פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.
מודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) חייבים לשחזר את הרשת המורכבת של תאים מחוברים הנמצאים in vivo. מערכת העצבים המרכזית מורכבת בעיקר מנוירונים, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ותאי מיקרוגליה. בשל המאמצים הגוברים להחליף ולהפחית את השימוש בבעלי חיים, פותחו מגוון מערכות תרבית תאים במבחנה כדי לחקור תכונות תאים מולדות, המאפשרות פיתוח טיפולים לזיהומים ופתולוגיות במערכת העצבים המרכזית. בעוד ששאלות מחקר מסוימות יכולות להיות מטופלות על ידי מערכות תרבית תאים מבוססות אדם, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים (מושרים), לעבודה עם תאים אנושיים יש מגבלות משלה לגבי זמינות, עלויות ואתיקה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול ייחודי לבידוד וטיפוח תאים ממוחות עכברים עובריים. תרביות התאים העצביות המעורבות המתקבלות מחקות מספר אוכלוסיות תאים ואינטראקציות הנמצאות במוח in vivo. בהשוואה לשיטות המקבילות כיום, פרוטוקול זה מחקה באופן הדוק יותר את מאפייני המוח וגם מגייס יותר תאים, ובכך מאפשר לחקור יותר תנאי ניסוי מעכבר הרה אחת. יתר על כן, הפרוטוקול קל יחסית וניתן לשחזור מאוד. תרביות אלה עברו אופטימיזציה לשימוש בקני מידה שונים, כולל מסכי תפוקה גבוהה מבוססי 96 בארות, ניתוח מיקרוסקופיה של 24 בארות ותרביות 6 בארות לניתוח ציטומטריית זרימה ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-qPCR). שיטת תרבית זו היא כלי רב עוצמה לחקור זיהום וחסינות בהקשר של חלק מהמורכבות של מערכת העצבים המרכזית עם הנוחות של שיטות חוץ גופיות .
שיפור ההבנה שלנו של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא קריטי לשיפור האפשרויות הטיפוליות עבור מחלות נוירו-דלקתיות וניווניות רבות. מערכת העצבים המרכזית, רשת מורכבת של תאים המחוברים זה לזה במוח, בעמוד השדרה ובעצבי הראייה, כוללת נוירונים, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ותאי מערכת החיסון המולדת שלהם, מיקרוגליה1. גישה חוץ-גופית יכולה לעתים קרובות להפחית באופן דרסטי את מספר העכברים הדרושים לביצוע מחקר משמעותי; עם זאת, האופי המורכב של מערכת העצבים המרכזית אינו מאפשר לשחזר את המצב in vivo באמצעות קווי תאים. תרביות תאים עצביים מעורבים מספקות כלי מחקר בעל ערך רב לחקר שאלות נוירו(אימונו)לוגיות במודל רלוונטי, בהתאם לעקרונות החלפה, הפחתה ועידון (3Rs) 2,3.
תומסון ועמיתיו תיארו שיטת תרבית תאים המשתמשת בתאי חוט שדרה טרום לידתי המתמיינים לכל סוגי תאי CNS העיקריים שהוזכרו לעיל4. למערכת זו יש גם היווצרות סינפסות, אקסונים מיאלינטים וצמתים של Ranvier. המגבלה העיקרית של שיטת תרבית זו היא שבהיותו חוט השדרה, הוא אינו מודל שימושי של המוח, והתא מניב מיום עוברי 13 (E13) חוטי השדרה מתכווצים. לפיכך, זה מגביל את מספר תנאי הניסוי שניתן לחקור. לכן, מחקר זה נועד לפתח מערכת תרבית תאים חדשה המשחזרת את מאפייני המוח עם תפוקת תאים מוגברת כדי להפחית את הדרישות לבעלי חיים.
באמצעות תומסון ועמיתיו כנקודת מוצא, פיתחנו מודל של תרבית תאים שנגזר אך ורק ממוחות של עכברים לפני הלידה. לתרביות אלה יש את אותן אוכלוסיות תאים, קישוריות ואפשרויות טיפול כמו תרביות חוט השדרה, אלא שיש פחות מיאלינציה בהשוואה. עם זאת, מודל CNS in vitro עם תפוקת תאים גבוהה פי שלושה בקירוב הוא יעיל יותר, דורש פחות עכברים ופחות זמן עיבוד עוברים. ביצענו אופטימיזציה של מערכת תרביות ייחודית זו עבור יישומים ומאזניים מרובים במורד הזרם, כולל שימוש בכיסויי זכוכית לניתוח מיקרוסקופיה ובגדלים שונים של לוחות בארות פלסטיק, כולל לוחות 96 בארות למחקר בתפוקה גבוהה.
מערכת העצבים המרכזית היא רשת מורכבת המשתרעת מהמוח ועד חוט השדרה ומורכבת מסוגי תאים רבים, בעיקר נוירונים, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ומיקרוגליה1. מכיוון שלכל תא יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס וביצירת תגובות מתאימות לאתגרים במערכת העצבים המרכזית 9,10,11…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לחברי מעבדות אדגר ולינינגטון, במיוחד לפרופ’ כריס לינינגטון, ד”ר דיאנה ארסני וד”ר קטיה מוקליש, על עצותיהם, הערותיהם המועילות ועזרתם בהזנת התרבויות בזמן שהקמנו תרבויות אלה. תודה מיוחדת לד”ר Muecklisch על מתן נקודות ההתחלה עבור צינורות Cell Profiler. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה לטרשת נפוצה (מענק 122) וקרן יורי ולורנה צ’רניובסקי לפרלמנט; מימון אוניברסיטת גלזגו ל-JC ול-MP; ו-Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) ו-Medical Research Council (MRV0109721) ל-GJG.
10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |