Summary
Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.
Abstract
Modelos do sistema nervoso central (SNC) devem recapitular a complexa rede de células interconectadas encontradas in vivo. O SNC consiste principalmente de neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Devido aos crescentes esforços para substituir e reduzir o uso animal, uma variedade de sistemas de cultura de células in vitro tem sido desenvolvida para explorar propriedades celulares inatas, que permitem o desenvolvimento de terapêuticas para infecções e patologias do SNC. Embora certas questões de pesquisa possam ser abordadas por sistemas de cultura de células baseados em humanos, como células-tronco pluripotentes (induzidas), trabalhar com células humanas tem suas próprias limitações em relação à disponibilidade, custos e ética. Aqui, descrevemos um protocolo único para isolar e cultivar células de cérebros embrionários de camundongos. As culturas de células neurais mistas resultantes imitam várias populações de células e interações encontradas no cérebro in vivo. Em comparação com os métodos equivalentes atuais, este protocolo imita mais de perto as características do cérebro e também ganha mais células, permitindo assim que mais condições experimentais sejam investigadas a partir de uma rata grávida. Além disso, o protocolo é relativamente fácil e altamente reprodutível. Essas culturas foram otimizadas para uso em várias escalas, incluindo telas de alto rendimento baseadas em 96 poços, análise de microscopia de 24 poços e culturas de 6 poços para citometria de fluxo e análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR). Este método de cultura é uma ferramenta poderosa para investigar infecção e imunidade dentro do contexto de alguma complexidade do SNC com a conveniência de métodos in vitro .
Introduction
Melhorar nossa compreensão do sistema nervoso central (SNC) é fundamental para melhorar as opções terapêuticas para muitas doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas. O SNC, uma rede complexa de células interconectadas dentro do cérebro, medula espinhal e nervos ópticos, compreende neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e suas células imunes inatas, a microglia1. Uma abordagem in vitro pode muitas vezes reduzir drasticamente o número de camundongos necessários para realizar pesquisas significativas; no entanto, a natureza complexa do SNC torna impossível recapitular a situação in vivo usando linhagens celulares. Culturas mistas de células neurais fornecem uma ferramenta de pesquisa extremamente valiosa para investigar questões de neuro(imuno)logia em um modelo relevante, de acordo com os princípios de Substituição, Redução e Refinamento (3Rs)2,3.
Thomson e col. descreveram um método de cultura celular utilizando células pré-natais da medula espinhal que se diferenciam em todos os principais tipos celulares do SNC jámencionados4. Este sistema também tem formação de sinapses, axônios mielinizados e nós de Ranvier. A principal limitação deste método de cultura é que, sendo a medula espinhal, ele não modela utilmente o cérebro, e os rendimentos celulares a partir do 13º dia embrionário (E13) medulares são constritores. Assim, isso limita o número de condições experimentais que podem ser investigadas. Portanto, este estudo teve como objetivo desenvolver um novo sistema de cultura celular que recapitule as características do cérebro com aumento do rendimento celular para reduzir as exigências para animais.
Usando Thomson et al., como ponto de partida, desenvolvemos um modelo de cultura celular derivado puramente de cérebros pré-natais de camundongos. Essas culturas têm as mesmas populações celulares, interconectividade e opções de tratamento que as culturas da medula espinhal, exceto que há menos mielinização em comparação. No entanto, ter um modelo in vitro do SNC com um rendimento celular aproximadamente três vezes maior é mais eficiente, exigindo menos camundongos e menos tempo de processamento de embriões. Otimizamos este sistema de cultura exclusivo para várias aplicações e escalas downstream, incluindo o uso de lamínulas de vidro para análise de microscopia e vários tamanhos de placas de poço plástico, incluindo placas de 96 poços para pesquisa de alto rendimento.
