Summary
Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.
Abstract
Los modelos del sistema nervioso central (SNC) deben recapitular la compleja red de células interconectadas que se encuentran in vivo. El SNC consiste principalmente en neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglía. Debido a los crecientes esfuerzos para reemplazar y reducir el uso de animales, se han desarrollado una variedad de sistemas de cultivo celular in vitro para explorar las propiedades celulares innatas, que permiten el desarrollo de terapias para infecciones y patologías del SNC. Si bien ciertas preguntas de investigación pueden ser abordadas por sistemas de cultivo celular basados en humanos, como las células madre pluripotentes (inducidas), trabajar con células humanas tiene sus propias limitaciones con respecto a la disponibilidad, los costos y la ética. Aquí, describimos un protocolo único para aislar y cultivar células de cerebros embrionarios de ratones. Los cultivos celulares neuronales mixtos resultantes imitan varias poblaciones celulares e interacciones que se encuentran en el cerebro in vivo. En comparación con los métodos equivalentes actuales, este protocolo imita más de cerca las características del cerebro y también obtiene más células, lo que permite investigar más condiciones experimentales de un ratón preñado. Además, el protocolo es relativamente fácil y altamente reproducible. Estos cultivos se han optimizado para su uso en varias escalas, incluidas las pantallas de alto rendimiento basadas en 96 pocillos, el análisis de microscopía de 24 pocillos y los cultivos de 6 pocillos para citometría de flujo y análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Este método de cultivo es una herramienta poderosa para investigar la infección y la inmunidad dentro del contexto de algunas de las complejidades del SNC con la conveniencia de los métodos in vitro .
Introduction
Mejorar nuestra comprensión del sistema nervioso central (SNC) es fundamental para mejorar las opciones terapéuticas para muchas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. El SNC, una compleja red de células interconectadas dentro del cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos, comprende neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y sus células inmunes innatas, la microglía1. Un enfoque in vitro a menudo puede reducir drásticamente el número de ratones necesarios para realizar una investigación significativa; sin embargo, la naturaleza compleja del SNC hace imposible recapitular la situación in vivo utilizando líneas celulares. Los cultivos celulares neuronales mixtos proporcionan una herramienta de investigación extremadamente valiosa para investigar cuestiones de neuro(inmuno)logía en un modelo relevante, en línea con los principios de Reemplazo, Reducción y Refinamiento (3R) 2,3.
Thomson et al. describieron un método de cultivo celular utilizando células de la médula espinal prenatal que se diferencian en todos los tipos principales de células del SNC antes mencionados4. Este sistema también tiene formación de sinapsis, axones mielinizados y nodos de Ranvier. La principal limitación de este método de cultivo es que, al ser la médula espinal, no modela de manera útil el cerebro, y los rendimientos celulares de la médula espinal del día embrionario 13 (E13) son constrictivos. Por lo tanto, esto limita el número de condiciones experimentales que se pueden investigar. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un nuevo sistema de cultivo celular que recapitule las características del cerebro con un mayor rendimiento celular para reducir los requisitos de los animales.
Usando Thomson et al. como punto de partida, desarrollamos un modelo de cultivo celular derivado puramente de cerebros de ratones prenatales. Estos cultivos tienen las mismas poblaciones celulares, interconectividad y opciones de tratamiento que los cultivos de la médula espinal, excepto que hay menos mielinización en comparación. Sin embargo, tener un modelo in vitro del SNC con un rendimiento celular aproximadamente tres veces mayor es más eficiente, ya que requiere menos ratones y menos tiempo procesando embriones. Optimizamos este sistema de cultivo único para múltiples aplicaciones y escalas aguas abajo, incluido el uso de cubreobjetos de vidrio para el análisis de microscopía y varios tamaños de placas de pozos de plástico, incluidas placas de 96 pocillos para investigación de alto rendimiento.
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Protocol
Todos los experimentos con animales cumplieron con las leyes y pautas locales para el uso de animales, y fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética local de la Universidad de Glasgow. Los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido de 1986, bajo los auspicios de una Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior del Reino Unido. Para este estudio, se utilizaron ratones adultos C57BL / 6J criados internamente. Se recomienda el uso de mujeres jóvenes (8-12 semanas) debido a la mayor tasa de éxito del embarazo; Los machos pueden ser reutilizados para múltiples rondas de reproducción. La Figura 1 representa una descripción esquemática del método descrito para generar cultivos neuronales y gliales mixtos.
1. Preparación de los consumibles de cultivo de tejidos
- Prepare los platos y/o platos que contengan cubreobjetos de microscopía dentro de un gabinete de seguridad de Clase 2. Esterilizar todos los reactivos o autoclaves para asegurar la esterilidad durante el período de cultivo.
- Agregue el volumen apropiado de BA-PLL (13.2 μg/mL poli-L-lisinahidrobromuro [PLL] en tampón de ácido bórico [BA] [50 mM de ácido bórico, 12.5 mM de tetraborato de sodio, pH 8.5]; ver Tabla de materiales) a cada pocillo (1,000 μL/pocillo en una placa de 6 pocillos, 100 μL/pocillo en una placa de 96 pocillos; los volúmenes se resumen en la Tabla 1). Para los cubreobjetos de microscopía, agregue 20 ml de BA-PLL a una placa de cultivo de tejidos de 9 cm de diámetro que contenga 200 cubreobjetos estériles y agite para distribuir uniformemente.
- Incubar a 37 °C durante 1-2 h.
- Retire la solución de BA-PLL de cada pocillo o plato que contenga cubreobjetos de microscopía y lávelos agregando 20 ml de agua estéril, agitando los cubreobjetos y luego retirando el agua. Repita este paso de lavado tres veces. Para un plato que contiene cubreobjetos, deje agua estéril en el plato de cultivo de tejidos en el lavado final para quitar fácilmente los cubreobjetos.
- Retire la mayor cantidad de líquido posible con una pipeta estéril y deje secar durante al menos 2 h durante toda la noche.
- Conservar las placas recubiertas a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
NOTA: La solución de ácido bórico preparado con poli-l-lisina (BA-PLL) se puede reutilizar hasta tres veces, agregando nueva PLL cada vez. Conservar el BA-PLL a 4 °C. Los platos se tratan con BA-PLL, ya que el PLL permite que las células se peguen y crezcan. Sin este tratamiento, las células se levantarán después de aproximadamente 1 semana de cultivo y ya no podrán diferenciarse.
2. Disección de cerebros embrionarios E17
- Co-casa uno o varios ratones hembra con un ratón macho. Revise a las hembras diariamente para ver si hay un tapón de moco, lo que indica que se ha producido el apareamiento.
NOTA: Cualquier ratón hembra "tapado" debe separarse del macho para garantizar la fecha correcta de inicio de la gestación. Los ratones pueden ser pesados para confirmar el embarazo o monitoreados visualmente. - Sacrificar a la ratona preñada en E17 utilizando métodos apropiados de acuerdo con las directrices y leyes locales de bienestar animal, por ejemplo, aumentando la concentración de dióxido de carbono (CO2), una sobredosis de anestesia letal o la dislocación del cuello.
NOTA: El método elegido no debe interrumpir los embriones. Para este estudio, la exposición a una concentración creciente de gas de dióxido de carbono seguida de la confirmación de la muerte por corte de la arteria femoral se utilizó para sacrificar a las madres embarazadas. - Coloque el ratón preñado sacrificado sobre su espalda en una tabla de disección; Si bien no es necesario fijarlo, podría hacerlo más fácil para los investigadores sin experiencia. Pellizque la línea media del abdomen con fórceps. Con unas tijeras afiladas, abra el abdomen a través de la piel y el peritoneo sobre la línea media desde los genitales hasta la caja torácica, teniendo cuidado de no perforar el útero.
