Summary
Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.
Abstract
Merkezi sinir sistemi (CNS) modelleri, in vivo olarak bulunan birbirine bağlı hücrelerin karmaşık ağını özetlemelidir.CNS öncelikle nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia'dan oluşur. Hayvan kullanımını değiştirme ve azaltma çabalarının artması nedeniyle, CNS enfeksiyonları ve patolojileri için terapötiklerin geliştirilmesine izin veren doğuştan gelen hücre özelliklerini keşfetmek için çeşitli in vitro hücre kültürü sistemleri geliştirilmiştir. Bazı araştırma soruları, (indüklenmiş) pluripotent kök hücreler gibi insan temelli hücre kültürü sistemleri tarafından ele alınabilirken, insan hücreleriyle çalışmanın kullanılabilirlik, maliyetler ve etik açısından kendi sınırlamaları vardır. Burada, embriyonik fare beyinlerinden hücreleri izole etmek ve kültürlemek için benzersiz bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan karışık nöral hücre kültürleri, beyinde in vivo olarak bulunan çeşitli hücre popülasyonlarını ve etkileşimlerini taklit eder. Mevcut eşdeğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol beynin özelliklerini daha yakından taklit eder ve ayrıca daha fazla hücre toplar, böylece hamile bir fareden daha fazla deneysel koşulun araştırılmasına izin verir. Ayrıca, protokol nispeten kolay ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bu kültürler, 96 kuyucuklu yüksek verimli ekranlar, 24 kuyucuklu mikroskopi analizi ve akış sitometrisi ve ters transkripsiyon-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi için 6 kuyucuklu kültürler dahil olmak üzere çeşitli ölçeklerde kullanım için optimize edilmiştir. Bu kültür yöntemi, in vitro yöntemlerin rahatlığı ile CNS'nin bazı karmaşıklıkları bağlamında enfeksiyon ve bağışıklığı araştırmak için güçlü bir araçtır.
Introduction
Merkezi sinir sistemi (CNS) hakkındaki anlayışımızı geliştirmek, birçok nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalık için terapötik seçenekleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Beyin, omurilik ve optik sinirler içindeki birbirine bağlı hücrelerin karmaşık bir ağı olan CNS, nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve bunların doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olan mikroglia1'i içerir. İn vitro bir yaklaşım genellikle anlamlı araştırmalar yapmak için gereken fare sayısını önemli ölçüde azaltabilir; Bununla birlikte, CNS'nin karmaşık doğası, hücre hatlarını kullanarak in vivo durumu özetlemeyi imkansız kılar. Karışık nöral hücre kültürleri, Replasman, İndirgeme ve İyileştirme (3R) ilkeleri 2,3 doğrultusunda, ilgili bir modelde nöro(immüno)loji sorularını araştırmak için son derece değerli bir araştırma aracı sağlar.
Thomson ve ark., yukarıda belirtilen tüm ana CNShücre tiplerine farklılaşan prenatal omurilik hücrelerini kullanarak bir hücre kültürü yöntemi tanımlamıştır. Bu sistem ayrıca sinaps oluşumuna, miyelinli aksonlara ve Ranvier düğümlerine sahiptir. Bu kültürleme yönteminin temel sınırlaması, omurilik olarak, beyni yararlı bir şekilde modellememesi ve embriyonik gün 13 (E13) omuriliklerinden elde edilen hücre veriminin daralmasıdır. Bu nedenle, bu, araştırılabilecek deneysel koşulların sayısını sınırlar. Bu nedenle, bu çalışma, hayvanlara olan gereksinimleri azaltmak için artan hücre verimi ile beynin özelliklerini özetleyen yeni bir hücre kültürü sistemi geliştirmeyi amaçlamıştır.
Thomson ve ark.'yı başlangıç noktası olarak kullanarak, tamamen doğum öncesi fare beyinlerinden türetilmiş bir hücre kültürü modeli geliştirdik. Bu kültürler, omurilik kültürleriyle aynı hücre popülasyonlarına, birbirine bağlanabilirliğe ve tedavi seçeneklerine sahiptir, ancak karşılaştırıldığında daha az miyelinasyon vardır. Bununla birlikte, yaklaşık üç kat daha yüksek hücre verimine sahip bir CNS in vitro modeline sahip olmak daha verimlidir ve daha az fare ve daha az zaman işleme embriyosu gerektirir. Bu benzersiz kültür sistemini, mikroskopi analizi için cam kapak fişleri ve yüksek verimli araştırmalar için 96 delikli plakalar da dahil olmak üzere çeşitli boyutlarda plastik kuyu plakaları kullanmak da dahil olmak üzere birden fazla aşağı akış uygulaması ve terazisi için optimize ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, hayvan kullanımı için yerel yasalara ve yönergelere uygundur ve Glasgow Üniversitesi'ndeki yerel Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, İngiltere İçişleri Bakanlığı Proje Lisansı'nın himayesinde, İngiltere Hayvanları Bilimsel Prosedürler Yasası 1986 uyarınca belirli patojensiz koşullarda barındırılmıştır. Bu çalışma için, şirket içi yetiştirilmiş yetişkin C57BL / 6J fareler kullanılmıştır. Gebeliğin daha yüksek başarı oranı nedeniyle genç kadınların (8-12 hafta) kullanılması önerilir; Erkekler birden fazla üreme turu için tekrar kullanılabilir. Şekil 1 , karışık nöronal ve glial kültürler oluşturmak için tarif edilen yöntemin şematik bir özetini temsil etmektedir.
1. Doku kültürü sarf malzemelerinin hazırlanması
- Sınıf 2 Güvenlik kabini içinde mikroskopi kapakları içeren tabakları ve/veya bulaşıkları hazırlayın. Kültür döneminde steriliteyi sağlamak için tüm reaktifleri veya otoklavı sterilize edin.
- Her bir kuyucuğa uygun miktarda BA-PLL (borik asit tamponunda [BA] [50 mM borik asit, 12,5 mM sodyum tetraborat, pH 8,5]; bkz. Malzeme Tablosunda 1.000 μL/kuyu, 96 delikli bir plakada 100 μL/kuyu; hacimler Tablo 1'de özetlenmiştir) uygun hacimde BA-PLL (13,2 μg/mL poli-L-lizinhidrobromür [PLL]) ekleyin. Mikroskopi kapakları için, 200 steril kapak fişi içeren 9 cm çapında bir doku kültürü kabına 20 mL BA-PLL ekleyin ve eşit olarak dağıtmak için girdap yapın.
- 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- BA-PLL çözeltisini mikroskopi kapakları içeren her bir kuyucuktan veya tabaktan çıkarın ve 20 mL steril su ekleyerek, kapak kapaklarını döndürerek ve ardından suyu çıkararak yıkayın. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Kapak fişleri içeren bir tabakta, kapak kapaklarını kolayca çıkarmak için son yıkamada doku kültürü kabında steril su bırakın.
- Steril bir pipetle mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın ve gece boyunca en az 2 saat kurumaya bırakın.
- Kaplanan plakaları 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
NOT: Poli-l-lizin (BA-PLL) çözeltisi ile hazırlanan borik asit, her seferinde yeni PLL eklenerek üç defaya kadar tekrar kullanılabilir. BA-PLL'yi 4 °C'de saklayın. Bulaşıklar BA-PLL ile muamele edilir, çünkü PLL hücrelerin yapışmasına ve büyümesine izin verir. Bu tedavi olmadan, hücreler yaklaşık 1 haftalık kültürden sonra kalkacak ve artık farklılaşamayacaktır.
2. E17 embriyonal beyinlerinin diseksiyonu
- Bir veya daha fazla dişi fareyi bir erkek fare ile birlikte barındırın. Dişileri günlük olarak bir mukus tıkacı için kontrol edin, bu da çiftleşmenin gerçekleştiğini gösterir.
NOT: Herhangi bir "tıkanmış" dişi farenin, gebeliğin doğru başlangıç tarihini sağlamak için erkekten ayrılması gerekir. Fareler hamileliği doğrulamak için tartılabilir veya görsel olarak izlenebilir. - Hamile fareyi E17'de, örneğin karbondioksit (CO2) konsantrasyonunu yükselterek, ölümcül anestezik doz aşımı veya boynun çıkığı gibi yerel hayvan refahı rehberliğine ve yasalarına uygun uygun yöntemler kullanarak itlaf edin.
NOT: Seçilen yöntem embriyoları bozmamalıdır. Bu çalışma için, artan bir karbondioksit gazı konsantrasyonuna maruz kalmanın ardından femoral arterin kesilmesiyle ölümün doğrulanması gebe barajları yok etmek için kullanılmıştır. - Culled, hamile fareyi sırtına bir diseksiyon tahtasına yerleştirin; sabitlemek gerekli olmasa da, deneyimsiz araştırmacılar için daha kolay olabilir. Forseps kullanarak karın orta hattını sıkıştırın. Keskin makas kullanarak, uterusu delmemeye dikkat ederek, karnı deriden ve orta hat üzerindeki peritondan cinsel organdan göğüs kafesine kadar kesin.
- Fare rahminin, her biri tipik olarak bir ila beş embriyo içeren iki boynuzu vardır. Embriyoları içeren uterusu anneden çıkarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin.
- Plasentaların yanındaki yumurta sarısı torbasını kesin, embriyolara zarar vermemeye dikkat edin ve embriyoları yumurta sarısı çuvalından çıkarın.
- Hemen embriyoların kafasını kesin. Kafası kesilmiş kafaları, buz üzerinde kalsiyum (Ca 2+) ve magnezyum (Mg2+) (HBSS-/-) içermeyen Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile bir kaba ekleyin.
NOT: Genotipleme gerekiyorsa, genetik analiz için bu aşamada kuyruk çıkarılabilir. Birden fazla genotip beklendiğinde, her embriyonun başları kültürleme için ayrı tutulmalıdır. - Açılı forseps kullanarak, kafayı sola bakan tarafına yerleştirin.
- Forsepsin bir kenarıyla gözü delin, çeneyi diğeriyle sıkıca tutun.
- Enseden başlayarak, kafa derisinin derisini orta çizgi boyunca burun ucuna doğru yavaşça yırtın.
- Beyaz bir oval olarak fark edilen omurilikten girerek, kafatasını orta hat boyunca açmak ve beyni açığa çıkarmak için açılı forsepsleri kullanın.
- Kafatasını yukarı bakan taraftan yavaşça soyun ve beyni açığa çıkarın.
- Beyni kafatasından çıkarın, beyin tamamen çıkarıldıktan sonra kafatasını atın.
- Forsepsleri kullanarak, yoğun kan damarlarına sahip ince bir zar olarak fark edilen meninksleri çıkarın.
- Beyinleri buz üzerinde 2 mL HBSS-/- içeren bir bijou'ya ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
- 2.6 ila 2.13 arasındaki adımları kalan beyinlerle tekrarlayın ve bijou başına dört adede kadar beyin ekleyin.
- Bijou'ya 250 μL 10x tripsin ekleyin ve bijou'yu sallayarak beyinleri üçe katlayın. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
NOT: Bu noktadan itibaren tüm adımlar steril doku kültürü başlığında gerçekleştirilmelidir. - 2 mL soya fasulyesi tripsin (SD) inhibitörü (Leibovitz L-15, soya fasulyesinden 0.52 mg/mL tripsin inhibitörü, 40 μg/mL DNaz I, 3 mg/mL sığır serum albümini [BSA] fraksiyonu V; bakınız Malzeme Tablosu) -20 °C'den 37 °C'ye yerleştirerek çözün.
- Her bijou içeren beyine 2 mL SD inhibitörü ekleyin (dört adede kadar beyin içeren bijou başına), bijou'yu eşit şekilde dağıtmak için tekrar sallayın.
NOT: SD inhibitörü, numunelerin gereksiz yere sindirilmesini önlemek ve hücre canlılığını korumak için tripsin aktivitesini azaltır. - Santrifüjleme olmadan, her bir bijou'dan 2 mL süpernatantı çıkarın ve hücre kümelerini aktarmamaya dikkat ederek 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Bijou'da kalan hücreleri, süspansiyonu iki kez aspire ederek 5 mL'lik bir şırıngaya tutturulmuş 19 G'lik bir iğne ile tritüre edin. Bu, kalın bir mukus benzeri karışım yaratacaktır.
- 21 G'lık bir iğne kullanarak iki kez daha tekrarlayın. Kalan kümeler varsa, 21 G iğne ile bir kez daha tritüre edin.
- 23 G'lik bir iğne kullanarak hücreleri bijou'dan aynı 15 mL santrifüj tüpüne (adım 2.18'den itibaren) aktarın.
- Oda sıcaklığında (RT) 200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
- Tüm süpernatantı 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak çıkarın ve gerekli hücreleri içeren alttaki gevşek peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek başka bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Süpernatantı RT'de 200 x g'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüj edin.
NOT: Bu adım gerekli değildir, ancak çok sayıda hücreye ihtiyaç duyulursa veya az sayıda embriyo varsa, süpernatandan mümkün olduğunca çok hücre kurtarmak için bu adımı gerçekleştirebilirsiniz. - 10 mL kaplama ortamı (PM) kullanarak (%49 Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı [DMEM], %1 penisilin/streptomisin [Pen/Strep], %25 at serumu, %25 HBSS ile Ca 2+ ve Mg2 + [HBSS+ /+]; bakınız Malzeme Tablosu), bütün bir hücre süspansiyonu oluşturmak için iki peleti birleştirin ve yeniden askıya alın.
