C een duidelijke correlatie tussen mRNA en eiwitexpressie.
Flowcytometrie
Flowcytometrie is een krachtig hulpmiddel om tegelijkertijd de expressie van vele intra- en/of extracellulaire markers te onderzoeken. Het analyseren van complexe, zeer interactieve culturen door flowcytometrie kan echter een uitdaging zijn vanwege celbeschadiging en -dood bij het nemen van cellen uit cultuur naar een eencellige suspensie voor verwerking en analyse. Bij het vergelijken van een verscheidenheid aan protocollen met 0,05% -0,5% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1x-10x trypsine zonder EDTA en zacht dissociatiereagens, bleek dat na behandeling van de 6-well plaatculturen met 0,05% trypsine-EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C met zachte agitatie, de cellen werden opgetild met zachte trituratie om een eencellige suspensie te creëren. Vooral voor flowcytometrische analyse van CZS-cellen is het van cruciaal belang om voorzichtig te zijn tijdens de celvoorbereiding, wasstappen te minimaliseren en er goed op te letten dat de cellen te allen tijde op 4 ° C of op ijs worden gehouden.
Om de levensvatbaarheid en celtypen in deze eencellige suspensie te beoordelen, werden cellen gekleurd met een levensvatbaarheidskleurstof en fluorescerend gelabelde antilichamen tegen CD45, CD11b, O4, ACSA-2 en CD24 om visualisatie van elke individuele celpopulatie in de culturen8 mogelijk te maken (figuur 5). Met deze methode werd ongeveer 70% cel levensvatbaarheid verkregen, gemiddeld ongeveer 2 x 106 levensloopbare, enkele cellen per 6-well plaat (figuur 5C). In overeenstemming met de microscopieresultaten (figuur 2N) waren er grote aantallen microglia, neuronen en astrocyten, terwijl oligodendrocyten het minst overvloedig waren.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de beschreven methode om gemengde neuronale en gliale culturen te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: E17 CZS-culturen gekleurd voor immunofluorescentie imaging celmarkers in de loop van de tijd. Cellen werden gefixeerd met 4% PFA voordat ze werden gepermeabiliseerd en gekleurd om verschillende populaties te visualiseren. Representatieve beelden van (A,D,G,J,M) ontwikkelingsmarkers NG2 (voorlopercellen van oligodendrocyten) en nestine (neuronale en gliale voorlopercellen), (B,E,H,K,N) neuronale markers SMI31 (axonen), MBP (myeline) en NeuN (neuroncellichaam), en (C,F,I,L,O) gliale markers CNP (oligodendrocyten), GFAP (astrocyten) en Iba1 (microglia). Schaalbalken = 50 μm. (P) Aantal DAPI per mm2, n = 3, elk n uit technische drievouden van 10 afbeeldingen per drievoud. (Q) Celtellingen als percentage DAPI+ cellen (microglia, oligodendrocyten en neuronen) en percentage van het gezichtsveld (astrocyten), n = 3, elk n van technische drievouden van 10 beelden per drievoud. Foutbalken zijn ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Semliki Forest virus (SFV) infectie van E17 CNS culturen in de loop van de tijd. Representatieve beelden van niet-geïnfecteerde controleculturen (A,C,E,G) en culturen geïnfecteerd met 0,05 MOI SFV (B,D,F,H). Cellen werden gedurende 0-48 uur geïnfecteerd en gekleurd met CNP (oligodendrocytenmarker) en NeuN (neuronmarker) (A-D) of GFAP (astrocytenmarker) en Iba1 (microgliale marker) (E-H). Witte pijlen geven een geïnfecteerde cel aan. Deze stam van SFV drukt het groene fluorescerende eiwit zsGreen uit om het traceren van virale infecties mogelijk te maken. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: CCL5 mRNA en eiwitexpressie van E17 CNS culturen na IFN-β behandeling. Cellen werden behandeld in 6-well plate format (mRNA) of 96-well plate format (eiwit) gedurende 24 uur met een reeks doses IFN-β. (A) Expressie van Ccl5 mRNA na behandeling met 0-100 ng/ml IFN-β, biologische n = 2, elk genomen uit technische drievouden. (B) CCL5-concentratie in het supernatant na behandeling met 0-100 ng/ml IFNβ, biologisch n = 1, afkomstig van technische drievoudigen. (C) Cellulaire mRNA Ccl5-upregulatie versus CCL5-eiwitconcentratie in het supernatant met log-trendlijn. Foutbalken zijn ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Flow cytometry gating strategie om eencellige populaties te genereren uit E17 CNS culturen. Cellen werden gedissocieerd met behulp van 0,05% trypsine-EDTA, gekleurd met geschikte antilichamen en gesorteerd in individuele celpopulaties. (A-C) Gating strategie om te sorteren op levende, enkele cellen. (D) Strategie om te selecteren op microglia (CD45+, CD11b+). (E) Strategie voor de selectie van oligodendrocyten (CD45- CD11b- O4+). (F) Strategie om te sorteren op astrocyten (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+, CD24+) en neuronen (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) Individuele celpopulaties over elkaar heen gelegd, met discrete populaties. (H) Individuele celtypen als percentage van het totaal aantal gesorteerde cellen, n = 4. Foutbalken zijn ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Vereist formaat | BA-PLL/goed | Water om te wassen | Volumecellen in Plating Media (PM) om uit te platen | Media opwaarderen | Verwijderen/toevoegen bij het voeren van culturen (3x/week) |
| 6 goed formaat (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL Media |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| 96 goed formaat (0,32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL DM+ | -50 μL Media |
| +60 μL DM+/- | |||||
| Coverslip in schotelformaat | 20 ml per 200 coverslips | 20 ml | 100 μL per coverslip | +600 μL DM+ | -500 μL Media |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
Tabel 1: Benodigde volumes voor de bereiding van gecoate weefselkweekplastics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het CZS is een complex netwerk dat zich uitstrekt van de hersenen tot aan het ruggenmerg en bestaat uit vele celtypen, voornamelijk neuronen, oligodendrocyten, astrocyten en microglia1. Omdat elke cel een belangrijke rol speelt bij het handhaven van homeostase en het genereren van passende reacties op uitdagingen in het CZS 9,10,11, is een kweeksysteem dat al deze celtypen bevat een nuttig en veelzijdig hulpmiddel om te onderzoeken hoe de hersenen kunnen reageren op een stimulus. Het vermogen om deze cellen en hun interacties in een in vitro context te bestuderen, betekent dat een grote verscheidenheid aan technieken kan worden gebruikt om verschillende experimentele vragen gemakkelijk te onderzoeken. We hebben een snelle en efficiënte methode geschetst om de belangrijkste CZS-celtypen uit het prenatale brein te verkrijgen en te kweken, die individuele celpopulaties in het volwassen muizenbrein kunnen nabootsen12.
Eerder vastgestelde protocollen voor het genereren van CNS-culturen gebruiken E13.5 ruggenmerg 4,5. Naast het hebben van een geschikt model voor het ruggenmerg, is het zeer relevant om een model te hebben dat de hersenen samenvat. Daarom werden hersenen van deze E13.5-muizen oorspronkelijk gebruikt om de hier beschreven CNS-culturen te genereren met behulp van hetzelfde protocol. Na DIV14 begonnen de cellen echter grote aggregaten te vormen met dicht opeengepakte neuronale cellichamen. Hoewel astrocyten aanwezig waren, is het niet duidelijk of ze gelijkmatig verdeeld waren. Het is onduidelijk of de cellen in het midden van deze cellichamen voldoende voedingsstoffen en zuurstof uit het kweekmedium zouden ontvangen zoals de cellen daarbuiten dat zouden doen. Bij het ervaren van zuurstof- en voedingsgebrek, kunnen neuronen door apoptose gaan en stresssignalen afgeven aan gliacellen13, wat kan leiden tot een pro-inflammatoir fenotype14. Neurogenese werd beschouwd als een waarschijnlijke oorzaak van deze dicht opeengepakte aggregaten, en deze fase verdwijnt met E1715. Wanneer hersenen van E17-muizenembryo's werden gebruikt, vormden de cellen nog steeds netwerken, maar clusterden ze niet in de grote aggregaten die in E13.5 werden gezien, en werden daarom beschouwd als een meer geschikte leeftijd voor de hersenculturen om uit te worden gegenereerd.
De huidige techniek resulteert ook in een groter aantal cellen verkregen uit één zwangerschap (gemiddeld 1 x 10 7 cellen / hersenen in vergelijking met 3-4 x 106 cellen / ruggenmerg)7. Voor een gemiddelde zwangere muis met 8-10 embryo's correleert dit met maximaal 54 verschillende experimentele omstandigheden in het 6-well plaatformaat, of 150 experimentele omstandigheden voor microscopie (vergeleken met respectievelijk 19 en 64 van het ruggenmerg). Als zodanig zijn deze CNS-culturen een geweldig hulpmiddel om het vereiste aantal muizente verminderen 16. In het bijzonder kan het 96-well-formaat gemakkelijk worden gebruikt voor assays met een hoge doorvoer, zoals het mogelijk maken van de screening van kandidaat-geneesmiddelen voorafgaand aan dierproeven, waardoor het aantal benodigde dieren voor dergelijke studies aanzienlijk wordt verminderd. Dit zal hopelijk het lage slagingspercentage van het testen van CNS-geneesmiddelen bij dieren verbeteren en de vertaling naar klinische proeven bij mensen verbeteren17,18.
De culturen bereiken de piekrijpheid door DIV21. Het aantal cellen neemt toe tot dit tijdstip, waarna de cellen beginnen te degenereren met afnemende aantallen van elk type cel. Dit werd gemeten door zowel te kijken naar de gekwantificeerde celaantallen (figuur 2N) als het aantal pyknotische kernen (dichte DAPI-vlekken) (figuur 2M). Hoewel de ontwikkelingsmarkers nestine en NG2 nog steeds worden uitgedrukt op DIV14 (figuur 2G) en DIV21 (figuur 2J), is dit te wijten aan het feit dat sommige astrocyten astrogliose doormaken, waardoor nestine19 wordt geupreguleerd, terwijl sommige oligodendrocyten niet volledig volwassen zijn en daarom nog steeds enige NG220 tot expressie brengen. Op basis van de microscopievalidatie geeft slechts een klein deel van de cellen nog steeds ontwikkelingsmarkers tot expressie in vergelijking met de volledig volwassen cellen door DIV21 (figuur 2I, L); Daarom zijn de culturen tegen die tijd grotendeels volwassen. In vivo is de dichtheid van microglia zeer variabel over het muizen-CZS. Het niveau van microglia, zoals gedefinieerd door Iba1-expressie met behulp van microscopie, bevindt zich aan de bovenkant van deze dichtheid in onze culturen12. Het hoge percentage microglia dat de flowcytometrieprocedure overleeft, is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat microglia robuuster zijn dan andere CZS-cellen, die over het algemeen delicate extensies hebben en daarom meer kans hebben om beschadigd te raken tijdens de voorbereiding van flowcytometrie.
Het duurt slechts 3 weken na dissectie totdat de cellen klaar zijn voor experiment, wat korter is dan de meeste op mensen gebaseerde in vitro methoden, zoals organoïden of geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide modellen21. Zolang in vivo onderzoek nodig is om de veiligheid van nieuwe therapieën te waarborgen, zal het gebruik van in vitro celkweekmethoden zoals de onze helpen bij het efficiënt testen van toxiciteit en werkzaamheid voordat op dieren wordt getest, waardoor de behoefte aan dieren wordt verminderd en de vertaling van onderzoek van in vitro naar in vivo wordt verbeterd. Hopelijk zal dit uiteindelijk ook leiden tot een efficiëntere vertaling naar klinische proeven op basis van mensen. Uiteindelijk werden deze culturen gecreëerd om de studie van het CZS mogelijk te maken. Hoewel in vitro systemen de complexiteit van het CZS niet volledig kunnen uitdrukken, geven primaire cel-afgeleide culturen nauwkeuriger in vivo CNS-eigenschappen weer22,23. In vitro benaderingen kunnen een meer reductieve benadering mogelijk maken om het CZS te onderzoeken in afwezigheid van infiltrerende immuuncellen24 en de integriteit van de bloed-hersenbarrière25. Het verwijderen van deze laag van complexiteit kan het gemakkelijker maken om mechanismen te ontrafelen. Als zodanig is het huidige kweeksysteem een nuttig hulpmiddel om onderzoeksvragen te beantwoorden die een aanvulling vormen op in vivo dieronderzoek.
Het vermogen om CNS-cellen te oogsten, te isoleren en te kweken heeft ons begrip van het aangeboren CZSal enorm verbeterd 16. Dit artikel demonstreert de dissectie van E17-muizenhersenen en de resulterende trituratie en kweek van de cellen om een celkweeksysteem te genereren dat alle hoofdceltypen van het CZS bevat. Meerdere moleculaire technieken zijn gebruikt op deze culturen, die de effectiviteit van deze culturen voor het onderzoeken van het CZS aantonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag de leden van de Edgar- en Linington-laboratoria bedanken, in het bijzonder prof. Chris Linington, dr. Diana Arseni en dr. Katja Muecklisch, voor hun advies, nuttige opmerkingen en hulp bij het voeden van de culturen terwijl we deze culturen opzetten. Speciale dank gaat uit naar Dr. Muecklisch voor het leveren van de uitgangspunten voor de Cell Profiler-pijplijnen. Dit werk werd ondersteund door de MS Society (subsidie 122) en de Yuri en Lorna Chernajovsky stichting aan MP; Financiering van de Universiteit van Glasgow aan JC en MP; en Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) en Medical Research Council (MRV0109721) aan GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