- El útero del ratón tiene dos cuernos, cada uno típicamente contiene de uno a cinco embriones. Retire el útero que contiene los embriones de la madre e inmediatamente colóquelo en hielo.
- Corte a través del saco vitelino en el lado de las placentas, teniendo cuidado de no dañar los embriones, y retire los embriones de su saco vitelino.
- Decapitar inmediatamente los embriones. Agregue las cabezas decapitadas en un plato con la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) sin calcio (Ca 2+) y magnesio (Mg2+) (HBSS-/-) en hielo.
NOTA: Si se requiere genotipado, se puede quitar la cola en esta etapa para el análisis genético. Cuando se esperan múltiples genotipos, las cabezas de cada embrión deben mantenerse separadas para el cultivo. - Usando pinzas en ángulo, coloque la cabeza de lado mirando hacia la izquierda.
- Perfore el ojo con un borde de los fórceps, sujetando firmemente la barbilla con el otro.
- Comenzando en la nuca, rasgue suavemente la piel del cuero cabelludo a lo largo de la línea media hacia la punta del hocico.
- Al entrar a través de la médula espinal, notable como un óvalo blanco, use los fórceps en ángulo para abrir el cráneo a lo largo de la línea media, exponiendo el cerebro.
- Despegue suavemente el cráneo del lado hacia arriba, exponiendo el cerebro.
- Levante el cerebro fuera del cráneo, desechando el cráneo una vez que el cerebro se haya eliminado por completo.
- Usando los fórceps, retire las meninges, que se notan como una membrana delgada con vasos sanguíneos densos.
- Coloque los cerebros en una joya (consulte la Tabla de materiales) que contenga 2 ml de HBSS-/- en hielo.
- Repita los pasos 2.6 a 2.13 con los cerebros restantes, sumando hasta cuatro cerebros por bisutería.
- Agregue 250 μL de tripsina 10x a la bisutería y triture los cerebros agitando la bisutería. Incubar durante 15 min a 37 °C.
NOTA: Todos los pasos a partir de este punto en adelante deben realizarse en una campana de cultivo de tejido estéril. - Descongele 2 ml de inhibidor de la tripsina de soja (SD) (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml inhibidor de tripsina de soja, 40 μg/ml DNasa I, 3 mg/ml de albúmina sérica bovina [BSA] fracción V; ver Tabla de materiales) de -20 °C colocándola a 37 °C.
- Agregue 2 ml de inhibidor SD a cada bisutería que contenga cerebros (por bisutería que contenga hasta cuatro cerebros), agitando la bisutería nuevamente para dispersarla uniformemente.
NOTA: El inhibidor de SD disminuye la actividad de la tripsina para evitar la digestión innecesaria de las muestras y preservar la viabilidad celular. - Sin centrifugación, retire 2 ml del sobrenadante de cada bisutería y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 ml, teniendo cuidado de no transferir grupos celulares.
- Triturar las células restantes en la bisutería con una aguja de 19 G conectada a una jeringa de 5 ml aspirando la suspensión dos veces. Esto creará una mezcla espesa similar al moco.
- Repita dos veces más con una aguja de 21 G. Si quedan grumos, triturar una vez más con la aguja de 21 G.
- Transfiera las células de la bisutería al mismo tubo centrífugo de 15 ml (a partir del paso 2.18) utilizando una aguja de 23 G.
- Centrifugar a 200 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
- Retirar todo el sobrenadante con una pipeta serológica de 5 ml y transferirlo a otro tubo de centrífuga de 15 ml, teniendo cuidado de no alterar el pellet suelto en el fondo que contiene las células requeridas.
- Centrifugar de nuevo el sobrenadante a 200 x g a RT durante 5 min.
NOTA: Este paso no es esencial, pero si uno requiere muchas células o tiene pocos embriones, se podría realizar este paso para recuperar tantas células como sea posible del sobrenadante. - Usando 10 ml de medios de recubrimiento (PM) (49% de medio de águila modificado de Dulbecco [DMEM], 1% de penicilina/estreptomicina [Pen/Strep], 25% de suero de caballo, 25% de HBSS con Ca 2+ y Mg2 + [HBSS+ /+]; ver Tabla de materiales), combine y resuspenda los dos gránulos juntos para crear una suspensión de células completas.
- Contar las células usando azul de tripano y un hemocitómetro o contador celular digital, y diluir la suspensión celular con PM a una concentración de 1.8 x 106 células/ml.
3. Recubrimiento de las células
- Agregue el volumen requerido de la suspensión celular al formato requerido como se detalla en la Tabla 1: 1,000 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 100 μL por cubreobjetos.
- Incubar durante 2-4 h a 37 °C con 5%-7% deCO2. Verifique que las células se hayan adherido con un microscopio invertido.
- Retire el medio y rellene con un nuevo medio de diferenciación (DM+: DM- incluyendo insulina de 10 μg/ml. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM hidrocortisona, 10 ng/mL de biotina, 2.5 mL 100x N1 suplemento de medios; véase la Tabla de materiales). Los volúmenes se detallan en la Tabla 1. Presione cualquier cubreobjetos flotantes con una punta de pipeta estéril.
4. Mantener las culturas
NOTA: Estos cultivos requieren alimentación tres veces por semana para apoyar el crecimiento y la diferenciación óptimos. Los cultivos alcanzarán una salud y madurez óptimas para experimentos en DIV (días in vitro) 21. Las células se pueden mantener en cultivo hasta por 28 días, después de lo cual los cultivos degeneran rápidamente.
- Tres veces por semana hasta DIV12, sustituir parte del sobrenadante por DM+ fresca eliminando 500 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 500 μL por plato que contenga tres cubreobjetos, y añadiendo 600 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 60 μL por pocillo en formato de 96 pocillos, o 600 μL por plato de cubreobjetos (Tabla 1).
- Tres veces por semana a partir de la DIV13, sustituir parte del sobrenadante por DM- fresca eliminando 500 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 500 μL por plato que contenga tres cubreobjetos, y añadiendo 600 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 60 μL por pocillo en formato de 96 pocillos, o 600 μL por plato de cubreobjetos (Tabla 1).
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Representative Results
Microscopia
Los cultivos cultivados en cubreobjetos de vidrio son ideales para analizar por microscopía. Para visualizar el desarrollo de los cultivos, los cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) en múltiples puntos de tiempo desde DIV0 (una vez que las células se unieron) hasta DIV28. Los cultivos se tiñeron para imágenes de inmunofluorescencia como se describió anteriormente5 utilizando tres combinaciones de tinción diferentes: NG2 (oligodendrocitos inmaduros) y nestina (células madre / progenitoras neuronales) como marcadores de desarrollo, SMI31 (axones), MBP (mielina) y NeuN (cuerpo celular neuronal) como marcadores neuronales, o CNP (oligodendrocitos), GFAP (astrocitos) e Iba1 (microglia) como marcadores gliales (Figura 2).
Los diversos tipos de células se cuantificaron utilizando tuberías CellProfiler (basadas en ′,6-diamidino-2-fenilindol-positivo (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). Cada punto de datos individual se generó a partir de un promedio de 10 imágenes tomadas de tres cubreobjetos por punto de tiempo. Para microglía, neuronas y oligodendrocitos, se calculó el porcentaje de tipo celular por célula 4′,6-diamidino-2-fenilindol-positiva (DAPI+). Se utilizó el campo de visión porcentual en lugar del número de células para cuantificar el número de astrocitos. Esto se debió a las dificultades para diferenciar entre las células individuales, ya que con frecuencia se superponían (Figura 2M, N). Los cultivos alcanzaron la madurez máxima y la densidad celular en DIV21, después de lo cual los cultivos comenzaron a degradarse (Figura 2N).
Es importante destacar que estos cultivos pueden tratarse fácilmente con medicamentos, como posibles terapias, o usarse para rastrear infecciones in vitro . En este ejemplo, los cultivos en cubreobjetos se transfirieron a una placa de 24 pocillos y se infectaron con el virus altamente neurotrópico Semliki Forest virus (SFV) (cepa SFV6)6, que expresa zsGreen en células infectadas. Se utilizó una multiplicidad de infección (MOI, el número de partículas de virus agregadas por célula) de 0,05, como se tituló en células de riñón de hámster bebé (BHK), para garantizar una infección de bajo nivel. Después de 0-72 h después de la infección (hpi), los cultivos se fijaron en PFA al 4% y se tiñeron para su análisis por imágenes inmunofluorescentes. La Figura 3 ilustra que, en línea con la infección in vivo , el VSF infecta principalmente oligodendrocitos y neuronas6.
qRT-PCR
Además de la microscopía, estos cultivos del SNC se pueden utilizar para el análisis por métodos moleculares, como RT-qPCR de las respuestas de ARNm al tratamiento. Para investigar más a fondo la respuesta antiviral innata, se trataron cultivos en placa de 6 pocillos con un rango de dosis de la potente citoquina antiviral interferón beta (IFN-β) durante 24 h. Los cultivos se lisaron con guanidio-tiocianato/fenol, y el ARN se aisló, se convirtió en ADNc y se analizó por qPCR como se describió anteriormente7. Usando este método, se puede medir la expresión diferencial de muchos genes. Aquí, la regulación positiva de Ccl5 se cuantificó contra el gen de limpieza 18s. CCL5 es una citocina quimiotáctica (quimiocina) involucrada en la respuesta inflamatoria. El tratamiento con IFN-β resultó en una regulación positiva del ARNm de Ccl5 en los cultivos (Figura 4A).
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
El formato de cultivos de 96 pocillos es una excelente herramienta para exámenes de detección de tratamientos de alto rendimiento. Para investigar si la regulación positiva del ARNm de Ccl5 da como resultado la expresión de la proteína CCL5, se midió CCL5 en el sobrenadante de los cultivos mediante ELISA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales). En este ejemplo, los cultivos de 96 pocillos fueron tratados por duplicado con 27 dosis incrementales de IFN-β para generar una curva dosis-respuesta (Figura 4B). En línea con el aumento de la expresión de ARNm (Figura 4A), hubo un aumento en CCL5 liberado en el sobrenadante. Como era de esperar, la Figura 4C demuestra una clara correlación entre el ARNm y la expresión de proteínas.
Citometría de flujo
La citometría de flujo es una herramienta poderosa para investigar simultáneamente la expresión de muchos marcadores intra y / o extracelulares. Sin embargo, el análisis de cultivos complejos y altamente interactivos mediante citometría de flujo puede ser un desafío debido al daño celular y la muerte al llevar células del cultivo a una suspensión de una sola célula para su procesamiento y análisis. Comparando una variedad de protocolos utilizando ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,05% -0,5%, tripsina 1x-10x sin EDTA y reactivo de disociación suave, se encontró que después de tratar los cultivos en placa de 6 pocillos con tripsina-EDTA al 0,05% durante 10 min a 37 °C con agitación suave, las células se levantaron con una trituración suave para crear una suspensión de una sola célula. Especialmente para el análisis citométrico de flujo de las células del SNC, es fundamental ser suave durante la preparación celular, minimizar los pasos de lavado y tener mucho cuidado de mantener las células a 4 ° C o en hielo en todo momento.
Para evaluar la viabilidad y los tipos celulares en esta suspensión unicelular, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad y anticuerpos marcados fluorescentemente contra CD45, CD11b, O4, ACSA-2 y CD24 para permitir la visualización de cada población celular individual en los cultivos8 (Figura 5). Se obtuvo alrededor del 70% de viabilidad celular de este método, con un promedio de aproximadamente 2 x 10 6 células individuales viables por placa de6 pocillos (Figura 5C). De acuerdo con los resultados de la microscopía (Figura 2N), hubo un gran número de microglías, neuronas y astrocitos, mientras que los oligodendrocitos fueron los menos abundantes.
Figura 1: Descripción esquemática del método descrito para generar cultivos neuronales y gliales mixtos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cultivos E17 del SNC teñidos para marcadores celulares de imágenes de inmunofluorescencia a lo largo del tiempo. Las células se fijaron con PFA al 4% antes de ser permeabilizadas y teñidas para visualizar diferentes poblaciones. Imágenes representativas de (A,D,G,J,M) marcadores de desarrollo NG2 (células precursoras de oligodendrocitos) y nestina (células precursoras neuronales y gliales), (B,E,H,K,N) marcadores neuronales SMI31 (axones), MBP (mielina) y NeuN (cuerpo celular neuronal), y (C,F,I,L,O) MARCADORES GLIALES CNP (OLIGODENDROCITOS), GAP (ASTROCITOS) E Iba1 (microglía). Barras de escala = 50 μm. (P) Recuentos de DAPI por mm2, n = 3, cada n a partir de triplicados técnicos de 10 imágenes por triplicado. (Q) Recuentos celulares como porcentaje de células DAPI+ (microglía, oligodendrocitos y neuronas) y porcentaje del campo de visión (astrocitos), n = 3, cada n a partir de triplicados técnicos de 10 imágenes por triplicado. Las barras de error son ± error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Infección por el virus del bosque de Semliki (SFV) de cultivos E17 del SNC a lo largo del tiempo. Imágenes representativas de cultivos de control no infectados (A,C,E,G) y cultivos infectados con 0,05 MOI SVS (B,D,F,H). Las células se infectaron durante 0-48 h y se tiñeron con CNP (marcador oligodendrocitos) y NeuN (marcador neuronal) (A-D) o GFAP (marcador de astrocitos) e Iba1 (marcador microglial) (E-H). Las flechas blancas indican una célula infectada. Esta cepa de SFV expresa la proteína verde fluorescente zsGreen para permitir el rastreo de la infección viral. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: ARNm CCL5 y expresión proteica de cultivos E17 del SNC después del tratamiento con IFN-β. Las células se trataron en formato de placa de 6 pocillos (ARNm) o en formato de placa de 96 pocillos (proteína) durante 24 h con un rango de dosis de IFN-β. (A) Expresión de ARNm de Ccl5 después del tratamiento con 0-100 ng/mL de IFN-β, n biológico = 2, cada uno tomado de triplicados técnicos. (B) concentración de CCL5 en el sobrenadante después de 0-100 ng/ml de tratamiento con IFNβ, biológico n = 1, tomado a partir de triplicados técnicos. (C) Regulación positiva del ARNm celular Ccl5 frente a la concentración de proteína CCL5 en el sobrenadante con línea de tendencia logarítmica. Las barras de error están ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Estrategia de activación por citometría de flujo para generar poblaciones unicelulares a partir de cultivos E17 del SNC. Las células se disociaron usando tripsina-EDTA al 0,05%, se tiñeron con anticuerpos apropiados y se clasificaron en poblaciones celulares individuales. (A-C) Estrategia de acceso para clasificar las células vivas y únicas. (D) Estrategia para seleccionar microglia (CD45+ CD11b+). (E) Estrategia para seleccionar oligodendrocitos (CD45- CD11b- O4+). (F) Estrategia para clasificar astrocitos (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+ CD24+) y neuronas (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) Poblaciones celulares individuales superpuestas entre sí, mostrando poblaciones discretas. (H) Tipos de células individuales como porcentaje del total de células ordenadas, n = 4. Las barras de error están ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Formato requerido | BA-PLL/pozo | Agua para lavar | Celdas de volumen en medios de recubrimiento (PM) para placa | Recargar medios | Eliminar/agregar al alimentar cultivos (3x/semana) |
| Formato de 6 pocillos (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL Media |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| Formato de 96 pocillos (0,32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL MS+ | -50 μL de medios |
| +60 μL DM+/- | |||||
| Coverslip en formato plato | 20 ml por cada 200 cubreobjetos | 20 ml | 100 μL por cubreobjetos | +600 μL DM+ | -500 μL Media |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
Tabla 1: Volúmenes requeridos para la preparación de plásticos de cultivo de tejidos recubiertos.