- Tripan mavisi ve bir hemositometre veya dijital hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu PM ile 1.8 x 106 hücre / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin.
3. Hücrelerin kaplanması
- Hücre süspansiyonunun gerekli hacmini Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi gerekli formata ekleyin: 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 1.000 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 50 μL veya kapak kayması başına 100 μL.
- 37 ° C'de 2-4 saat boyunca% 5 -% 7 CO2 ile inkübe edin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin yapışıp yapışmadığını kontrol edin.
- Ortamı çıkarın ve yeni farklılaştırma medyası (DM+: DM- 10 μg/mL insülin dahil. DM-: DMEM, %1 Kalem/Strep, 50 nM hidrokortizon, 10 ng/mL biyotin, 2,5 mL 100x N1 ortam takviyesi; Bkz. Malzeme Tablosu). Birimler Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Steril bir pipet ucu kullanarak yüzen kapak fişlerini bastırın.
4. Kültürlerin sürdürülmesi
NOT: Bu kültürler, optimal büyümeyi ve farklılaşmayı desteklemek için haftada üç kez beslenmeyi gerektirir. Kültürler, DIV ( in vitro günler) 21 üzerindeki deneyler için optimum sağlık ve olgunluğa ulaşacaktır. Hücreler 28 güne kadar kültürde tutulabilir, bundan sonra kültürler hızla dejenere olur.
- DIV12'ye kadar haftada üç kez, 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 500 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 50 μL veya üç kapak fişi içeren çanak başına 500 μL çıkararak ve 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 600 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 60 μL ekleyerek süpernatantın bir kısmını taze DM+ ile değiştirin, veya kapak kayması çanağı başına 600 μL (Tablo 1).
- DIV13'ten itibaren haftada üç kez, 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 500 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 50 μL veya üç kapak fişi içeren çanak başına 500 μL çıkararak ve 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 600 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 60 μL ekleyerek süpernatantın bir kısmını taze DM- ile değiştirin, veya kapak kayması çanağı başına 600 μL (Tablo 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskopi
Cam örtüler üzerinde yetiştirilen kültürler mikroskopi ile analiz etmek için idealdir. Kültürlerin gelişimini görselleştirmek için, kapak kaymaları DIV0'dan (hücreler bağlandıktan sonra) DIV28'e kadar birçok zaman noktasında% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlendi. Kültürler, daha önce tarif edildiği gibi immünofloresan görüntüleme için boyandı5 üç farklı boyama kombinasyonu kullanılarak: gelişimsel belirteçler olarak NG2 (olgunlaşmamış oligodendrositler) ve nestin (nöronal kök / progenitör hücreler), SMI31 (aksonlar), MBP (miyelin) ve NeuN (nöron hücre gövdesi) nöronal belirteçler olarak veya CNP (oligodendrositler), GFAP (astrositler) ve Iba1 (mikroglia) glial belirteçler olarak (Şekil 2).
Çeşitli hücre tipleri CellProfiler boru hatları kullanılarak ölçüldü (′,6-diamidino-2-fenilindol-pozitif (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1) baz alınarak). Her bir veri noktası, zaman noktası başına üç kapak fişinden alınan ortalama 10 görüntüden oluşturulmuştur. Mikroglia, nöronlar ve oligodendrositler için, 4′,6-diamidino-2-fenililindol-pozitif (DAPI +) hücre başına hücre tipinin yüzdesi hesaplandı. Astrositlerin sayısını ölçmek için hücre sayısı yerine yüzde görüş alanı kullanıldı. Bunun nedeni, sıklıkla üst üste bindikleri için bireysel hücreler arasında ayrım yapmadaki zorluklardı (Şekil 2M, N). Kültürler DIV21'de en yüksek olgunluğa ve hücre yoğunluğuna ulaştı, daha sonra kültürler bozulmaya başladı (Şekil 2N).