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Protocol
Todos os experimentos com animais cumpriram as leis e diretrizes locais para uso de animais e foram aprovados pelo Comitê de Revisão Ética local da Universidade de Glasgow. Os animais foram alojados em condições específicas livres de patógenos de acordo com o UK Animals Scientific Procedures Act 1986, sob os auspícios de uma Licença de Projeto do Ministério do Interior do Reino Unido. Para este estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6J adultos criados internamente. O uso de fêmeas jovens (8-12 semanas) é recomendado devido à maior taxa de sucesso da gravidez; Os machos podem ser reutilizados para várias rodadas de reprodução. A Figura 1 representa uma visão geral esquemática do método descrito para gerar culturas mistas neuronal e glial.
1. Preparação dos consumíveis para cultura de tecidos
- Prepare as placas e/ou pratos contendo lamínulas de microscopia dentro de um armário de segurança Classe 2. Esterilizar todos os reagentes ou autoclave para garantir a esterilidade durante o período de cultura.
- Adicionar o volume apropriado de BA-PLL (13,2 μg/mL de poli-L-lisinaidrobrometo [PLL] em tampão de ácido bórico [BA] [ácido bórico 50 mM, tetraborato de sódio 12,5 mM, pH 8,5]; ver Tabela de Materiais) a cada poço (1.000 μL/poço em uma placa de 6 poços, 100 μL/poço em uma placa de 96 poços; os volumes estão resumidos na Tabela 1). Para as lamínulas de microscopia, adicionar 20 mL de BA-PLL a uma placa de cultura de tecidos de 9 cm de diâmetro contendo 200 lamínulas estéreis e girar para distribuir uniformemente.
- Incubar a 37 °C durante 1-2 h.
- Remova a solução BA-PLL de cada poço ou prato contendo lamínulas de microscopia e lave adicionando 20 mL de água estéril, girando as lamínulas e, em seguida, removendo a água. Repita esta etapa de lavagem três vezes. Para um prato contendo lamínulas, deixe água estéril na placa de cultura de tecidos na lavagem final para remover facilmente as lamínulas.
- Retire o máximo de líquido possível com uma pipeta estéril e deixe secar por pelo menos 2 h durante a noite.
- Conservar as placas revestidas a 4 °C durante um período máximo de 2 meses.
NOTA: O ácido bórico preparado com solução de poli-l-lisina (BA-PLL) pode ser reutilizado até três vezes, adicionando novo PLL a cada vez. Conservar o BA-PLL a 4 °C. Os pratos são tratados com BA-PLL, pois o PLL permite que as células grudem e cresçam. Sem esse tratamento, as células se levantam após aproximadamente 1 semana de cultura e não conseguem mais se diferenciar.
2. Dissecção de cérebros embrionários E17
- Co-abrigar um ou vários camundongos fêmeas com um camundongo macho. Verifique as fêmeas diariamente para um tampão de muco, indicando que o acasalamento ocorreu.
NOTA: Qualquer camundongo fêmea "plugado" precisa ser separado do macho para garantir a data correta de início da gestação. Os ratos podem ser pesados para confirmar a gravidez ou monitorados visualmente. - Cull a rata prenhe no E17 usando métodos apropriados em conformidade com as diretrizes e leis locais de bem-estar animal, por exemplo, aumentando a concentração de dióxido de carbono (CO2), uma overdose letal de anestésico ou luxação do pescoço.
NOTA: O método escolhido não deve perturbar os embriões. Para este estudo, a exposição a uma concentração crescente de gás carbônico seguida da confirmação de morte por corte da artéria femoral foi usada para abater fêmeas grávidas. - Coloque o rato prenhe abatido de costas em uma placa de dissecação; Embora não seja necessário fixá-lo, pode facilitar para pesquisadores inexperientes. Aperte a linha média do abdômen usando pinças. Usando tesouras afiadas, abra o abdômen através da pele e do peritônio sobre a linha média da genitália até a caixa torácica, tomando cuidado para não perfurar o útero.
- O útero de camundongo tem dois chifres, cada um contendo de um a cinco embriões. Retire o útero que contém os embriões da mãe e coloque-o imediatamente no gelo.
- Corte o saco vitelino na lateral das placentas, tomando cuidado para não danificar os embriões, e retire os embriões do saco vitelino.
- Decapitar imediatamente os embriões. Adicione as cabeças decapitadas em um prato com solução salina balanceada de Hanks (HBSS) sem cálcio (Ca 2+) e magnésio (Mg2+) (HBSS-/-) no gelo.
NOTA: Se a genotipagem for necessária, pode-se remover a cauda nesta fase para análise genética. Quando múltiplos genótipos são esperados, as cabeças de cada embrião devem ser mantidas separadamente para cultivo. - Usando pinça angulada, posicione a cabeça de lado voltada para a esquerda.
- Perfure o olho com uma borda da pinça, segurando firmemente o queixo com a outra.
- Começando pela nuca, rasgue suavemente a pele do couro cabeludo ao longo da linha média em direção à ponta do focinho.
- Entrando pela medula espinhal, perceptível como um oval branco, use a pinça angulada para abrir o crânio ao longo da linha média, expondo o cérebro.
- Descasque suavemente o crânio do lado voltado para cima, expondo o cérebro.
- Levante o cérebro para fora do crânio, descartando o crânio uma vez que o cérebro foi completamente removido.
- Usando o fórceps, remova as meninges, que são perceptíveis como uma membrana fina com vasos sanguíneos densos.
- Coloque os cérebros em um bijou (ver Tabela de Materiais) contendo 2 mL de HBSS-/- no gelo.
- Repita as etapas 2.6 a 2.13 com os cérebros restantes, somando até quatro cérebros por bijuteria.
- Adicione 250 μL de tripsina 10x ao bijou e triture os cérebros agitando o bijou. Incubar durante 15 min a 37 °C.
NOTA: Todos os passos a partir deste ponto devem ser realizados em uma capa de cultura de tecidos estéril. - Descongelar 2 mL de inibidor de tripsina (SD) de soja (Leibovitz L-15, 0,52 mg/mL inibidor de tripsina de soja, 40 μg/mL DNase I, 3 mg/mL de albumina de soro bovino [BSA] fração V; ver Tabela de Materiais) de -20 °C, colocando-o a 37 °C.
- Adicione 2 mL de inibidor de SD a cada bijou contendo cérebros (por bijou contendo até quatro cérebros), agitando o bijou novamente para dispersá-lo uniformemente.
NOTA: O inibidor SD diminui a atividade da tripsina para evitar a digestão desnecessária das amostras e preservar a viabilidade celular. - Sem centrifugação, retirar 2 mL do sobrenadante de cada bijutê e transferir para um tubo centrífugo de 15 mL, tomando cuidado para não transferir aglomerados celulares.
- Triturar as células restantes no bijuteria com uma agulha de 19 G acoplada a uma seringa de 5 mL aspirando a suspensão duas vezes. Isso criará uma mistura espessa semelhante a muco.
- Repita mais duas vezes com uma agulha de 21 G. Se houver aglomerados remanescentes, triture mais uma vez com a agulha de 21 G.
- Transferir as células do bijuteria para o mesmo tubo de centrífuga de 15 ml (do passo 2.18) utilizando uma agulha de 23 G.
- Centrifugar a 200 x g à temperatura ambiente (TR) durante 5 min.
- Remova todo o sobrenadante usando uma pipeta sorológica de 5 mL e transfira-o para outro tubo centrífugo de 15 mL, tomando cuidado para não perturbar a pastilha solta no fundo contendo as células necessárias.
- Centrifugar novamente o sobrenadante a 200 x g em RT por 5 min.
NOTA: Esta etapa não é essencial, mas se alguém requer muitas células ou tem poucos embriões, pode-se realizar esta etapa para recuperar o maior número possível de células do sobrenadante. - Usando 10 mL de meio de plaqueamento (PM) (49% meio águia modificado de Dulbecco [DMEM], 1% penicilina/estreptomicina [Pen/Strep], 25% de soro de cavalo, 25% HBSS com Ca 2+ e Mg2 + [HBSS+ /+]; ver Tabela de Materiais), combine e ressuspenda os dois pellets juntos para criar uma suspensão de célula inteira.
