Summary

Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.

Abstract

Los modelos del sistema nervioso central (SNC) deben recapitular la compleja red de células interconectadas que se encuentran in vivo. El SNC consiste principalmente en neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglía. Debido a los crecientes esfuerzos para reemplazar y reducir el uso de animales, se han desarrollado una variedad de sistemas de cultivo celular in vitro para explorar las propiedades celulares innatas, que permiten el desarrollo de terapias para infecciones y patologías del SNC. Si bien ciertas preguntas de investigación pueden ser abordadas por sistemas de cultivo celular basados en humanos, como las células madre pluripotentes (inducidas), trabajar con células humanas tiene sus propias limitaciones con respecto a la disponibilidad, los costos y la ética. Aquí, describimos un protocolo único para aislar y cultivar células de cerebros embrionarios de ratones. Los cultivos celulares neuronales mixtos resultantes imitan varias poblaciones celulares e interacciones que se encuentran en el cerebro in vivo. En comparación con los métodos equivalentes actuales, este protocolo imita más de cerca las características del cerebro y también obtiene más células, lo que permite investigar más condiciones experimentales de un ratón preñado. Además, el protocolo es relativamente fácil y altamente reproducible. Estos cultivos se han optimizado para su uso en varias escalas, incluidas las pantallas de alto rendimiento basadas en 96 pocillos, el análisis de microscopía de 24 pocillos y los cultivos de 6 pocillos para citometría de flujo y análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Este método de cultivo es una herramienta poderosa para investigar la infección y la inmunidad dentro del contexto de algunas de las complejidades del SNC con la conveniencia de los métodos in vitro .

Introduction

Mejorar nuestra comprensión del sistema nervioso central (SNC) es fundamental para mejorar las opciones terapéuticas para muchas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. El SNC, una compleja red de células interconectadas dentro del cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos, comprende neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y sus células inmunes innatas, la microglía1. Un enfoque in vitro a menudo puede reducir drásticamente el número de ratones necesarios para realizar una investigación significativa; sin embargo, la naturaleza compleja del SNC hace imposible recapitular la situación in vivo utilizando líneas celulares. Los cultivos celulares neuronales mixtos proporcionan una herramienta de investigación extremadamente valiosa para investigar cuestiones de neuro(inmuno)logía en un modelo relevante, en línea con los principios de Reemplazo, Reducción y Refinamiento (3R) 2,3.

Thomson et al. describieron un método de cultivo celular utilizando células de la médula espinal prenatal que se diferencian en todos los tipos principales de células del SNC antes mencionados4. Este sistema también tiene formación de sinapsis, axones mielinizados y nodos de Ranvier. La principal limitación de este método de cultivo es que, al ser la médula espinal, no modela de manera útil el cerebro, y los rendimientos celulares de la médula espinal del día embrionario 13 (E13) son constrictivos. Por lo tanto, esto limita el número de condiciones experimentales que se pueden investigar. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un nuevo sistema de cultivo celular que recapitule las características del cerebro con un mayor rendimiento celular para reducir los requisitos de los animales.

Usando Thomson et al. como punto de partida, desarrollamos un modelo de cultivo celular derivado puramente de cerebros de ratones prenatales. Estos cultivos tienen las mismas poblaciones celulares, interconectividad y opciones de tratamiento que los cultivos de la médula espinal, excepto que hay menos mielinización en comparación. Sin embargo, tener un modelo in vitro del SNC con un rendimiento celular aproximadamente tres veces mayor es más eficiente, ya que requiere menos ratones y menos tiempo procesando embriones. Optimizamos este sistema de cultivo único para múltiples aplicaciones y escalas aguas abajo, incluido el uso de cubreobjetos de vidrio para el análisis de microscopía y varios tamaños de placas de pozos de plástico, incluidas placas de 96 pocillos para investigación de alto rendimiento.