Önemli olarak, bu kültürler potansiyel terapötikler gibi ilaçlarla kolayca tedavi edilebilir veya in vitro enfeksiyonları izlemek için kullanılabilir. Bu örnekte, kapak fişleri üzerindeki kültürler 24 delikli bir plakaya aktarılmış ve enfekte olmuş hücrelerde zsGreen'i ifade eden yüksek nörotropik virüs Semliki Forest virüsü (SFV) (SFV6) 6 ile enfekte edilmiştir. Düşük seviyeli enfeksiyonu sağlamak için bebek hamster böbrek (BHK) hücrelerinde titre edildiği gibi 0.05'lik bir enfeksiyon çokluğu (MOI-hücre başına eklenen virüs parçacıklarının sayısı) kullanıldı. Enfeksiyon sonrası 0-72 saat sonra (hpi), kültürler %4 PFA'da sabitlendi ve immünofloresan görüntüleme ile analiz için boyandı. Şekil 3 , in vivo enfeksiyona paralel olarak, SFV'nin esas olarak oligodendrositleri ve nöronları enfekte ettiğini göstermektedir6.
qRT-PCR
Mikroskopiye ek olarak, bu CNS kültürleri, tedaviye mRNA yanıtlarının RT-qPCR'si gibi moleküler yöntemlerle analiz için kullanılabilir. Doğuştan gelen antiviral yanıtı daha fazla araştırmak için, 6 kuyucuklu plak kültürleri 24 saat boyunca güçlü antiviral sitokin interferon beta'nın (IFN-β) bir dizi dozu ile tedavi edildi. Kültürler guanidyum-tiyosiyanat / fenol ile lize edildi ve RNA izole edildi, cDNA'ya dönüştürüldü ve daha önce tarif edildiği gibi qPCR ile analiz edildi7. Bu yöntem kullanılarak, birçok genin diferansiyel ekspresyonu ölçülebilir. Burada, Ccl5'in yukarı regülasyonu, temizlik geni 18'lere karşı ölçüldü. CCL5, inflamatuar yanıtta rol oynayan kemotaktik bir sitokindir (kemokin). IFN-β tedavisi kültürlerde Ccl5 mRNA'nın upregülasyonu ile sonuçlanmıştır (Şekil 4A).
Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)
96 kuyucuklu kültür formatı, tedavilerin yüksek verimli taramaları için mükemmel bir araçtır. Ccl5 mRNA'nın yukarı regülasyonunun CCL5 proteininin ekspresyonu ile sonuçlanıp sonuçlanmadığını araştırmak için, CCL5, üreticinin talimatlarına göre ELISA tarafından kültürlerin süpernatantında ölçülmüştür (bakınız Malzeme Tablosu). Bu örnekte, 96 kuyucuklu kültürler, bir doz-yanıt eğrisi oluşturmak için 27 artımlı IFN-β dozu ile çift olarak tedavi edilmiştir (Şekil 4B). Artmış mRNA ekspresyonuna paralel olarak (Şekil 4A), süpernatantta salınan CCL5'te bir artış olmuştur. Beklendiği gibi, Şekil 4C , mRNA ve protein ekspresyonu arasında açık bir korelasyon göstermektedir.
Akış sitometrisi
Akım sitometrisi, birçok hücre içi ve / veya hücre dışı belirtecin ekspresyonunu aynı anda araştırmak için güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, akış sitometrisi ile karmaşık, oldukça etkileşimli kültürleri analiz etmek, hücreleri kültürden işleme ve analiz için tek hücreli bir süspansiyona alırken hücre hasarı ve ölüm nedeniyle zor olabilir. % 0.05 -% 0.5 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA), EDTA'sız 1x-10x tripsin ve nazik ayrışma reaktifi kullanan çeşitli protokoller karşılaştırıldığında, 6 delikli plaka kültürlerinin 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ile nazik ajitasyonla muamele edilmesinden sonra, hücrelerin tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için yumuşak tritürasyonla kaldırıldığı bulunmuştur. Özellikle CNS hücrelerinin akış sitometrik analizi için, hücre hazırlığı sırasında nazik olmak, yıkama adımlarını en aza indirmek ve hücreleri her zaman 4 ° C'de veya buz üzerinde tutmaya büyük özen göstermek çok önemlidir.
Bu tek hücreli süspansiyondaki canlılığı ve hücre tiplerini değerlendirmek için, hücreler bir canlılık boyası ve CD45, CD11b, O4, ACSA-2 ve CD24'e karşı floresan olarak etiketlenmiş antikorlarla boyandıve kültürlerdeki her bir hücre popülasyonunun görselleştirilmesine izin verildi 8 (Şekil 5). Bu yöntemden yaklaşık% 70 hücre canlılığı elde edildi ve 6 delikli plaka başına ortalama yaklaşık 2 x 106 canlı, tek hücre elde edildi (Şekil 5C). Mikroskopi sonuçlarına göre (Şekil 2N), çok sayıda mikroglia, nöron ve astrosit bulunurken, oligodendrositler en az miktarda bulunurdu.
Şekil 1: Karışık nöronal ve glial kültürler oluşturmak için tarif edilen yönteme şematik genel bakış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: E17 CNS kültürleri zamanla immünofloresan görüntüleme hücresi belirteçleri için boyanmıştır. Hücreler, farklı popülasyonları görselleştirmek için geçirgenleştirilmeden ve boyanmadan önce% 4 PFA ile sabitlendi. (A,D,G,J,M) gelişimsel belirteçleri NG2 (oligodendrosit öncü hücreleri) ve nestin (nöronal ve glial öncü hücreler), (B,E,H,K,N) nöronal belirteçleri SMI31 (aksonlar), MBP (miyelin) ve NeuN (nöron hücre gövdesi) ve (C,F,I,L,O) GLIAL BELIRTEÇLERI CMP (oligodendrositler), GFAP (astrositler) ve Iba1'in (mikroglia) temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 50 μm. (P) Mm başınaDAPI sayısı 2, n = 3, her n üçlü başına 10 görüntünün teknik üçlülerinden elde edilir. (Q) Hücre, DAPI+ hücrelerinin (mikroglia, oligodendrositler ve nöronlar) yüzdesi ve görüş alanının yüzdesi (astrositler), n = 3, her n üçlü başına 10 görüntünün teknik üçlüsünden sayılır. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart ± hatasıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: E17 CNS kültürlerinin zaman içinde Semliki Orman virüsü (SFV) enfeksiyonu. Enfekte olmamış kontrol kültürlerinin (A,C,E,G) ve 0.05 MOI SFV (B,D,F,H) ile enfekte olmuş kültürlerin temsili görüntüleri. Hücreler 0-48 saat boyunca enfekte edildi ve CNP (oligodendrosit belirteci) ve NeuN (nöron belirteci) (A-D) veya GFAP (astrosit belirteci) ve Iba1 (mikroglial belirteç) (E-H) ile boyandı. Beyaz oklar enfekte olmuş bir hücreyi gösterir. SFV'nin bu suşu, viral enfeksiyonun izlenmesini sağlamak için yeşil floresan proteini zsGreen'i ifade eder. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: IFN-β tedavisini takiben E17 CNS kültürlerinin CCL5 mRNA ve protein ekspresyonu. Hücreler, bir dizi IFN-β dozu ile 24 saat boyunca 6 delikli plaka formatında (mRNA) veya 96 delikli plaka formatında (protein) tedavi edildi. (A) Her biri teknik üçlülerden alınan 0-100 ng/mL IFN-β, biyolojik n = 2 ile işlemden sonra Ccl5 mRNA'nın ekspresyonu. (B) Teknik üçlülerden alınan 0-100 ng/mL IFNβ muamelesini takiben süpernatanttaki CCL5 konsantrasyonu, biyolojik n = 1. (C) Log trend çizgisi ile süpernatanttaki CCL5 protein konsantrasyonuna karşı hücresel mRNA Ccl5 upregülasyonu. Hata çubukları SEM ±. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: E17 CNS kültürlerinden tek hücreli popülasyonlar oluşturmak için akış sitometrisi geçit stratejisi. Hücreler% 0.05 tripsin-EDTA kullanılarak ayrıştırıldı, uygun antikorlarla boyandı ve bireysel hücre popülasyonlarına ayrıldı. (A-C) Canlı, tek hücreler için sıralama yapmak için geçit stratejisi. (D) Mikroglia için seçim stratejisi (CD45+, CD11b+). (E) Oligodendrositleri seçme stratejisi (CD45- CD11b- O4+). (F) Astrositler (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+, CD24+) ve nöronlar (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+) için sıralama stratejisi. (G) Bireysel hücre popülasyonları birbiri üzerine bindirilmiş, ayrı popülasyonlar gösterir. (H) Sıralanan toplam hücrelerin yüzdesi olarak tek tek hücre tipleri, n = 4. Hata çubukları SEM ±. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gerekli biçim | BA-PLL/kuyu | Yıkama suyu | Kaplama Ortamındaki (PM) hacim hücreleri plaka çıkışı için | Medya Yükleme | Kültürleri beslerken kaldırma/ekleme (haftada 3 kez) |
| 6 kuyu formatı (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL Medya |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| 96 kuyu formatı (0,32cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL DM+ | -50 μL Medya |
| +60 μL DM+/- | |||||
| Çanak formatında kapak fişi | 200 kapak fişi başına 20 mL | 20 mL | Kapak kayması başına 100 μL | +600 μL DM+ | -500 μL Medya |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
Tablo 1: Kaplanmış doku kültürü plastiklerinin hazırlanması için gerekli hacimler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CNS, beyinden omuriliğe kadar uzanan karmaşık bir ağdır ve ağırlıklı olarak nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve mikroglia1 olmak üzere birçok hücre tipinden oluşur. Her hücrenin homeostazı korumada ve CNS 9,10,11'deki zorluklara uygun yanıtlar üretmede önemli bir rolü olduğundan, tüm bu hücre tiplerini içeren bir kültür sistemi, beynin bir uyarana nasıl tepki verebileceğini araştırmak için yararlı ve çok yönlü bir araçtır. Bu hücreleri ve etkileşimlerini in vitro bir bağlamda inceleme yeteneği, çeşitli deneysel soruları kolayca araştırmak için çok çeşitli tekniklerin kullanılabileceği anlamına gelir. Yetişkin fare beynindeki bireysel hücre popülasyonlarını taklit edebilen doğum öncesi beyinden ana CNS hücre tiplerini elde etmek ve kültürlemek için hızlı ve etkili bir yöntem belirledik12.
CNS kültürleri oluşturmak için önceden belirlenmiş protokoller E13.5 omuriliklerini kullanır 4,5. Omurilik için uygun bir modele sahip olmanın yanı sıra, beyni özetleyen bir modele sahip olmak son derece önemlidir. Bu nedenle, bu E13.5 farelerinden alınan beyinler başlangıçta aynı protokolü kullanarak burada açıklanan CNS kültürlerini üretmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, DIV14'ten sonra, hücreler yoğun bir şekilde paketlenmiş nöronal hücre gövdeleri ile büyük agregalar oluşturmaya başladı. Astrositler mevcutken, eşit olarak dağılıp dağılmadıkları açık değildir. Bu hücre gövdelerinin merkezindeki hücrelerin, dışarıdaki hücreler gibi kültür ortamından yeterli besin ve oksijen alıp almayacağı belirsizdir. Oksijen ve besin yoksunluğu yaşarken, nöronlar apoptozdan geçmeye ve glial hücrelere stres sinyalleri bırakmaya meyillidir13, bu da proinflamatuar fenotip14'e yol açabilir. Nörogenezin bu yoğun paketlenmiş agregaların olası bir nedeni olduğu düşünülüyordu ve bu faz E1715 tarafından azalıyor. E17 fare embriyolarından elde edilen beyinler kullanıldığında, hücreler hala ağlar oluşturdular, ancak E13.5'te görülen büyük agregalara kümelenmediler ve bu nedenle beyin kültürlerinin üretilmesi için daha uygun bir yaş olarak kabul edildiler.
Mevcut teknik aynı zamanda bir hamilelikten elde edilen daha fazla sayıda hücre ile sonuçlanmaktadır (ortalama 1 x 10 7 hücre/beyin, 3-4 x 106 hücre/omurilik ile karşılaştırıldığında)7. 8-10 embriyoya sahip ortalama bir hamile fare için bu, 6 delikli plaka formatında 54 farklı deneysel koşulla veya mikroskopi için 150 deneysel koşulla (omurilikten sırasıyla 19 ve 64 ile karşılaştırıldığında) ilişkilidir. Bu nedenle, bu CNS kültürleri, gerekli fare sayısını azaltmak için harika bir araçtır16. Özellikle, 96 kuyucuklu format, hayvanlarda test edilmeden önce ilaç adaylarının taranmasını sağlamak ve bu tür çalışmalar için gerekli hayvan sayısını büyük ölçüde azaltmak gibi yüksek verimli analizler için kolayca kullanılabilir. Bu, umarım hayvanlarda CNS ilaçlarının test edilmesinin düşük başarı oranını artıracak ve insanlarda klinik çalışmalara çeviriyi geliştirecektir17,18.