- Contar as células usando azul de tripano e um hemocitômetro ou contador de células digital e diluir a suspensão celular com PM até uma concentração de 1,8 x 106 células/mL.
3. Plaing as células
- Adicione o volume necessário da suspensão celular ao formato requerido, conforme detalhado na Tabela 1: 1.000 μL por poço no formato de 6 poços, 50 μL por poço no formato de 96 poços ou 100 μL por lamínula.
- Incubar durante 2-4 h a 37 °C com 5%-7% CO2. Verifique se as células aderiram usando um microscópio invertido.
- Retirar o meio e completar com novo meio de diferenciação (DM+: DM- incluindo 10 μg/mL de insulina. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM hidrocortisona, 10 ng/mL biotina, 2,5 mL 100x N1 suplemento de mídia; ver Tabela de Materiais). Os volumes estão detalhados na Tabela 1. Pressione qualquer tampa flutuante usando uma ponta de pipeta estéril.
4. Manutenção das culturas
NOTA: Estas culturas requerem alimentação três vezes por semana para suportar o crescimento ideal e diferenciação. As culturas atingirão sanidade e maturidade ótimas para experimentos em DIV (dias in vitro) 21. As células podem ser mantidas em cultura por até 28 dias, após os quais as culturas degeneram rapidamente.
- Três vezes por semana até DIV12, substituir parte do sobrenadante por DM+ fresco, removendo 500 μL por poço no formato de 6 poços, 50 μL por poço no formato de 96 poços ou 500 μL por prato contendo três lamínulas e adicionando 600 μL por poço no formato de 6 poços, 60 μL por poço no formato de 96 poços, ou 600 μL por placa de cobertura (Tabela 1).
- Três vezes por semana, a partir da DIV13, substituir parte do sobrenadante por DM- fresco, removendo 500 μL por poço no formato de 6 poços, 50 μL por poço no formato de 96 poços ou 500 μL por prato contendo três lamínulas e adicionando 600 μL por poço no formato de 6 poços, 60 μL por poço no formato de 96 poços, ou 600 μL por placa de cobertura (Tabela 1).
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Representative Results
Microscopia
Culturas cultivadas em lamínulas de vidro são ideais para análise por microscopia. Para visualizar o desenvolvimento das culturas, as lamínulas foram fixadas em paraformaldeído (PFA) a 4% em múltiplos momentos, desde a DIV0 (uma vez que as células foram fixadas) até a DIV28. As culturas foram coradas para imagem de imunofluorescência, conforme previamentedescrito5 , utilizando três diferentes combinações de colorações: NG2 (oligodendrócitos imaturos) e nestina (células-tronco neuronais/progenitoras) como marcadores de desenvolvimento, SMI31 (axônios), PAM (mielina) e NeuN (corpo celular do neurônio) como marcadores neuronais, ou CNP (oligodendrócitos), GFAP (astrócitos) e Iba1 (microglia) como marcadores gliais (Figura 2).
Os vários tipos celulares foram quantificados usando pipelines CellProfiler (baseados em ′,6-diamidino-2-fenilindol-positivo (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). Cada ponto de dados individual foi gerado a partir de uma média de 10 imagens tiradas de três lamínulas por timepoint. Para micróglia, neurônios e oligodendrócitos, foi calculada a porcentagem de tipo celular por célula positiva para 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI+). O campo de visão percentual foi utilizado em vez do número de células para quantificar o número de astrócitos. Isso ocorreu devido à dificuldade de diferenciação entre as células individuais, uma vez que elas frequentemente se sobrepunham (Figura 2M,N). As culturas atingiram o pico de maturidade e densidade celular no DIV21, após o que as culturas começaram a degradar (Figura 2N).