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Discussion
El SNC es una red compleja que se extiende desde el cerebro hasta la médula espinal y consta de muchos tipos de células, predominantemente neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglía1. Como cada célula tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la generación de respuestas apropiadas a los desafíos en el SNC 9,10,11, un sistema de cultivo que contenga todos estos tipos de células es una herramienta útil y versátil para investigar cómo el cerebro podría reaccionar a un estímulo. La capacidad de estudiar estas células, y sus interacciones, en un contexto in vitro significa que se puede emplear una gran variedad de técnicas para investigar fácilmente varias cuestiones experimentales. Hemos esbozado un método rápido y eficiente para obtener y cultivar los principales tipos de células del SNC del cerebro prenatal, que pueden imitar poblaciones celulares individuales en el cerebro de ratón adulto12.
Los protocolos previamente establecidos para la generación de cultivos del SNC utilizan la médula espinal E13.5 4,5. Además de tener un modelo adecuado para la médula espinal, es muy relevante contar con un modelo que recapitule el cerebro. Por lo tanto, los cerebros de estos ratones E13.5 se utilizaron originalmente para generar los cultivos del SNC descritos aquí utilizando el mismo protocolo. Sin embargo, después de DIV14, las células comenzaron a formar grandes agregados con cuerpos celulares neuronales densamente empaquetados. Si bien los astrocitos estaban presentes, no está claro si estaban distribuidos uniformemente. No está claro si las células en el centro de estos cuerpos celulares recibirían suficientes nutrientes y oxígeno del medio de cultivo como lo harían las células externas. Al experimentar privación de oxígeno y nutrientes, las neuronas son propensas a pasar por la apoptosis y liberar señales de estrés a las células gliales13, lo que podría conducir a un fenotipo proinflamatorio14. Se pensaba que la neurogénesis era una causa probable de estos agregados densamente empaquetados, y esta fase disminuye por E1715. Cuando se utilizaron cerebros de embriones de ratón E17, las células aún formaban redes, pero no se agrupaban en los grandes agregados observados en E13.5, y por lo tanto se consideraron como una edad más adecuada para los cultivos cerebrales que se generaron.
La técnica actual también da como resultado un mayor número de células obtenidas de un embarazo (con un promedio de 1 x 10 7 células/cerebro en comparación con 3-4 x 106 células/médula espinal)7. Para un ratón preñado promedio con 8-10 embriones, esto se correlaciona con hasta 54 condiciones experimentales diferentes en el formato de placa de 6 pocillos, o 150 condiciones experimentales para microscopía (en comparación con 19 y 64, respectivamente, de la médula espinal). Como tal, estos cultivos del SNC son una gran herramienta para reducir el número requerido de ratones16. En particular, el formato de 96 pocillos se puede utilizar fácilmente para ensayos de alto rendimiento, como permitir la selección de candidatos a fármacos antes de las pruebas en animales, reduciendo enormemente el número de animales necesarios para tales estudios. Se espera que esto mejore la baja tasa de éxito de las pruebas de medicamentos del SNC en animales y mejore la traducción a ensayos clínicos en humanos17,18.
Los cultivos alcanzan la madurez máxima en DIV21. Los recuentos de células aumentan hasta este punto de tiempo, después de lo cual las células comienzan a degenerar con números decrecientes de cada tipo de célula. Esto se midió observando tanto el número de células cuantificadas (Figura 2N) como el número de núcleos picnóticos (tinciones DAPI densas) (Figura 2M). Si bien los marcadores de desarrollo nestina y NG2 todavía se expresan en DIV14 (Figura 2G) y DIV21 (Figura 2J), esto se debe a que algunos de los astrocitos pasan por astrogliosis, que regula al alza la nestina19, mientras que algunos de los oligodendrocitos no están completamente maduros y, por lo tanto, aún expresan algo de NG220. Con base en la validación microscópica, solo una pequeña porción de las células aún expresa marcadores de desarrollo en comparación con las células completamente maduras por DIV21 (Figura 2I, L); Por lo tanto, las culturas son en gran parte maduras en este momento. Cabe destacar que, in vivo, la densidad de la microglía es muy variable en todo el SNC murino. El nivel de microglía, definido por la expresión de Iba1 mediante microscopía, se encuentra en el extremo superior de esa densidad en nuestros cultivos12. El alto porcentaje de microglía que sobrevive al procedimiento de citometría de flujo probablemente se deba a que la microglía es más robusta que otras células del SNC, que generalmente tienen extensiones delicadas y, por lo tanto, es más probable que se dañen durante la preparación de la citometría de flujo.
Solo toma 3 semanas después de la disección hasta que las células estén listas para la experimentación, que es más corta que la mayoría de los métodos in vitro basados en humanos, como los organoides o los modelos derivados de células madre pluripotentes inducidas21. Mientras se requiera investigación in vivo para garantizar la seguridad de nuevas terapias, el uso de métodos de cultivo de células in vitro como el nuestro ayudará a probar la toxicidad y la eficacia de manera eficiente antes de las pruebas en animales, reduciendo la necesidad de animales y mejorando la traducción de la investigación de in vitro a in vivo. Con suerte, esto eventualmente conducirá a una traducción más eficiente a ensayos clínicos basados en humanos también. En última instancia, estos cultivos fueron creados para permitir el estudio del SNC. Mientras que los sistemas in vitro no pueden expresar completamente la complejidad del SNC, los cultivos primarios derivados de células representan con mayor precisión las propiedades in vivo del SNC22,23. Los enfoques in vitro pueden permitir un enfoque más reductivo para investigar el SNC en ausencia de células inmunes infiltrantes24 y la integridad de la barrera hematoencefálica25. Eliminar esta capa de complejidad puede facilitar el desentrañamiento de los mecanismos. Como tal, el sistema de cultivo actual es una herramienta útil para responder preguntas de investigación que complementan la investigación animal in vivo.
La capacidad de cosechar, aislar y cultivar células del SNC ya ha avanzado enormemente nuestra comprensión del SNC innato16. Este artículo demuestra la disección de cerebros de ratones E17 y la trituración y cultivo resultante de las células para generar un sistema de cultivo celular que contenga todos los tipos de células principales del SNC. Se han empleado múltiples técnicas moleculares en estos cultivos, mostrando la efectividad que estos cultivos tienen para investigar el SNC.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a los miembros de los laboratorios de Edgar y Linington, en particular al Prof. Chris Linington, la Dra. Diana Arseni y la Dra. Katja Muecklisch, por sus consejos, comentarios útiles y asistencia para alimentar las culturas mientras establecemos estas culturas. Un agradecimiento especial al Dr. Muecklisch por proporcionar los puntos de partida para las tuberías de Cell Profiler. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad de EM (subvención 122) y la fundación Yuri y Lorna Chernajovsky a MP; Financiación de la Universidad de Glasgow a JC y MP; y Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) y Medical Research Council (MRV0109721) a GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
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