Summary
이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.
Abstract
중추신경계(CNS)의 모델은 생체 내에서 발견되는 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크를 요약해야 합니다.중추신경계는 주로 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포로 구성됩니다. 동물 사용을 대체하고 줄이기 위한 노력이 증가함에 따라 선천성 세포 특성을 탐색하기 위해 다양한 시험관 내 세포 배양 시스템이 개발되어 CNS 감염 및 병리에 대한 치료제를 개발할 수 있습니다. 특정 연구 질문은 (유도된) 만능 줄기 세포와 같은 인간 기반 세포 배양 시스템으로 해결할 수 있지만 인간 세포로 작업하는 것은 가용성, 비용 및 윤리와 관련하여 고유한 한계가 있습니다. 여기에서는 배아 마우스 뇌에서 세포를 분리하고 배양하기 위한 고유한 프로토콜을 설명합니다. 그 결과 혼합 신경 세포 배양은 생체 내 뇌에서 발견되는 여러 세포 집단과 상호 작용을 모방합니다. 현재의 동등한 방법과 비교할 때, 이 프로토콜은 뇌의 특성을 더 밀접하게 모방하고 더 많은 세포를 확보하므로 임신한 마우스 한 마리에서 더 많은 실험 조건을 조사할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 비교적 쉽고 재현성이 높습니다. 이러한 배양은 96웰 기반 고처리량 스크리닝, 24웰 현미경 분석, 유세포 분석 및 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석을 위한 6웰 배양을 포함하여 다양한 규모로 사용하도록 최적화되었습니다. 이 배양 방법은 시험관 내 방법의 편리함과 함께 CNS의 일부 복잡성의 맥락에서 감염 및 면역을 조사하는 강력한 도구입니다.
Introduction
중추신경계(CNS)에 대한 이해를 높이는 것은 많은 신경염증 및 신경퇴행성 질환에 대한 치료 옵션을 개선하는 데 중요합니다. 뇌, 척수, 시신경 내에서 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크인 CNS는 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 이들의 선천성 면역 세포인 미세아교세포로 구성됩니다1. 체외 접근법은 종종 의미있는 연구를 수행하는 데 필요한 마우스의 수를 크게 줄일 수 있습니다. 그러나 CNS의 복잡한 특성으로 인해 세포주를 사용하여 생체 내 상황을 요약하는 것은 불가능합니다. 혼합 신경 세포 배양은 3Rs(Replacement, Reduction and Refinement) 원칙 2,3에 따라 관련 모델에서 신경(면역학) 문제를 조사하는 데 매우 유용한 연구 도구를 제공합니다.
Thomson et al.은 앞서 언급한 모든 주요 CNS 세포 유형으로 분화하는 태아기 척수 세포를 이용한 세포 배양 방법을 설명했다4. 이 시스템은 또한 시냅스 형성, 수초 축삭 및 Ranvier의 노드를 가지고 있습니다. 이 배양 방법의 주요 한계는 척수이기 때문에 뇌를 유용하게 모델링하지 못하고 배아 13일(E13) 척수로부터의 세포 수율이 수축한다는 것입니다. 따라서 조사할 수 있는 실험 조건의 수가 제한됩니다. 따라서 본 연구는 동물에 대한 요구량을 줄이기 위해 세포 수율이 증가한 뇌의 특성을 재현하는 새로운 세포 배양 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다.
Thomson et al. 출발점으로 우리는 순전히 태아기 쥐의 뇌에서 파생된 세포 배양 모델을 개발했습니다. 이러한 배양은 척수 배양과 동일한 세포 집단, 상호 연결성 및 치료 옵션을 가지고 있지만 비교에 의한 수초화가 적습니다. 그러나 세포 수율이 약 3배 더 높은 CNS in vitro 모델을 갖는 것이 더 효율적이며, 더 적은 수의 마우스와 더 적은 배아 처리 시간을 필요로 합니다. 당사는 현미경 분석을 위한 유리 커버슬립과 고처리량 연구를 위한 96웰 플레이트를 포함한 다양한 크기의 플라스틱 웰 플레이트를 사용하는 등 여러 다운스트림 응용 분야 및 스케일에 맞게 이 고유한 배양 시스템을 최적화했습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 동물 사용에 대한 현지 법률 및 지침을 준수했으며 글래스고 대학의 지역 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 동물은 영국 내무부 프로젝트 라이센스의 후원하에 1986년 영국 동물 과학 절차법에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육되었습니다. 이 연구에서는 사내에서 사육된 성인 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 젊은 여성 (8-12 주)의 사용은 임신 성공률이 높기 때문에 권장됩니다. 수컷은 여러 차례의 번식에 재사용 할 수 있습니다. 그림 1 은 혼합된 뉴런 및 신경교 배양을 생성하는 설명된 방법의 개략도를 나타냅니다.
1. 조직 배양 소모품의 제조
- Class 2 안전 캐비닛 내부에 현미경 커버슬립이 들어 있는 접시 및/또는 접시를 준비합니다. 배양 기간 동안 무균 상태를 보장하기 위해 모든 시약 또는 오토클레이브를 멸균하십시오.
- 적절한 부피의 BA-PLL(붕산 완충액[BA][50mM 붕산, 12.5mM 사붕산나트륨, pH 8.5] 중 13.2μg/mL 폴리-L-라이신하이드로브로마이드[PLL])을 각 웰(6웰 플레이트에서 1,000μL/웰, 96웰 플레이트에서 100μL/웰, 부피는 표 1에 요약됨)에 추가합니다. 현미경 커버슬립의 경우 200개의 멸균 커버슬립이 들어 있는 직경 9cm의 조직 배양 접시에 20mL의 BA-PLL을 넣고 소용돌이쳐 고르게 분포시킵니다.
- 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
- 현미경 커버슬립이 들어 있는 각 웰 또는 접시에서 BA-PLL 용액을 제거하고 멸균수 20mL를 추가하고 커버슬립을 휘젓고 물을 제거하여 세척합니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하십시오. 커버슬립이 포함된 접시의 경우 최종 세척 시 조직 배양 접시에 멸균수를 남겨두어 커버슬립을 쉽게 제거할 수 있습니다.
- 멸균 피펫으로 가능한 한 많은 액체를 제거하고 최소 2시간에서 하룻밤 동안 건조시키십시오.
- 코팅된 플레이트를 4°C에서 최대 2개월 동안 보관합니다.
참고: 폴리-l-라이신(BA-PLL) 용액으로 준비된 붕산은 매번 새로운 PLL을 추가하여 최대 3회까지 재사용할 수 있습니다. BA-PLL을 4°C에서 보관하십시오. PLL은 세포가 달라붙어 성장할 수 있도록 하기 때문에 접시는 BA-PLL로 처리됩니다. 이 처리가 없으면 약 1주일의 배양 후에 세포가 들어 올려져 더 이상 분화할 수 없습니다.
2. E17 배아 뇌의 해부
- 한 마리 또는 여러 마리의 암컷 마우스와 수컷 마우스를 함께 수용합니다. 암컷에게 매일 점액 마개가 있는지 확인하여 짝짓기가 이루어 졌음을 나타냅니다.
참고: 모든 "연결된" 암컷 마우스는 정확한 임신 시작 날짜를 보장하기 위해 수컷과 분리되어야 합니다. 임신을 확인하기 위해 마우스의 무게를 측정하거나 육안으로 모니터링 할 수 있습니다. - 예를 들어 이산화탄소(CO2) 농도 상승, 치명적인 마취 과다 복용 또는 목 탈구와 같은 지역 동물 복지 지침 및 법률에 따라 적절한 방법을 사용하여 E17에서 임신한 마우스를 도태합니다.
참고: 선택한 방법은 배아를 방해해서는 안 됩니다. 이 연구에서는 이산화탄소 가스 농도 상승에 노출된 후 대퇴 동맥을 절단하여 사망을 확인하는 방법을 사용하여 임신한 댐을 도태했습니다. - 도태된 임신한 마우스를 해부 보드에 등에 올려 놓습니다. 고정할 필요는 없지만 경험이 없는 연구원이 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 집게를 사용하여 복부의 정중선을 꼬집습니다. 날카로운 가위를 사용하여 자궁에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하면서 생식기에서 흉곽까지 정중선을 통해 피부와 복막을 통해 복부를 잘라냅니다.