Protocol

Todos los experimentos con animales cumplieron con las leyes y pautas locales para el uso de animales, y fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética local de la Universidad de Glasgow. Los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido de 1986, bajo los auspicios de una Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior del Reino Unido. Para este estudio, se utilizaron ratones adultos C57BL / 6J criados inter…

Representative Results

MicroscopiaLos cultivos cultivados en cubreobjetos de vidrio son ideales para analizar por microscopía. Para visualizar el desarrollo de los cultivos, los cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) en múltiples puntos de tiempo desde DIV0 (una vez que las células se unieron) hasta DIV28. Los cultivos se tiñeron para imágenes de inmunofluorescencia como se describió anteriormente5 utilizando tres combinaciones de tinción diferentes: NG2 (oligodendrocitos in…

Discussion

El SNC es una red compleja que se extiende desde el cerebro hasta la médula espinal y consta de muchos tipos de células, predominantemente neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglía1. Como cada célula tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la generación de respuestas apropiadas a los desafíos en el SNC 9,10,11, un sistema de cultivo que contenga todos estos tipos de células es una herra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a los miembros de los laboratorios de Edgar y Linington, en particular al Prof. Chris Linington, la Dra. Diana Arseni y la Dra. Katja Muecklisch, por sus consejos, comentarios útiles y asistencia para alimentar las culturas mientras establecemos estas culturas. Un agradecimiento especial al Dr. Muecklisch por proporcionar los puntos de partida para las tuberías de Cell Profiler. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad de EM (subvención 122) y la fundación Yuri y Lorna Chernajovsky a MP; Financiación de la Universidad de Glasgow a JC y MP; y Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) y Medical Research Council (MRV0109721) a GJG.

Materials

10x Trypsin Sigma T4549-100ML To digest tissue
140 mm TC Dish Fisher 11339283 Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon Sarstedt 62554502 To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle Henke Sass Wolf 4710012040 For trituration of sample
21 G needle BD 304432 For trituration of sample
23 G needle Henke Sass Wolf 4710006030 For trituration of sample
35 mm TC Dish Corning 430165 Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe Fisher 15869152 For trituration of sample
6 well plate Corning 3516 To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux Fisher DIS080010R To put brains intp
96 well plate Corning 3596 To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE Miltenyi 130-123-284 For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps Dumont 0108-5/45-PO For dissection
Biotin Sigma B4501 For DM+/-
Boric Acid Sigma B6768-500G For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 Biolegend 101825 For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 Biolegend 103139 For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 Biolegend 101243 For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V Sigma A3059-10G For SD Inhibitor
CNP Abcam AB6319 Mature oligodendrocytes
Coverslip VWR 631-0149 To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors Sigma S3146-1EA For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine Gibco 21969-035 For DM+/-, and for plating media
DNase I Thermofisher 18047019 For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I Sigma D4263 For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermofisher 65-0865-14 Live / Dead stain
Fine forceps Dumont 0102-SS135-PO For dissection
GFAP Invitrogen 13-0300 Astrocytes
HBSS w Ca Mg Sigma H9269-500ML For plating media
HBSS w/o Ca Mg Sigma H9394-500ML For brains to be added to
Horse Serum Gibco 26050-070 For plating media
Hydrocortisone Sigma H0396 For DM+/-
Iba1 Alpha-Laboratories 019-1971 Microglia
Insulin Sigma I1882 For DM+
Leibovitz L-15 GIbco 11415-049 For SD Inhibitor
MBP Bio-Rad MCA409S Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit BioTechne DY478-05 ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement Sigma N6530-5ML For DM+/-
Nestin Merck MAB353 Neuronal stem/progenitor cells
NeuN Thermofisher PA578499 Neuronal cell body
NG2 Sigma AB5320 Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC Miltenyi 130-119-155 For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep Sigma P0781-100ML For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide Sigma P1274 For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31 BioLegend 801601 Axons
Sodium Tetraborate Sigma 221732-100G For boric acid buffer
Trizol Thermofisher 15596026 For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T9003-100MG For SD Inhibitor

References

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Gamble, A., Suessmilch, M., Bonestroo, A., Merits, A., Graham, G. J., Cavanagh, J., Edgar, J. M., Pingen, M. Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity. J. Vis. Exp. (196), e65331, doi:10.3791/65331 (2023).

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