Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.
Los modelos del sistema nervioso central (SNC) deben recapitular la compleja red de células interconectadas que se encuentran in vivo. El SNC consiste principalmente en neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglía. Debido a los crecientes esfuerzos para reemplazar y reducir el uso de animales, se han desarrollado una variedad de sistemas de cultivo celular in vitro para explorar las propiedades celulares innatas, que permiten el desarrollo de terapias para infecciones y patologías del SNC. Si bien ciertas preguntas de investigación pueden ser abordadas por sistemas de cultivo celular basados en humanos, como las células madre pluripotentes (inducidas), trabajar con células humanas tiene sus propias limitaciones con respecto a la disponibilidad, los costos y la ética. Aquí, describimos un protocolo único para aislar y cultivar células de cerebros embrionarios de ratones. Los cultivos celulares neuronales mixtos resultantes imitan varias poblaciones celulares e interacciones que se encuentran en el cerebro in vivo. En comparación con los métodos equivalentes actuales, este protocolo imita más de cerca las características del cerebro y también obtiene más células, lo que permite investigar más condiciones experimentales de un ratón preñado. Además, el protocolo es relativamente fácil y altamente reproducible. Estos cultivos se han optimizado para su uso en varias escalas, incluidas las pantallas de alto rendimiento basadas en 96 pocillos, el análisis de microscopía de 24 pocillos y los cultivos de 6 pocillos para citometría de flujo y análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Este método de cultivo es una herramienta poderosa para investigar la infección y la inmunidad dentro del contexto de algunas de las complejidades del SNC con la conveniencia de los métodos in vitro .
Mejorar nuestra comprensión del sistema nervioso central (SNC) es fundamental para mejorar las opciones terapéuticas para muchas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. El SNC, una compleja red de células interconectadas dentro del cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos, comprende neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y sus células inmunes innatas, la microglía1. Un enfoque in vitro a menudo puede reducir drásticamente el número de ratones necesarios para realizar una investigación significativa; sin embargo, la naturaleza compleja del SNC hace imposible recapitular la situación in vivo utilizando líneas celulares. Los cultivos celulares neuronales mixtos proporcionan una herramienta de investigación extremadamente valiosa para investigar cuestiones de neuro(inmuno)logía en un modelo relevante, en línea con los principios de Reemplazo, Reducción y Refinamiento (3R) 2,3.
Thomson et al. describieron un método de cultivo celular utilizando células de la médula espinal prenatal que se diferencian en todos los tipos principales de células del SNC antes mencionados4. Este sistema también tiene formación de sinapsis, axones mielinizados y nodos de Ranvier. La principal limitación de este método de cultivo es que, al ser la médula espinal, no modela de manera útil el cerebro, y los rendimientos celulares de la médula espinal del día embrionario 13 (E13) son constrictivos. Por lo tanto, esto limita el número de condiciones experimentales que se pueden investigar. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un nuevo sistema de cultivo celular que recapitule las características del cerebro con un mayor rendimiento celular para reducir los requisitos de los animales.
Usando Thomson et al. como punto de partida, desarrollamos un modelo de cultivo celular derivado puramente de cerebros de ratones prenatales. Estos cultivos tienen las mismas poblaciones celulares, interconectividad y opciones de tratamiento que los cultivos de la médula espinal, excepto que hay menos mielinización en comparación. Sin embargo, tener un modelo in vitro del SNC con un rendimiento celular aproximadamente tres veces mayor es más eficiente, ya que requiere menos ratones y menos tiempo procesando embriones. Optimizamos este sistema de cultivo único para múltiples aplicaciones y escalas aguas abajo, incluido el uso de cubreobjetos de vidrio para el análisis de microscopía y varios tamaños de placas de pozos de plástico, incluidas placas de 96 pocillos para investigación de alto rendimiento.
El SNC es una red compleja que se extiende desde el cerebro hasta la médula espinal y consta de muchos tipos de células, predominantemente neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglía1. Como cada célula tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la generación de respuestas apropiadas a los desafíos en el SNC 9,10,11, un sistema de cultivo que contenga todos estos tipos de células es una herra…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a los miembros de los laboratorios de Edgar y Linington, en particular al Prof. Chris Linington, la Dra. Diana Arseni y la Dra. Katja Muecklisch, por sus consejos, comentarios útiles y asistencia para alimentar las culturas mientras establecemos estas culturas. Un agradecimiento especial al Dr. Muecklisch por proporcionar los puntos de partida para las tuberías de Cell Profiler. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad de EM (subvención 122) y la fundación Yuri y Lorna Chernajovsky a MP; Financiación de la Universidad de Glasgow a JC y MP; y Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) y Medical Research Council (MRV0109721) a GJG.
10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |