Summary
Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.
Abstract
Modelle des Zentralnervensystems (ZNS) müssen das komplexe Netzwerk miteinander verbundener Zellen rekapitulieren, das in vivo zu finden ist.Das ZNS besteht hauptsächlich aus Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia. Aufgrund der zunehmenden Bemühungen, den Einsatz von Tieren zu ersetzen und zu reduzieren, wurde eine Vielzahl von In-vitro-Zellkultursystemen entwickelt, um die Eigenschaften angeborener Zellen zu erforschen, die die Entwicklung von Therapeutika für ZNS-Infektionen und -Pathologien ermöglichen. Während bestimmte Forschungsfragen mit humanen Zellkultursystemen beantwortet werden können, wie z. B. (induzierte) pluripotente Stammzellen, hat die Arbeit mit menschlichen Zellen ihre eigenen Grenzen in Bezug auf Verfügbarkeit, Kosten und Ethik. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus embryonalen Mäusegehirnen. Die daraus resultierenden gemischten neuronalen Zellkulturen ahmen mehrere Zellpopulationen und Interaktionen nach, die im Gehirn in vivo zu finden sind. Im Vergleich zu aktuellen äquivalenten Methoden ahmt dieses Protokoll die Eigenschaften des Gehirns genauer nach und sammelt auch mehr Zellen, so dass mehr experimentelle Bedingungen an einer trächtigen Maus untersucht werden können. Darüber hinaus ist das Protokoll relativ einfach und sehr gut reproduzierbar. Diese Kulturen wurden für den Einsatz in verschiedenen Maßstäben optimiert, darunter 96-Well-basierte Hochdurchsatz-Screens, 24-Well-Mikroskopieanalysen und 6-Well-Kulturen für die Durchflusszytometrie und die Analyse der reversen Transkriptions-quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Diese Kulturmethode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Infektionen und Immunität im Zusammenhang mit einem Teil der Komplexität des ZNS mit der Bequemlichkeit von In-vitro-Methoden zu untersuchen.
Introduction
Die Verbesserung unseres Verständnisses des zentralen Nervensystems (ZNS) ist entscheidend, um die therapeutischen Optionen für viele neuroinflammatorische und neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern. Das ZNS, ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Zellen im Gehirn, Rückenmark und Sehnerven, besteht aus Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und ihren angeborenen Immunzellen, den Mikroglia1. Ein In-vitro-Ansatz kann die Anzahl der Mäuse, die für sinnvolle Forschung erforderlich sind, oft drastisch reduzieren. Die Komplexität des ZNS macht es jedoch unmöglich, die In-vivo-Situation mit Hilfe von Zelllinien zu rekapitulieren. Gemischte neuronale Zellkulturen stellen ein äußerst wertvolles Forschungswerkzeug dar, um neuro(immun)ologische Fragestellungen in einem relevanten Modell zu untersuchen, in Übereinstimmung mit den Prinzipien von Replacement, Reduction and Refinement (3R) 2,3.
Thomson et al. beschrieben eine Zellkulturmethode mit pränatalen Rückenmarkszellen, die sich in alle oben genannten Hauptzelltypen des ZNS differenzieren4. In diesem System gibt es auch Synapsenbildung, myelinisierte Axone und Ranvier-Knoten. Die Haupteinschränkung dieser Kultivierungsmethode besteht darin, dass das Rückenmark das Gehirn nicht sinnvoll modelliert und die Zellerträge ab dem 13. Embryotag (E13) das Rückenmark verengt. Dies schränkt die Anzahl der experimentellen Bedingungen ein, die untersucht werden können. Daher zielte diese Studie darauf ab, ein neues Zellkultursystem zu entwickeln, das die Eigenschaften des Gehirns mit erhöhter Zellausbeute rekapituliert, um die Anforderungen für Tiere zu reduzieren.
Ausgehend von Thomson et al. entwickelten wir ein Zellkulturmodell, das ausschließlich aus pränatalen Mäusegehirnen stammt. Diese Kulturen haben die gleichen Zellpopulationen, die gleiche Interkonnektivität und die gleichen Behandlungsmöglichkeiten wie die Rückenmarkskulturen, nur dass es im Vergleich weniger Myelinisierung gibt. Ein ZNS-In-vitro-Modell mit einer etwa dreimal höheren Zellausbeute ist jedoch effizienter, da weniger Mäuse und weniger Zeit für die Verarbeitung von Embryonen benötigt werden. Wir haben dieses einzigartige Kultursystem für mehrere nachgelagerte Anwendungen und Maßstäbe optimiert, einschließlich der Verwendung von Glasdeckgläsern für die Mikroskopieanalyse und verschiedener Größen von Kunststoff-Well-Platten, einschließlich 96-Well-Platten für die Hochdurchsatzforschung.
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Protocol
Alle Tierversuche entsprachen den lokalen Gesetzen und Richtlinien für die Verwendung von Tieren und wurden von der örtlichen Ethikkommission an der Universität Glasgow genehmigt. Die Tiere wurden unter bestimmten krankheitserregerfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit dem UK Animals Scientific Procedures Act 1986 unter der Schirmherrschaft einer Projektlizenz des britischen Innenministeriums untergebracht. Für diese Studie wurden selbst gezüchtete erwachsene C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Verwendung von jungen Weibchen (8-12 Wochen) wird aufgrund der höheren Erfolgsrate der Schwangerschaft empfohlen. Männchen können für mehrere Zuchtrunden wiederverwendet werden. Figur 1 stellt einen schematischen Überblick über das beschriebene Verfahren zur Erzeugung von gemischten neuronalen und glialen Kulturen dar.
1. Vorbereitung der Gewebekultur-Verbrauchsmaterialien
- Bereiten Sie die Platten und/oder Schalen mit Mikroskopie-Deckgläsern in einer Sicherheitswerkbank der Klasse 2 vor. Sterilisieren Sie alle Reagenzien oder Autoklaven, um die Sterilität während der Kulturperiode zu gewährleisten.
- Fügen Sie jedem Well das entsprechende Volumen BA-PLL (13,2 μg/ml Poly-L-Lysinhydrobromid [PLL] in Borsäurepuffer [BA] [50 mM Borsäure, 12,5 mM Natriumtetraborat, pH 8,5]; siehe Materialtabelle) hinzu (1.000 μl/Well in einer 6-Well-Platte, 100 μl/Well in einer 96-Well-Platte; Volumina sind in Tabelle 1 zusammengefasst). Geben Sie bei Deckgläsern für die Mikroskopie 20 ml BA-PLL in eine Gewebekulturschale mit einem Durchmesser von 9 cm, die 200 sterile Deckgläser enthält, und schwenken Sie sie, um sie gleichmäßig zu verteilen.
- Bei 37 °C 1-2 h inkubieren.
- Entfernen Sie die BA-PLL-Lösung aus jeder Vertiefung oder Schale, die Deckgläser für die Mikroskopie enthält, und waschen Sie sie, indem Sie 20 ml steriles Wasser hinzufügen, die Deckgläser schwenken und dann das Wasser entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Bei einer Schale mit Deckgläsern lassen Sie bei der letzten Wäsche steriles Wasser in der Gewebekulturschale, um die Deckgläser leicht zu entfernen.
- Mit einer sterilen Pipette so viel Flüssigkeit wie möglich entfernen und mindestens 2 h bis über Nacht trocknen lassen.
- Lagern Sie die beschichteten Platten bis zu 2 Monate bei 4 °C.
HINWEIS: Die hergestellte Borsäure mit Poly-L-Lysin (BA-PLL)-Lösung kann bis zu dreimal wiederverwendet werden, wobei jedes Mal neue PLL hinzugefügt wird. Lagern Sie die BA-PLL bei 4 °C. Das Geschirr wird mit BA-PLL behandelt, da die PLL es den Zellen ermöglicht, sich festzukleben und zu wachsen. Ohne diese Behandlung heben sich die Zellen nach ca. 1 Woche Kultur und können sich nicht mehr differenzieren.
2. Sektion von E17-Embryonalgehirnen
- Halte eine oder mehrere weibliche Mäuse zusammen mit einer männlichen Maus. Untersuchen Sie die Weibchen täglich auf einen Schleimpfropf, der anzeigt, dass die Paarung stattgefunden hat.
HINWEIS: Alle "gestopften" weiblichen Mäuse müssen von den männlichen getrennt werden, um das korrekte Startdatum der Trächtigkeit zu gewährleisten. Mäuse können gewogen werden, um die Trächtigkeit zu bestätigen, oder visuell überwacht werden. - Keulen Sie die trächtige Maus bei E17 mit geeigneten Methoden in Übereinstimmung mit den örtlichen Tierschutzrichtlinien und -gesetzen, z. B. durch Erhöhung der Kohlendioxidkonzentration (CO2), eine tödliche Überdosierung von Betäubungsmitteln oder eine Luxation des Halses.
HINWEIS: Die gewählte Methode darf die Embryonen nicht stören. Für diese Studie wurde die Exposition gegenüber einer steigenden Konzentration von Kohlendioxidgas und der anschließenden Bestätigung des Todes durch Durchtrennung der Oberschenkelarterie verwendet, um trächtige Muttertiere zu keulen. - Legen Sie die aussortierte, trächtige Maus auf den Rücken auf ein Sezierbrett. Es ist zwar nicht erforderlich, es festzunageln, aber es könnte es für unerfahrene Forscher einfacher machen. Drücken Sie die Mittellinie des Bauches mit einer Pinzette zusammen. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere den Bauch durch die Haut und das Bauchfell über der Mittellinie von den Genitalien bis zum Brustkorb auf, wobei Sie darauf achten, die Gebärmutter nicht zu punktieren.