- 쥐의 자궁에는 두 개의 뿔이 있으며, 각 뿔에는 일반적으로 1-5개의 배아가 들어 있습니다. 어머니에게서 배아가 들어있는 자궁을 제거하고 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오.
- 태반 측면의 난황 자루를 자르고 배아가 손상되지 않도록 주의하고 난황 자루에서 배아를 제거합니다.
- 즉시 배아를 참수하십시오. 목이 잘린 머리를 얼음 위에 칼슘(Ca 2+)과 마그네슘(Mg2+)(HBSS-/-)이 없는 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)과 함께 접시에 넣습니다.
참고: 유전자형 분석이 필요한 경우 유전자 분석을 위해 이 단계에서 꼬리를 제거할 수 있습니다. 여러 유전자형이 예상되는 경우 각 배아의 머리를 별도로 보관하여 배양해야 합니다. - 각진 집게를 사용하여 머리를 왼쪽을 향하도록 옆으로 눕힙니다.
- 집게의 한쪽 가장자리로 눈을 뚫고 다른 쪽 턱을 단단히 잡습니다.
- 목덜미에서 시작하여 끝을 향해 정중선을 따라 두피의 피부를 부드럽게 찢습니다.
- 흰색 타원형으로 눈에 띄는 척수를 통해 들어가면 각진 집게를 사용하여 정중선을 따라 두개골을 부수고 뇌를 노출시킵니다.
- 두개골을 위쪽을 향한 쪽에서 부드럽게 떼어내어 뇌를 노출시킵니다.
- 두개골에서 뇌를 들어 올려 뇌가 완전히 제거되면 두개골을 처리합니다.
- 집게를 사용하여 조밀 한 혈관을 가진 얇은 막으로 눈에 띄는 수막을 제거하십시오.
- 얼음 위에 2mL의 HBSS-/-가 들어 있는 비쥬( 재료 표 참조)에 뇌를 넣습니다.
- 나머지 브레인에 대해 2.6-2.13단계를 반복하여 비쥬당 최대 4개의 브레인을 추가합니다.
- 비쥬에 250 μL의 10x 트립신을 넣고 비쥬를 흔들어 뇌를 분쇄합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
알림: 이 시점부터 모든 단계는 멸균 조직 배양 후드에서 수행해야 합니다. - 2mL의 대두 트립신(SD) 억제제(Leibovitz L-15, 대두에서 0.52mg/mL 트립신 억제제, 40μg/mL DNase I, 3mg/mL 소 혈청 알부민[BSA] 분획 V, 표 참조)를 37°C에 두어 -20°C에서 해동합니다.
- 뇌가 포함된 각 비쥬(최대 4개의 브레인을 포함하는 비쥬당)에 SD 억제제 2mL를 넣고 비쥬를 다시 흔들어 고르게 분산시킵니다.
참고: SD 억제제는 트립신 활성을 감소시켜 샘플의 불필요한 소화를 방지하고 세포 생존율을 보존합니다. - 원심분리하지 않고 각 비석에서 상층액 2mL를 제거하고 세포 덩어리가 옮겨지지 않도록 주의하면서 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 현탁액을 두 번 흡인하여 5mL 주사기에 부착된 19G 바늘로 비석에 남아 있는 세포를 분쇄합니다. 이것은 두꺼운 점액과 같은 혼합물을 생성합니다.
- 21G 바늘을 사용하여 두 번 더 반복하십시오. 덩어리가 남아 있으면 21G 바늘로 한 번 더 분쇄합니다.
- 23G 바늘을 사용하여 비쥬에서 동일한 15mL 원심분리 튜브(단계 2.18부터)로 세포를 옮깁니다.
- 실온(RT)에서 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 모든 상층액을 제거하고 필요한 세포가 들어 있는 바닥의 느슨한 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 다른 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 상층액을 RT에서 200 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
참고: 이 단계는 필수는 아니지만 많은 세포가 필요하거나 배아가 적은 경우 이 단계를 수행하여 상청액에서 가능한 한 많은 세포를 복구할 수 있습니다. - 10mL의 도금 배지(PM)(49% Dulbecco's modified eagle medium[DMEM], 1% 페니실린/스트렙토마이신[Pen/Strep], 25% 말 혈청, 25% HBSS with Ca 2+ 및 Mg2 +[HBSS+ /+]; 재료 표 참조), 두 펠릿을 함께 결합하고 재현탁하여 전체 세포 현탁액을 만듭니다.
- 트립판 블루와 혈구계 또는 디지털 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세고 PM으로 세포 현탁액을 1.8 x 106 cells/mL의 농도로 희석합니다.
3. 셀 도금
- 표 1에 자세히 설명된 대로 필요한 부피의 세포 현탁액을 필요한 형식에 추가합니다: 6웰 형식의 경우 웰당 1,000μL, 96웰 형식의 경우 웰당 50μL 또는 커버슬립당 100μL.
- 37°C에서 5%-7%CO2로 2-4시간 동안 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 세포가 부착되었는지 확인하십시오.
- 배지를 제거하고 새로운 분화 배지(DM+: 10μg/mL 인슐린을 포함한 DM-)로 보충합니다. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50nM 하이드로코르티손, 10ng/mL 비오틴, 2.5mL 100x N1 배지 보충제; 재료 표 참조). 볼륨은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 떠 있는 커버슬립을 누릅니다.
4. 문화 유지
참고: 이러한 배양은 최적의 성장과 분화를 지원하기 위해 매주 세 번 먹이를 주어야 합니다. 배양은 DIV (days in vitro) 실험을 위한 최적의 건강 및 성숙도에 도달할 것이다 21. 세포는 최대 28 일 동안 배양 할 수 있으며, 그 후에 배양 물은 빠르게 퇴화됩니다.
- DIV12까지 주 3회, 6웰 형식의 경우 웰당 500μL, 96웰 형식의 경우 웰당 50μL 또는 3개의 커버슬립이 포함된 접시당 500μL를 제거하고 6웰 형식의 경우 웰당 600μL, 96웰 형식의 경우 웰당 60μL를 추가하여 상층액의 일부를 신선한 DM+로 교체하고, 또는 커버슬립 접시당 600μL(표 1).
- DIV13부터 주당 3회, 6-웰 형식에서 웰당 500 μL, 96-웰 형식에서 웰당 50 μL, 또는 3개의 커버슬립을 포함하는 디쉬당 500 μL를 제거하고, 6-웰 형식에서 웰당 600 μL, 96-웰 형식에서 웰당 60 μL을 추가하여, 상청액의 일부를 신선한 DM-으로 교체하고, 또는 커버슬립 접시당 600μL(표 1).
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Representative Results
현미경 검사 법
유리 커버슬립에서 자란 배양액은 현미경으로 분석하는 데 이상적입니다. 배양의 발달을 시각화하기 위해 커버슬립을 DIV0(세포가 부착된 후)부터 DIV28까지 여러 시점에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정했습니다. 배양물은 앞서 설명한5 와 같이 신경교 마커로서 NG2(미성숙 희소돌기아교세포) 및 네스틴(신경줄기/전구 세포), 신경 표지자로서 SMI31(축삭), MBP(미엘린) 및 NeuN(뉴런 세포체) 또는 신경교 마커로서 CNP(희소돌기아교세포), GFAP(성상교세포) 및 Iba1(미세아교세포)의 세 가지 염색 조합을 사용하여 면역형광 이미징을 위해 염색되었습니다(그림 2).
다양한 세포 유형은 CellProfiler 파이프라인('6-diamidino-2-phenylindole-positive(https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1) 기준)을 사용하여 정량화되었습니다. 각 개별 데이터 포인트는 시점당 3개의 커버슬립에서 가져온 평균 10개의 이미지에서 생성되었습니다. 미세아교세포, 뉴런 및 희소돌기아교세포의 경우 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌 양성(DAPI+) 세포당 세포 유형의 백분율을 계산했습니다. 백분율 시야는 성상교세포의 수를 정량화하기 위해 세포의 수 대신에 사용되었다. 이는 개별 세포가 자주 겹치기 때문에 구별하기 어려웠기 때문입니다(그림 2M,N). 배양은 DIV21에서 최대 성숙도 및 세포 밀도에 도달한 후 배양이 분해되기 시작했습니다(그림 2N).
중요하게도, 이러한 배양은 잠재적 치료제와 같은 약물로 쉽게 치료하거나 시험관 내 감염을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이 예에서, 커버슬립의 배양물을 24웰 플레이트로 옮기고 감염된 세포에서 zsGreen을 발현하는 고도의 신경성 바이러스 Semliki Forest 바이러스(SFV)(균주 SFV6)6에 감염시켰습니다. 아기 햄스터 신장(BHK) 세포에서 적정한 0.05의 감염 다중도(MOI-세포당 추가된 바이러스 입자 수)를 사용하여 낮은 수준의 감염을 확인했습니다. 감염 후 0-72시간(hpi) 후, 배양물을 4% PFA에 고정하고 면역형광 이미징으로 분석을 위해 염색했습니다. 그림 3 은 생체 내 감염과 함께 SFV가 주로 희소돌기아교세포와 뉴런을 감염시킨다는 것을 보여줍니다 6.
qRT-PCR (qRT-PCR)
현미경 검사 외에도, 이들 CNS 배양은 치료에 대한 mRNA 반응의 RT-qPCR과 같은 분자 방법에 의한 분석에 사용될 수 있다. 선천적 항바이러스 반응을 추가로 조사하기 위해 6웰 플레이트 배양을 24시간 동안 다양한 용량의 강력한 항바이러스 사이토카인 인터페론 베타(IFN-β)로 처리했습니다. 배양물을 구아니듐-티오시아네이트/페놀로 용해시키고, RNA를 분리하고, cDNA로 전환시키고, 앞서 설명한 바와 같이 qPCR에 의해 분석하였다7. 이 방법을 사용하여 많은 유전자의 차등 발현을 측정할 수 있습니다. 여기서, Ccl5 의 상향조절은 하우스키핑 유전자 18s에 대해 정량화되었다. CCL5는 염증 반응에 관여하는 화학주성 사이토카인(chemokine)이다. IFN-β 처리는 배양물에서 Ccl5 mRNA의 상향조절을 초래하였다(도 4A).
효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)
96웰 형태의 배양은 처리량이 많은 처리 스크리닝을 위한 탁월한 도구입니다. Ccl5 mRNA의 상향조절이 CCL5 단백질의 발현을 초래하는지 여부를 조사하기 위해, 제조자의 지시에 따라 ELISA에 의해 배양물의 상청액에서 CCL5를 측정하였다 ( 재료 표 참조). 이 예에서, 96-웰 배양물을 IFN-β의 27회 증분 용량으로 이중으로 처리하여 용량-반응 곡선을 생성하였다(도 4B). 증가된 mRNA 발현(도 4A)에 따라, 상청액에서 방출된 CCL5의 증가가 있었다. 예상한 바와 같이, 도 4C 는 mRNA와 단백질 발현 사이의 명확한 상관관계를 보여준다.
유세포 분석
유세포 분석은 많은 세포 내 및/또는 세포외 마커의 발현을 동시에 조사할 수 있는 강력한 도구입니다. 그러나 유세포 분석에 의한 복잡하고 상호 작용이 뛰어난 배양을 분석하는 것은 배양에서 처리 및 분석을 위해 단일 세포 현탁액으로 세포를 채취할 때 세포 손상 및 사멸로 인해 어려울 수 있습니다. 0.05%-0.5% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), EDTA가 없는 1x-10x 트립신 및 부드러운 해리 시약을 사용하여 다양한 프로토콜을 비교한 결과, 6웰 플레이트 배양물을 0.05% 트립신-EDTA로 처리한 후 37°C에서 10분 동안 부드러운 교반으로 세포를 들어 올려 단일 세포 현탁액을 생성했습니다. 특히 CNS 세포의 유세포 분석의 경우, 세포를 준비하는 동안 부드럽게 하고, 세척 단계를 최소화하고, 세포를 항상 4°C 또는 얼음 위에 유지하도록 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.
이 단일 세포 현탁액에서 생존율 및 세포 유형을 평가하기 위해, 세포를 CD45, CD11b, O4, ACSA-2 및 CD24에 대한 생존율 염료 및 형광 표지 항체로 염색하여 배양8 에서 각 개별 세포 집단을 시각화할 수 있도록 했습니다(그림 5). 이 방법으로부터 약 70%의 세포 생존율이 얻어졌으며, 6-웰 플레이트 당 평균 약 2 x 106 생존 가능한 단일 세포를 얻었다(도 5C). 현미경 결과(그림 2N)에 따르면 많은 수의 미세아교세포, 뉴런 및 성상교세포가 있는 반면 희소돌기아교세포는 가장 적게 풍부했습니다.
그림 1: 혼합 신경 및 신경교 배양을 생성하기 위해 설명된 방법의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시간 경과에 따른 면역형광 이미징 세포 마커에 대해 염색된 E17 CNS 배양물. 세포는 투과화되기 전에 4% PFA로 고정되고 염색되어 다른 집단을 시각화했습니다. (A,D,G,J,M) 발달 마커 NG2(희소돌기아교세포 전구체 세포) 및 네스틴(신경 및 신경교 전구 세포), (B,E,H,K,N) 신경 마커 SMI31(축삭), MBP(미엘린) 및 NeuN(뉴런 세포체) 및 (C,F,I,L,O) 신경교 마커 CNP(희소돌기아교세포), GFAP(성상교세포) 및 Iba1(미세아교세포). 스케일 바 = 50 μm. (P) mm 2, n = 3 당 DAPI 수, 삼중 당 10 개의 이미지로 구성된 기술적 삼중의 각 n. (Q) DAPI+ 세포(미세아교세포, 희소돌기아교세포 및 뉴런)의 백분율 및 시야(성상세포)의 백분율로 세포 수, n = 3, 삼중당 10개 이미지의 기술적 삼중에서 각각 n. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)± 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 시간 경과에 따른 E17 CNS 배양의 Semliki Forest 바이러스(SFV) 감염. 감염되지 않은 대조군 배양물(A,C,E,G) 및 0.05 MOI SFV(B,D,F,H)로 감염된 배양물의 대표 이미지. 세포를 0-48시간 동안 감염시키고, CNP(희소돌기아교세포 마커) 및 NeuN(뉴런 마커)(A-D) 또는 GFAP(성상세포 마커) 및 Iba1(소교세포 마커)(E-H)로 염색하였다. 흰색 화살표는 감염된 세포를 나타냅니다. SFV의 이 균주는 녹색 형광 단백질인 zsGreen을 발현하여 바이러스 감염의 추적을 가능하게 합니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: IFN-β 처리 후 E17 CNS 배양물의 CCL5 mRNA 및 단백질 발현. 세포를 6-웰 플레이트 포맷 (mRNA) 또는 96-웰 플레이트 포맷 (단백질)에서 IFN-β의 다양한 용량으로 24시간 동안 처리하였다. (A) 0-100ng/mL IFN-β로 처리한 후 Ccl5 mRNA의 발현, 생물학적 n = 2, 각각 기술 삼중체에서 가져옴. (B) 0-100 ng/mL IFNβ 처리 후 상청액의 CCL5 농도, 생물학적 n = 1, 기술 삼중체에서 가져옴. (C) 로그 추세선이 있는 상청액에서 세포 mRNA Ccl5 상향 조절 대 CCL5 단백질 농도. 오차 막대는 SEM± 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: E17 CNS 배양에서 단일 세포 집단을 생성하기 위한 유세포 분석 게이팅 전략. 세포를 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 해리하고, 적절한 항체로 염색하고, 개별 세포 집단으로 분류하였다. (ᄀ씨) 살아있는 단일 셀을 정렬하기 위한 게이팅 전략입니다. (D) 미세아교세포(CD45+, CD11b+)에 대한 선택 전략. (E) 희소돌기아교세포(CD45-CD11b-O4+)를 선택하는 전략. (F) 성상교세포(CD45-, CD11b-O4-ACSA-2+, CD24+) 및 뉴런(CD45-, CD11b-O4-, ACSA-2-, CD24+)을 분류하는 전략. (G) 개별 세포 집단이 서로 겹쳐져 개별 집단을 보여줍니다. (H) 정렬된 전체 세포에 대한 백분율로 나타낸 개별 세포 유형, n = 4. 오차 막대는 SEM±. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 필수 형식 | BA-PLL/웰 | 세척용 물 | 도금 매체(PM)의 볼륨 셀을 도금하여 | 미디어 보충 | 배양균을 먹일 때 제거/추가(3회/주) |
| 6웰 형식(9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL 배지 |
| +600 μL DM+ | +600μL DM+/- | ||||
| 96웰 형식(0.32cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60μL DM+ | -50 μL 배지 |
| +60μL DM+/- | |||||
| 접시 형식의 커버슬립 | 커버슬립 200개당 20mL | 20 밀리리터 | 커버슬립당 100 μL | +600 μL DM+ | -500 μL 배지 |
| +300 μL PM | +600μL DM+/- |
표 1: 코팅된 조직 배양 플라스틱의 준비에 필요한 부피.
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Discussion
중추신경계는 뇌에서 척수까지 이어지는 복잡한 네트워크로, 주로 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포, 미세아교세포 등 다양한 세포 유형으로 구성되어 있다1. 각 세포는 항상성을 유지하고 CNS 9,10,11의 문제에 대한 적절한 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 이러한 모든 세포 유형을 포함하는 배양 시스템은 뇌가 자극에 어떻게 반응하는지 조사하는 데 유용하고 다재다능한 도구입니다. 시험관 내 맥락에서 이러한 세포와 그 상호 작용을 연구할 수 있다는 것은 다양한 실험 문제를 쉽게 조사하기 위해 매우 다양한 기술을 사용할 수 있음을 의미합니다. 우리는 태아기 뇌에서 주요 CNS 세포 유형을 얻고 배양하는 빠르고 효율적인 방법을 설명했으며, 이는 성인 마우스 뇌에서 개별 세포 집단을 모방할 수 있습니다12.
CNS 배양을 생성하기 위해 이전에 확립된 프로토콜은 E13.5 척수 4,5를 사용합니다. 척수에 적합한 모델을 갖는 것 외에도 뇌를 요약하는 모델을 갖는 것이 매우 중요합니다. 따라서, 이들 E13.5 마우스로부터의 뇌는 원래 동일한 프로토콜을 사용하여 여기에 기술된 CNS 배양물을 생성하는데 사용되었다. 그러나 DIV14 이후 세포는 조밀하게 채워진 신경 세포체로 큰 응집체를 형성하기 시작했습니다. 성상교세포가 존재했지만 고르게 분포되어 있는지는 확실하지 않습니다. 이러한 세포체의 중심에 있는 세포가 외부 세포처럼 배양 배지로부터 충분한 영양분과 산소를 공급받을지는 확실하지 않습니다. 산소 및 영양 결핍을 경험할 때, 뉴런은 아폽토시스를 거쳐 신경교 세포에 스트레스 신호를 방출하기 쉬우며(13), 이는 전염증성 표현형(14)으로 이어질 수 있다. 신경 발생은 이러한 조밀하게 채워진 응집체의 가능한 원인으로 생각되었으며, 이 단계는 E1715에 의해 가라앉습니다. E17 마우스 배아의 뇌가 사용되었을 때, 세포는 여전히 네트워크를 형성했지만 E13.5에서 볼 수 있는 큰 응집체로 군집하지 않았기 때문에 뇌 배양이 생성되기에 더 적합한 나이로 간주되었습니다.
현재의 기술은 또한 한 번의 임신에서 얻은 세포 수를 더 많이 만듭니다 (평균 1 x 10 7 세포 / 뇌 3-4 x 106 세포 / 척수에 비해)7. 8-10개의 배아를 가진 평균 임신 마우스의 경우, 이는 6웰 플레이트 형식에서 최대 54개의 서로 다른 실험 조건 또는 현미경의 경우 150개의 실험 조건(척수에서 각각 19개 및 64개와 비교)과 관련이 있습니다. 이와 같이, 이들 CNS 배양은 필요한 마우스의 수를 감소시키는데 훌륭한 도구이다16. 특히, 96웰 형식은 동물 실험 전에 약물 후보를 스크리닝할 수 있는 것과 같은 고처리량 분석에 쉽게 사용할 수 있어 이러한 연구에 필요한 동물의 수를 크게 줄일 수 있습니다. 이것은 동물에서 CNS 약물 테스트의 낮은 성공률을 개선하고 인간17,18의 임상 시험으로의 번역을 향상시킬 것입니다.
배양은 DIV21에 의해 최대 성숙에 도달합니다. 세포 수는 이 시점까지 증가하며, 그 후 세포는 각 유형의 세포 수가 감소함에 따라 퇴화되기 시작합니다. 이것은 정량화된 세포 수(그림 2N)와 pyknotic 핵의 수(조밀한 DAPI 염색)(그림 2M)를 모두 관찰하여 측정되었습니다. 발달 마커 네스틴과 NG2는 여전히 DIV14 (그림 2G) 및 DIV21 (그림 2J)에서 발현되지만, 이는 일부 성상 교세포가 성상 교증을 겪기 때문이며, 이는 네스틴19를 상향 조절하는 반면, 일부 희소 돌기 아교 세포는 완전히 성숙하지 않아 여전히 일부 NG220을 발현합니다. 현미경 검증에 따르면, DIV21에 의해 완전히 성숙한 세포에 비해 세포의 작은 부분만이 여전히 발달 마커를 발현합니다(그림 2I,L). 따라서 문화는 이때쯤이면 대체로 성숙합니다. 참고로, 생체 내에서 미세아교세포의 밀도는 쥐 CNS에 걸쳐 매우 다양합니다. 현미경을 이용한 Iba1 발현에 의해 정의되는 미세아교세포의 수준은 우리 배양에서 이 밀도의 상한선에 있다12. 유세포 분석 절차에서 생존하는 미세아교세포의 비율이 높은 것은 미세아교세포가 일반적으로 섬세한 확장을 가지고 있어 유세포 분석 준비 중에 손상될 가능성이 더 높은 다른 CNS 세포보다 더 견고하기 때문일 수 있습니다.
해부 후 세포가 실험 준비가 될 때까지 3주밖에 걸리지 않으며, 이는 오가노이드 또는 유도만능줄기세포 유래 모델과 같은 대부분의 인간 기반 시험관 내 방법보다 짧다21. 새로운 치료제의 안전성을 보장하기 위해 in vivo 연구가 필요한 한, 당사와 같은 in vitro 세포 배양 방법을 사용하면 동물 실험 전에 독성 및 효능을 효율적으로 테스트하는 데 도움이 될 것이며, 동물에 대한 요구 사항을 줄이고 in vitro에서 in vivo 로의 연구 번역을 향상시킬 수 있습니다.바라건대, 이것은 결국 인간 기반 임상 시험에 대한보다 효율적인 번역으로 이어질 것입니다. 궁극적으로, 이러한 문화는 중추 신경계의 연구를 허용하기 위해 만들어졌습니다. 시험관내 시스템은 CNS의 복잡성을 완전히 발현할 수 없지만, 일차 세포 유래 배양은 생체 내 CNS 특성을 보다 정확하게 나타냅니다22,23. 시험관내 접근법은 침윤성 면역 세포(24) 및 혈액-뇌 장벽 완전성(25)이 없는 상태에서 CNS를 조사하기 위한 보다 환원적인 접근법을 허용할 수 있다. 이러한 복잡성 계층을 제거하면 메커니즘을 더 쉽게 풀 수 있습니다. 따라서 본 배양 시스템은 생체 내 동물 연구를 보완하는 연구 질문에 답하는 데 유용한 도구입니다.
CNS 세포를 수확, 분리 및 배양하는 능력은 이미 타고난 CNS16에 대한 우리의 이해를 크게 발전시켰습니다. 이 기사는 E17 마우스 뇌의 해부와 CNS의 모든 주요 세포 유형을 포함하는 세포 배양 시스템을 생성하기 위한 세포의 분쇄 및 배양을 보여줍니다. 이러한 배양에 여러 분자 기술이 사용되어 이러한 배양이 CNS를 조사하는 데 미치는 영향을 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Edgar 및 Linington 연구소 구성원, 특히 Chris Linington 교수, Diana Arseni 박사 및 Katja Muecklisch 박사에게 이러한 문화를 설정하는 동안 문화에 대한 조언, 유용한 의견 및 지원에 감사드립니다. Cell Profiler 파이프라인의 시작점을 제공한 Dr Muecklisch에게 특별한 감사를 전합니다. 이 작업은 MS Society (보조금 122)와 Yuri and Lorna Chernajovsky 재단의 지원을 받았습니다. JC 및 MP에 대한 글래스고 대학교 자금 지원; 및 Wellcome Trust(217093/Z/19/Z) 및 Medical Research Council(MRV0109721)을 GJG에 제공합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
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