É importante ressaltar que essas culturas podem ser facilmente tratadas com drogas, como potenciais terapêuticas, ou usadas para rastrear infecções in vitro . Neste exemplo, culturas em lamínulas foram transferidas para uma placa de 24 poços e infectadas com o vírus altamente neurotrópico Semliki Forest virus (SFV) (cepa SFV6)6, que expressa zsGreen em células infectadas. Uma multiplicidade de infecção (MOI - o número de partículas virais adicionadas por célula) de 0,05, titulada em células de rim de hamster bebê (BHK), foi usada para garantir infecção de baixo nível. Após 0-72 h pós-infecção (HPP), as culturas foram fixadas em PFA 4% e coradas para análise por imagem por imunofluorescência. A Figura 3 ilustra que, de acordo com a infecção in vivo , o SFV infecta principalmente oligodendrócitos e neurônios6.
qRT-PCR
Além da microscopia, essas culturas do SNC podem ser usadas para análise por métodos moleculares, como RT-qPCR das respostas de RNAm ao tratamento. Para investigar melhor a resposta antiviral inata, culturas de placas de 6 poços foram tratadas com uma variedade de doses da potente citocina antiviral interferon beta (IFN-β) por 24 horas. As culturas foram lisadas com guanídio-tiocianato/fenol, e o RNA foi isolado, convertido em cDNA e analisado por qPCR como descrito anteriormente7. Usando este método, a expressão diferencial de muitos genes pode ser medida. Aqui, a upregulation de Ccl5 foi quantificada contra o gene housekeeping 18s. CCL5 é uma citocina quimiotática (quimiocina) envolvida na resposta inflamatória. O tratamento com IFN-β resultou em uma upregulation do mRNA de Ccl5 nas culturas (Figura 4A).
Ensaio imunoenzimático (ELISA)
O formato de culturas de 96 poços é uma excelente ferramenta para triagens de alto rendimento de tratamentos. Para investigar se a upregulation do mRNA de Ccl5 resulta na expressão da proteína CCL5, CCL5 foi medido no sobrenadante das culturas por ELISA, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Neste exemplo, culturas de 96 poços foram tratadas em duplicata com 27 doses incrementais de IFN-β para gerar uma curva dose-resposta (Figura 4B). Em consonância com o aumento da expressão do RNAm (Figura 4A), houve um aumento na liberação de CCL5 no sobrenadante. Como esperado, a Figura 4C demonstra uma clara correlação entre RNAm e expressão proteica.
Citometria de fluxo
A citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa para investigar simultaneamente a expressão de muitos marcadores intra e/ou extracelulares. No entanto, a análise de culturas complexas e altamente interativas por citometria de fluxo pode ser um desafio devido ao dano e morte celular ao levar células de cultura para uma suspensão unicelular para processamento e análise. Comparando uma variedade de protocolos usando 0,05%-0,5% de tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA), 1x-10x tripsina sem EDTA e reagente de dissociação suave, verificou-se que, após tratar as culturas de placas de 6 poços com tripsina-EDTA a 0,05% por 10 min a 37 °C com agitação suave, as células foram levantadas com trituração suave para criar uma suspensão de célula única. Especialmente para a análise por citometria de fluxo de células do SNC, é fundamental ser suave durante a preparação celular, minimizar as etapas de lavagem e tomar muito cuidado para manter as células a 4 °C ou no gelo o tempo todo.
Para avaliar a viabilidade e os tipos celulares nessa suspensão unicelular, as células foram coradas com corante de viabilidade e marcadores fluorescentes anticorpos contra CD45, CD11b, O4, ACSA-2 e CD24 para permitir a visualização de cada população celular individual nas culturas8 (Figura 5). Cerca de 70% de viabilidade celular foi obtida a partir deste método, com média de aproximadamente 2 x 10 6 células únicas viáveis por placa de6 poços (Figura 5C). De acordo com os resultados da microscopia (Figura 2N), houve grande número de micróglias, neurônios e astrócitos, enquanto oligodendrócitos foram os menos abundantes.