- Die Gebärmutter der Maus hat zwei Hörner, die in der Regel jeweils ein bis fünf Embryonen enthalten. Entfernen Sie die Gebärmutter mit den Embryonen von der Mutter und legen Sie sie sofort auf Eis.
- Schneiden Sie den Dottersack an der Seite der Plazenta durch, achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu beschädigen, und nehmen Sie die Embryonen aus ihrem Dottersack.
- Enthaupten Sie die Embryonen sofort. Die enthaupteten Köpfe in eine Schüssel mit Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) ohne Calcium (Ca 2+) und Magnesium (Mg2+) (HBSS-/-) auf Eis geben.
HINWEIS: Wenn eine Genotypisierung erforderlich ist, kann der Schwanz in diesem Stadium für die genetische Analyse entfernt werden. Wenn mehrere Genotypen zu erwarten sind, sollten die Köpfe jedes Embryos für die Kultivierung separat aufbewahrt werden. - Positionieren Sie den Kopf mit einer abgewinkelten Pinzette auf der Seite nach links.
- Durchstechen Sie das Auge mit einer Kante der Pinzette und halten Sie mit der anderen das Kinn fest.
- Beginnen Sie im Nacken und reißen Sie die Haut der Kopfhaut sanft entlang der Mittellinie in Richtung Schnauzenspitze.
- Durch das Rückenmark eintretend, das als weißes Oval erkennbar ist, wird der Schädel mit der abgewinkelten Pinzette entlang der Mittellinie aufgebrochen und das Gehirn freigelegt.
- Ziehe den Schädel vorsichtig auf der Seite nach oben ab und lege das Gehirn frei.
- Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel und entsorgen Sie den Schädel, sobald das Gehirn vollständig entfernt wurde.
- Entfernen Sie mit der Pinzette die Hirnhäute, die sich als dünne Membran mit dichten Blutgefäßen bemerkbar machen.
- Legen Sie die Gehirne in ein Bijou (siehe Materialtabelle) mit 2 ml HBSS-/- auf Eis.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.6 bis 2.13 mit den restlichen Gehirnen, sodass Sie bis zu vier Gehirne pro Bijou addieren.
- Geben Sie 250 μl 10-faches Trypsin in das Bijou und verreiben Sie das Gehirn durch Schütteln des Bijous. 15 min bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Alle Schritte ab diesem Zeitpunkt sollten in einer sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt werden. - 2 ml Sojabohnen-Trypsin (SD)-Inhibitor (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen, 40 μg/ml DNase I, 3 mg/ml Rinderserumalbumin [BSA] Fraktion V; siehe Materialtabelle) von -20 °C bei 37 °C auftauen.
- Fügen Sie 2 ml SD-Hemmer zu jedem Bijou hinzu, das Gehirne enthält (pro Bijou mit bis zu vier Gehirnen), und schütteln Sie das Bijou erneut, um es gleichmäßig zu verteilen.
HINWEIS: SD-Inhibitor verringert die Trypsinaktivität, um eine unnötige Verdauung der Proben zu verhindern und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. - Entfernen Sie ohne Zentrifugation 2 ml des Überstands aus jedem Bijou und füllen Sie es in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei Sie darauf achten sollten, dass keine Zellklumpen übertragen werden.
- Verreiben Sie die verbleibenden Zellen im Bijou mit einer 19-G-Nadel, die an einer 5-ml-Spritze befestigt ist, indem Sie die Suspension zweimal absaugen. Dadurch entsteht eine dicke, schleimartige Mischung.
- Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal mit einer 21-G-Nadel. Wenn noch Klumpen vorhanden sind, reiben Sie noch einmal mit der 21 G-Nadel.
- Übertragen Sie die Zellen mit einer 23-g-Nadel aus dem Bijou in dasselbe 15-ml-Zentrifugenröhrchen (ab Schritt 2.18).
- Bei 200 x g bei Raumtemperatur (RT) 5 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den gesamten Überstand mit einer serologischen 5-ml-Pipette und überführen Sie ihn in ein weiteres 15-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass das lose Pellet am Boden, das die erforderlichen Zellen enthält, nicht gestört wird.
- Den Überstand erneut bei 200 x g RT für 5 min zentrifugieren.
HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht unbedingt erforderlich, aber wenn man viele Zellen benötigt oder nur wenige Embryonen hat, kann man diesen Schritt durchführen, um so viele Zellen wie möglich aus dem Überstand zu gewinnen. - Unter Verwendung von 10 ml Beschichtungsmedien (PM) (49 % Dulbeccos modifiziertes Adlermedium [DMEM], 1 % Penicillin/Streptomycin [Pen/Streptokokken], 25 % Pferdeserum, 25 % HBSS mit Ca 2+ und Mg2 + [HBSS+ /+]; siehe Materialtabelle) werden die beiden Pellets kombiniert und resuspendiert, um eine Ganzzellsuspension zu erzeugen.
- Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und entweder einem Hämozytometer oder einem digitalen Zellzähler und verdünnen Sie die Zellsuspension mit PM auf eine Konzentration von 1,8 x 106 Zellen/ml.
3. Plattierung der Zellen
- Fügen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension dem erforderlichen Format hinzu, wie in Tabelle 1 beschrieben: 1.000 μl pro Well im 6-Well-Format, 50 μl pro Well im 96-Well-Format oder 100 μl pro Deckglas.
- 2-4 h bei 37 °C mit 5%-7% CO2 inkubieren. Überprüfen Sie, ob die Zellen mit einem inversen Mikroskop haften.
- Entfernen Sie das Medium und füllen Sie es mit neuen Differenzierungsmedien (DM+: TM- einschließlich 10 μg/ml Insulin auf. DM-: DMEM, 1% Pen/Streptokokken, 50 nM Hydrocortison, 10 ng/ml Biotin, 2,5 ml 100x N1 Medienergänzung; siehe Materialtabelle). Die Volumina sind in Tabelle 1 aufgeführt. Drücken Sie alle schwimmenden Deckgläser mit einer sterilen Pipettenspitze nach unten.
4. Pflege der Kulturen
HINWEIS: Diese Kulturen müssen dreimal wöchentlich gefüttert werden, um ein optimales Wachstum und eine optimale Differenzierung zu unterstützen. Die Kulturen erreichen eine optimale Gesundheit und Reife für Experimente an DIV (Tage in vitro) 21. Die Zellen können bis zu 28 Tage in Kultur aufbewahrt werden, danach degenerieren die Kulturen schnell.
- Ersetzen Sie dreimal pro Woche bis DIV12 einen Teil des Überstandes durch frisches DM+, indem Sie 500 μl pro Well im 6-Well-Format, 50 μl pro Well im 96-Well-Format oder 500 μl pro Schale mit drei Deckgläsern entfernen und 600 μl pro Well im 6-Well-Format, 60 μl pro Well im 96-Well-Format hinzufügen. oder 600 μl pro Deckglasschale (Tabelle 1).
- Ersetzen Sie ab DIV13 dreimal pro Woche einen Teil des Überstandes durch frisches DM-, indem Sie 500 μl pro Well im 6-Well-Format, 50 μl pro Well im 96-Well-Format oder 500 μl pro Schale mit drei Deckgläsern entfernen und 600 μl pro Well im 6-Well-Format, 60 μl pro Well im 96-Well-Format hinzufügen. oder 600 μl pro Deckglasschale (Tabelle 1).
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Representative Results
Mikroskopie
Kulturen, die auf Glasdeckgläsern gezüchtet wurden, eignen sich ideal für die mikroskopische Analyse. Um die Entwicklung der Kulturen zu visualisieren, wurden die Deckgläser zu mehreren Zeitpunkten von DIV0 (nach dem Anhängen der Zellen) bis DIV28 in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Die Kulturen wurden für die Immunfluoreszenzbildgebung wie zuvor beschrieben5 mit drei verschiedenen Färbekombinationen gefärbt: NG2 (unreife Oligodendrozyten) und Nestin (neuronale Stamm-/Vorläuferzellen) als Entwicklungsmarker, SMI31 (Axone), MBP (Myelin) und NeuN (Neuronenzellkörper) als neuronale Marker oder CNP (Oligodendrozyten), GFAP (Astrozyten) und Iba1 (Mikroglia) als Gliamarker (Abbildung 2).
Die verschiedenen Zelltypen wurden mit Hilfe von CellProfiler-Pipelines (basierend auf ′,6-Diamidino-2-phenylindol-positiv (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1) quantifiziert. Jeder einzelne Datenpunkt wurde aus durchschnittlich 10 Bildern generiert, die von drei Deckgläsern pro Zeitpunkt aufgenommen wurden. Für Mikroglia, Neuronen und Oligodendrozyten wurde der prozentuale Anteil des Zelltyps pro 4′,6-Diamidino-2-phenylindol-positiver (DAPI+) Zelle berechnet. Für die Quantifizierung der Anzahl der Astrozyten wurde anstelle der Anzahl der Zellen das prozentuale Sichtfeld verwendet. Dies war auf Schwierigkeiten bei der Unterscheidung der einzelnen Zellen zurückzuführen, da sie sich häufig überlappten (Abbildung 2M,N). Die Kulturen erreichten bei DIV21 ihre höchste Reife und Zelldichte, woraufhin die Kulturen zu zersetzen begannen (Abbildung 2N).
Wichtig ist, dass diese Kulturen leicht mit Medikamenten, wie z. B. potenziellen Therapeutika, behandelt oder zur Rückverfolgung von In-vitro-Infektionen verwendet werden können. In diesem Beispiel wurden Kulturen auf Deckgläsern auf eine 24-Well-Platte übertragen und mit dem hochneurotropen Virus Semliki Forest Virus (SFV) (Stamm SFV6)6 infiziert, das zsGreen in infizierten Zellen exprimiert. Eine Vielzahl von Infektionen (MOI – die Anzahl der pro Zelle hinzugefügten Viruspartikel) von 0,05, titriert auf Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK), wurde verwendet, um eine Infektion auf niedrigem Niveau zu gewährleisten. 0-72 h nach der Infektion (hpi) wurden die Kulturen in 4% PFA fixiert und für die Analyse mittels Immunfluoreszenzbildgebung gefärbt. Abbildung 3 zeigt, dass SFV im Einklang mit einer In-vivo-Infektion hauptsächlich Oligodendrozyten und Neuronen infiziert6.
qRT-PCR
Neben der Mikroskopie können diese ZNS-Kulturen auch für die Analyse mit molekularen Methoden, wie z. B. RT-qPCR, von mRNA-Reaktionen auf eine Behandlung verwendet werden. Um die angeborene antivirale Reaktion weiter zu untersuchen, wurden 6-Well-Plattenkulturen 24 h lang mit einer Reihe von Dosen des potenten antiviralen Zytokins Interferon beta (IFN-β) behandelt. Die Kulturen wurden mit Guanidiumthiocyanat/Phenol lysiert, und die RNA wurde isoliert, in cDNA umgewandelt und mittels qPCR analysiert, wie zuvor beschrieben7. Mit dieser Methode kann die differentielle Expression vieler Gene gemessen werden. In dieser Arbeit wurde die Hochregulation von Ccl5 gegen das Housekeeping-Gen 18s quantifiziert. CCL5 ist ein chemotaktisches Zytokin (Chemokin), das an der Entzündungsreaktion beteiligt ist. Die Behandlung mit IFN-β führte zu einer Hochregulation der Ccl5-mRNA in den Kulturen (Abbildung 4A).
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Das 96-Well-Format von Kulturen ist ein hervorragendes Werkzeug für Hochdurchsatz-Screenings von Behandlungen. Um zu untersuchen, ob die Hochregulation der Ccl5-mRNA zur Expression des CCL5-Proteins führt, wurde CCL5 im Überstand der Kulturen gemäß den Herstellerangaben mittels ELISA gemessen (siehe Materialtabelle). In diesem Beispiel wurden 96-Well-Kulturen doppelt mit 27 inkrementellen Dosen von IFN-β behandelt, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erzeugen (Abbildung 4B). Im Einklang mit der erhöhten mRNA-Expression (Abbildung 4A) kam es zu einem Anstieg des im Überstand freigesetzten CCL5. Wie erwartet, zeigt Abbildung 4C eine klare Korrelation zwischen mRNA und Proteinexpression.
Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur gleichzeitigen Untersuchung der Expression vieler intra- und/oder extrazellulärer Marker. Die Analyse komplexer, hochgradig interaktiver Kulturen mittels Durchflusszytometrie kann jedoch aufgrund von Zellschädigung und Zelltod eine Herausforderung darstellen, wenn Zellen zur Verarbeitung und Analyse aus der Kultur in eine Einzelzellsuspension überführt werden. Durch den Vergleich einer Vielzahl von Protokollen mit 0,05%-0,5% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1x-10x Trypsin ohne EDTA und schonendem Dissoziationsreagenz wurde festgestellt, dass nach der Behandlung der 6-Well-Plattenkulturen mit 0,05% Trypsin-EDTA für 10 min bei 37 °C mit sanfter Rührung die Zellen mit sanfter Verreibung angehoben wurden, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Insbesondere bei der durchflusszytometrischen Analyse von ZNS-Zellen ist es wichtig, bei der Zellvorbereitung schonend vorzugehen, Waschschritte zu minimieren und sehr darauf zu achten, die Zellen immer bei 4 °C oder auf Eis zu halten.
Um die Viabilität und die Zelltypen in dieser Einzelzellsuspension zu beurteilen, wurden die Zellen mit einem Viabilitätsfarbstoff gefärbt und fluoreszenzmarkierte Antikörper gegen CD45, CD11b, O4, ACSA-2 und CD24 hergestellt, um eine Visualisierung jeder einzelnen Zellpopulation in den Kulturen zuermöglichen 8 (Abbildung 5). Mit dieser Methode wurde eine Zellviabilität von etwa 70 % erreicht, was durchschnittlich etwa 2 x 10 6 lebensfähigen Einzelzellen pro 6-Well-Platte entspricht (Abbildung 5C). In Übereinstimmung mit den Mikroskopieergebnissen (Abbildung 2N) gab es eine große Anzahl von Mikroglia, Neuronen und Astrozyten, während Oligodendrozyten am wenigsten häufig vorkamen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des beschriebenen Verfahrens zur Erzeugung gemischter neuronaler und glialer Kulturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: E17-ZNS-Kulturen, gefärbt für Immunfluoreszenz-Bildgebungszellmarker im Zeitverlauf. Die Zellen wurden mit 4% PFA fixiert, bevor sie permeabilisiert und gefärbt wurden, um verschiedene Populationen sichtbar zu machen. Repräsentative Bilder der (A,D,G,J,M) Entwicklungsmarker NG2 (Oligodendrozyten-Vorläuferzellen) und Nestin (neuronale und gliale Vorläuferzellen), (B,E,H,K,N) neuronale Marker SMI31 (Axone), MBP (Myelin) und NeuN (Neuronenzellkörper) und (C,F,I,L,O) gliale Marker CNP (Oligodendrozyten), GFAP (Astrozyten) und Iba1 (Mikroglia). Maßstabsbalken = 50 μm. (P) Anzahl der DAPI pro mm2, n = 3, jeweils n aus technischen Triplikaten von 10 Bildern pro Triplikat. (Q) Zellzahl als Prozentsatz der DAPI+-Zellen (Mikroglia, Oligodendrozyten und Neuronen) und Prozentsatz des Sichtfeldes (Astrozyten), n = 3, jeweils n aus technischen Triplikaten von 10 Bildern pro Triplikat. Fehlerbalken sind ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Infektion mit dem Semliki-Waldvirus (SFV) von E17-ZNS-Kulturen im Zeitverlauf. Repräsentative Bilder von nicht infizierten Kontrollkulturen (A,C,E,G) und Kulturen, die mit 0,05 MOI SFV (B,D,F,H) infiziert sind. Die Zellen wurden für 0-48 h infiziert und mit CNP (Oligodendrozyten-Marker) und NeuN (Neuronen-Marker) (A-D) oder GFAP (Astrozyten-Marker) und Iba1 (Mikroglia-Marker) (E-H) gefärbt. Weiße Pfeile weisen auf eine infizierte Zelle hin. Dieser SFV-Stamm exprimiert das grün fluoreszierende Protein zsGreen, um die Rückverfolgung von Virusinfektionen zu ermöglichen. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: CCL5-mRNA und Proteinexpression von E17-ZNS-Kulturen nach IFN-β-Behandlung. Die Zellen wurden 24 h lang im 6-Well-Plattenformat (mRNA) oder 96-Well-Plattenformat (Protein) mit einer Reihe von Dosen von IFN-β behandelt. (A) Expression von Ccl5 mRNA nach Behandlung mit 0-100 ng/ml IFN-β, biologisch n = 2, jeweils aus technischen Triplikaten. (B) CCL5-Konzentration im Überstand nach 0-100 ng/ml IFNβ-Behandlung, biologisch n = 1, entnommen aus technischen Triplikaten. (C) Zelluläre mRNA-Ccl5-Hochregulation im Vergleich zur CCL5-Proteinkonzentration im Überstand mit logarithmischer Trendlinie. Fehlerbalken sind ± REM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Durchflusszytometrie-Gating-Strategie zur Generierung von Einzelzellpopulationen aus E17-ZNS-Kulturen. Die Zellen wurden mit 0,05 % Trypsin-EDTA dissoziiert, mit geeigneten Antikörpern gefärbt und in einzelne Zellpopulationen sortiert. (A-C) Gating-Strategie zum Sortieren nach lebenden, einzelnen Zellen. (D) Strategie zur Selektion von Mikroglia (CD45+, CD11b+). (E) Strategie zur Selektion von Oligodendrozyten (CD45-CD11b-O4+). (F) Strategie zur Sortierung nach Astrozyten (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+, CD24+) und Neuronen (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) Einzelne Zellpopulationen, die übereinander liegen und diskrete Populationen zeigen. (H) Einzelne Zelltypen als Prozentsatz der insgesamt sortierten Zellen, n = 4. Fehlerbalken sind ± REM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Erforderliches Format | BA-PLL/Brunnen | Wasser zum Waschen | Volumenzellen in Beschichtungsmedien (PM) zum Ausplattieren | Medien aufladen | Entfernen/Hinzufügen bei der Fütterung von Kulturen (3x/Woche) |
| 6-Well-Format (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL Medien |
| +600 μL TS+ | +600 μL TM+/- | ||||
| 96 Well-Format (0,32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL TS+ | -50 μL Medien |
| +60 μL TM+/- | |||||
| Deckglas im Schalenformat | 20 ml pro 200 Deckgläser | 20 ml | 100 μL pro Deckglas | +600 μL TS+ | -500 μL Medien |
| +300 μL PM | +600 μL TM+/- |
Tabelle 1: Erforderliche Volumina für die Herstellung von beschichteten Gewebekulturkunststoffen.
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Discussion
Das ZNS ist ein komplexes Netzwerk, das sich vom Gehirn bis zum Rückenmark erstreckt und aus vielen Zelltypen besteht, vor allem Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia1. Da jede Zelle eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Erzeugung angemessener Reaktionen auf Herausforderungen im ZNSspielt 9,10,11, ist ein Kultursystem, das all diese Zelltypen enthält, ein nützliches und vielseitiges Werkzeug, um zu untersuchen, wie das Gehirn auf einen Reiz reagieren könnte. Die Möglichkeit, diese Zellen und ihre Interaktionen in einem In-vitro-Kontext zu untersuchen, bedeutet, dass eine Vielzahl von Techniken eingesetzt werden kann, um verschiedene experimentelle Fragestellungen einfach zu untersuchen. Wir haben eine schnelle und effiziente Methode beschrieben, um die wichtigsten ZNS-Zelltypen aus dem pränatalen Gehirn zu gewinnen und zu kultivieren, die einzelne Zellpopulationen im Gehirn der erwachsenen Maus nachahmen können12.
Bisher etablierte Protokolle zur Erzeugung von ZNS-Kulturen verwenden E13.5-Rückenmark 4,5. Neben einem geeigneten Modell für das Rückenmark ist es von großer Bedeutung, ein Modell zu haben, das das Gehirn rekapituliert. Daher wurden die Gehirne dieser E13.5-Mäuse ursprünglich verwendet, um die hier beschriebenen ZNS-Kulturen mit dem gleichen Protokoll zu erzeugen. Nach DIV14 begannen die Zellen jedoch, große Aggregate mit dicht gepackten neuronalen Zellkörpern zu bilden. Obwohl Astrozyten vorhanden waren, ist nicht klar, ob sie gleichmäßig verteilt waren. Es ist unklar, ob die Zellen im Zentrum dieser Zellkörper ausreichend Nährstoffe und Sauerstoff aus dem Nährmedium erhalten würden, wie es die Zellen außerhalb tun würden. Bei Sauerstoff- und Nährstoffmangel neigen Neuronen dazu, Apoptose zu durchlaufen und Stresssignale an Gliazellen freizusetzen13, was zu einem proinflammatorischen Phänotypführen kann 14. Es wurde angenommen, dass die Neurogenese eine wahrscheinliche Ursache für diese dicht gepackten Aggregate ist, und diese Phase klingt bei E17ab 15. Wenn Gehirne von E17-Mausembryonen verwendet wurden, bildeten die Zellen immer noch Netzwerke, gruppierten sich aber nicht zu den großen Aggregaten, die in E13.5 zu sehen sind, und wurden daher als geeigneteres Alter für die Gehirnkulturen angesehen, aus denen sie erzeugt werden konnten.
Die derzeitige Technik führt auch zu einer größeren Anzahl von Zellen, die aus einer Schwangerschaft gewonnen werden (durchschnittlich 1 x 107 Zellen/Gehirn im Vergleich zu 3-4 x 106 Zellen/Rückenmark)7. Für eine durchschnittlich trächtige Maus mit 8-10 Embryonen entspricht dies bis zu 54 verschiedenen Versuchsbedingungen im 6-Well-Plattenformat oder 150 experimentellen Bedingungen für die Mikroskopie (im Vergleich zu 19 bzw. 64 aus dem Rückenmark). Daher sind diese ZNS-Kulturen ein großartiges Werkzeug, um die erforderliche Anzahl von Mäusenzu reduzieren 16. Insbesondere kann das 96-Well-Format problemlos für Hochdurchsatz-Assays verwendet werden, z. B. für das Screening von Arzneimittelkandidaten vor Tierversuchen, wodurch die Anzahl der für solche Studien erforderlichen Tiere erheblich reduziert wird. Dies wird hoffentlich die niedrige Erfolgsrate bei der Erprobung von ZNS-Medikamenten an Tieren verbessern und die Translation in klinische Studien am Menschen verbessern17,18.
Die Kulturen erreichen ihren Höhepunkt bei DIV21. Die Zellzahl steigt bis zu diesem Zeitpunkt, danach beginnen die Zellen mit abnehmender Anzahl der einzelnen Zelltypen zu degenerieren. Dies wurde sowohl anhand der quantifizierten Zellzahlen (Abbildung 2N) als auch anhand der Anzahl der pyknotischen Kerne (dichte DAPI-Färbungen) (Abbildung 2M) gemessen. Während die Entwicklungsmarker Nestin und NG2 immer noch auf DIV14 (Abbildung 2G) und DIV21 (Abbildung 2J) exprimiert werden, ist dies darauf zurückzuführen, dass einige der Astrozyten eine Astrogliose durchlaufen, die Nestin19 hochreguliert, während einige der Oligodendrozyten noch nicht vollständig ausgereift sind und daher noch etwas NG220 exprimieren. Basierend auf der mikroskopischen Validierung exprimiert nur noch ein kleiner Teil der Zellen Entwicklungsmarker im Vergleich zu den voll ausgereiften Zellen von DIV21 (Abbildung 2I,L); Daher sind die Kulturen zu diesem Zeitpunkt weitgehend ausgereift. Bemerkenswert ist, dass die Dichte der Mikroglia in vivo im murinen ZNS sehr variabel ist. Der Gehalt an Mikroglia, wie er durch die Expression von Iba1 mittels Mikroskopie definiert wird, liegt in unseren Kulturen am oberen Ende dieser Dichte12. Der hohe Prozentsatz an Mikroglia, die das Durchflusszytometrieverfahren überleben, ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass Mikroglia robuster sind als andere ZNS-Zellen, die im Allgemeinen zarte Fortsätze aufweisen und daher bei der Vorbereitung der Durchflusszytometrie eher beschädigt werden.
Nach der Präparation dauert es nur 3 Wochen, bis die Zellen experimentierreif sind, was kürzer ist als bei den meisten humanbasierten In-vitro-Methoden, wie z. B. Organoiden oder induzierten pluripotenten Stammzellmodellen21. Solange In-vivo-Forschung erforderlich ist, um die Sicherheit neuer Therapeutika zu gewährleisten, wird die Verwendung von In-vitro-Zellkultivierungsmethoden wie der unseren dazu beitragen, Toxizität und Wirksamkeit vor Tierversuchen effizient zu testen, wodurch der Bedarf an Tieren verringert und die Translation der Forschung von In-vitro zu In-vivo verbessert wird. Es bleibt zu hoffen, dass dies letztendlich auch zu einer effizienteren Translation in klinische Studien am Menschen führen wird. Letztendlich wurden diese Kulturen geschaffen, um die Erforschung des ZNS zu ermöglichen. Während In-vitro-Systeme die Komplexität des ZNS nicht vollständig abbilden können, stellen primäre Zellkulturen die ZNS-Eigenschaften in vivo genauer dar22,23. In-vitro-Ansätze können einen reduktiveren Ansatz zur Untersuchung des ZNS in Abwesenheit von infiltrierenden Immunzellen24 und der Integrität der Blut-Hirn-Schranke25 ermöglichen. Das Entfernen dieser Komplexitätsebene kann es einfacher machen, Mechanismen zu entwirren. Daher ist das gegenwärtige Kultivierungssystem ein nützliches Werkzeug zur Beantwortung von Forschungsfragen, die die In-vivo-Tierforschung ergänzen.
Die Fähigkeit, ZNS-Zellen zu ernten, zu isolieren und zu kultivieren, hat unser Verständnis des angeborenen ZNS16 bereits erheblich verbessert. Dieser Artikel demonstriert die Sektion von E17-Mäusegehirnen und die daraus resultierende Verreibung und Kultivierung der Zellen, um ein Zellkultursystem zu erzeugen, das alle wichtigen Zelltypen des ZNS enthält. Bei diesen Kulturen wurden mehrere molekulare Techniken eingesetzt, die die Wirksamkeit dieser Kulturen bei der Untersuchung des ZNS zeigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern des Edgar- und Linington-Labors, insbesondere Prof. Chris Linington, Dr. Diana Arseni und Dr. Katja Muecklisch, für ihre Ratschläge, hilfreichen Kommentare und Unterstützung bei der Ernährung der Kulturen während des Aufbaus dieser Kulturen. Besonderer Dank geht an Herrn Dr. Muecklisch, der die Ausgangspunkte für die Cell Profiler-Pipelines zur Verfügung gestellt hat. Diese Arbeit wurde von der MS-Gesellschaft (Stipendium 122) und der Yuri und Lorna Chernajovsky-Stiftung unterstützt. Finanzierung der Universität Glasgow für JC und MP; und Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) und Medical Research Council (MRV0109721) an GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
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