Kültürler DIV21 ile en yüksek olgunluğa ulaşır. Hücre sayıları bu zaman noktasına kadar artar, bundan sonra hücreler her hücre tipinin azalan sayılarıyla dejenere olmaya başlar. Bu, hem niceliklendirilmiş hücre sayılarına (Şekil 2N) hem de piknotik çekirdeklerin sayısına (yoğun DAPI lekeleri) bakılarak ölçülmüştür (Şekil 2M). Gelişimsel belirteçler nestin ve NG2 hala DIV14 (Şekil 2G) ve DIV21 (Şekil 2J) üzerinde ifade edilirken, bunun nedeni bazı astrositlerin nestin19'u yukarı regüle eden astrogliozdan geçmesidir, bazı oligodendrositler ise tam olarak olgunlaşmamıştır ve bu nedenle hala bazı NG220'yi ifade eder. Mikroskopi doğrulamasına dayanarak, hücrelerin sadece küçük bir kısmı hala DIV21 tarafından tamamen olgun hücrelere kıyasla gelişimsel belirteçleri eksprese eder (Şekil 2I, L); Bu nedenle, kültürler bu zamana kadar büyük ölçüde olgunlaşmıştır. Not olarak, in vivo, mikroglia yoğunluğu, murin CNS boyunca oldukça değişkendir. Mikroglia seviyesi, mikroskopi kullanılarak Iba1 ekspresyonu ile tanımlandığı gibi, kültürlerimizde bu yoğunluğun en üst seviyesindedir12. Akış sitometri prosedüründen kurtulan mikroglia'nın yüksek yüzdesi, mikroglia'nın genellikle hassas uzantılara sahip olan diğer CNS hücrelerinden daha sağlam olmasından kaynaklanmaktadır ve bu nedenle akış sitometri hazırlığı sırasında hasar görme olasılığı daha yüksektir.
Diseksiyondan sonra hücreler deney için hazır olana kadar sadece 3 hafta sürer, bu da organoidler veya indüklenmiş pluripotent kök hücre türevi modeller gibi çoğu insan bazlı in vitro yöntemden daha kısadır21. Yeni terapötiklerin güvenliğini sağlamak için in vivo araştırmalara ihtiyaç duyulduğu sürece, bizimki gibi in vitro hücre kültürleme yöntemlerinin kullanılması, hayvanlarda test edilmeden önce toksisite ve etkinliğin verimli bir şekilde test edilmesine, hayvanlara olan ihtiyacın azaltılmasına ve araştırmanın in vitro'dan in vivo'ya çevrilmesinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.Umarım, bu sonunda insan temelli klinik çalışmalara da daha verimli bir çeviriye yol açacaktır. Sonuçta, bu kültürler CNS'nin çalışmasına izin vermek için yaratıldı. İn vitro sistemler CNS'nin karmaşıklığını tam olarak ifade edemezken, birincil hücre kaynaklı kültürler in vivo CNS özelliklerini daha doğru bir şekilde temsil eder22,23. İn vitro yaklaşımlar, bağışıklık hücrelerine sızma yokluğunda CNS'yi araştırmak için daha indirgeyici bir yaklaşıma izin verebilir24 ve kan-beyin bariyeri bütünlüğü25. Bu karmaşıklık katmanını ortadan kaldırmak, mekanizmaları çözmeyi kolaylaştırabilir. Bu nedenle, mevcut kültürleme sistemi, in vivo hayvan araştırmalarını tamamlayan araştırma sorularını cevaplamak için yararlı bir araçtır.
CNS hücrelerini hasat etme, izole etme ve kültürleme yeteneği, doğuştan gelen CNS16 hakkındaki anlayışımızı zaten büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu makale, E17 fare beyinlerinin diseksiyonunu ve CNS'nin tüm ana hücre tiplerini içeren bir hücre kültürü sistemi oluşturmak için hücrelerin tritürasyonunu ve kültürlenmesini göstermektedir. Bu kültürler üzerinde çoklu moleküler teknikler kullanılmış ve bu kültürlerin CNS'yi araştırmak için sahip oldukları etkinliği sergilemiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Edgar ve Linington laboratuvarlarının üyelerine, özellikle Prof. Chris Linington, Dr. Diana Arseni ve Dr. Katja Muecklisch'e, tavsiyeleri, yararlı yorumları ve bu kültürleri kurarken kültürleri beslemedeki yardımları için teşekkür ederiz. Hücre Profilcisi boru hatları için başlangıç noktaları sağladığı için Dr. Muecklisch'e özellikle teşekkür ederiz. Bu çalışma MS Derneği (hibe 122) ve Yuri ve Lorna Chernajovsky vakfı tarafından MP'ye desteklendi; Glasgow Üniversitesi'nin JC ve MP'ye fon sağlaması; ve Wellcome Trust (217093 / Z / 19 / Z) ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MRV0109721) GJG'ye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