Figura 1: Visão geral esquemática do método descrito para gerar culturas neuronais e gliais mistas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Culturas do SNC E17 coradas para marcadores celulares de imagem por imunofluorescência ao longo do tempo. As células foram fixadas com PFA a 4% antes de serem permeabilizadas e coradas para visualização das diferentes populações. Imagens representativas dos marcadores de desenvolvimento (A,D,G,J,M) NG2 (células precursoras de oligodendrócitos) e nestina (células precursoras neuronais e gliais), (B,E,H,K,N) marcadores neuronais SMI31 (axônios), MBP (mielina) e NeuN (corpo celular do neurônio), e (C,F,I,L,O) MARCADORES GLIAIS CNP (OLIGODENDRÓCITOS), GFAP (ASTRÓCITOS) E Iba1 (micróglia). Barras de escala = 50 μm. (P) Contagens de DAPI por mm2, n = 3, cada n a partir de triplicatas técnicas de 10 imagens por triplicata. (Q) Contagem de células como porcentagem de células DAPI+ (micróglia, oligodendrócitos e neurônios) e porcentagem do campo de visão (astrócitos), n = 3, cada n a partir de triplicatas técnicas de 10 imagens por triplicata. As barras de erro são ± erro padrão da média (EPM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Infecção pelo vírus da floresta de Semliki (SFV) em culturas do SNC E17 ao longo do tempo. Imagens representativas de culturas controle não infectadas (A,C,E,G) e culturas infectadas com 0,05 MOI SFV (B,D,F,H). As células foram infectadas por 0-48 h e coradas com CNP (marcador de oligodendrócitos) e NeuN (marcador de neurônio) (A-D) ou GFAP (marcador de astrócitos) e Iba1 (marcador microglial) (E-H). As setas brancas indicam uma célula infectada. Esta cepa de SFV expressa a proteína fluorescente verde zsGreen para permitir o rastreamento da infecção viral. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: RNAm de CCL5 e expressão proteica de culturas de SNC E17 após tratamento com IFN-β. As células foram tratadas em formato de placa de 6 poços (mRNA) ou placa de 96 poços (proteína) por 24 h com uma faixa de doses de IFN-β. (A) Expressão de mRNA de Ccl5 após tratamento com 0-100 ng/mL de IFN-β, n biológico = 2, cada um retirado de triplicatas técnicas. (B) Concentração de CCL5 no sobrenadante após tratamento com 0-100 ng/mL de IFNβ, n biológico = 1, retirado de triplicatos técnicos. (C) Suprarregulação celular do RNAm Ccl5 versus concentração da proteína CCL5 no sobrenadante com linha de tendência logarítmica. As barras de erro são ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Estratégia de acoplamento por citometria de fluxo para gerar populações unicelulares a partir de culturas de SNC E17. As células foram dissociadas usando tripsina-EDTA a 0,05%, coradas com anticorpos apropriados e classificadas em populações celulares individuais. (A-C) Estratégia de Gating para classificar para células vivas e únicas. (D) Estratégia para seleção de micróglia (CD45+ CD11b+). (E) Estratégia para seleção de oligodendrócitos (CD45- CD11b- O4+). (F) Estratégia de classificação de astrócitos (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+ CD24+) e neurônios (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) Populações celulares individuais sobrepostas umas às outras, mostrando populações discretas. (H) Tipos celulares individuais em percentagem do total de células classificadas, n = 4. As barras de erro são ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Formato necessário | BA-PLL/poço | Água para lavagem | Células de volume em Mídia de chapeamento (PM) para chapear para fora | Recarga de mídia | Remover/adicionar ao alimentar culturas (3x/semana) |
| Formato de 6 poços (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL Meios |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| Formato de 96 poços (0,32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL DM+ | -50 μL Meios |
| +60 μL DM+/- | |||||
| Tampa em formato de prato | 20 mL por 200 lamínulas | 20 mL | 100 μL por lamínula | +600 μL DM+ | -500 μL Meios |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
Tabela 1: Volumes necessários para preparação de plásticos revestidos para cultura de tecidos.
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Discussion
O SNC é uma rede complexa que se estende do cérebro até a medula espinhal e consiste de vários tipos celulares, predominantemente neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e microglia1. Como cada célula tem um papel importante na manutenção da homeostase e na geração de respostas adequadas aos desafios no SNC 9,10,11, um sistema de cultura que contenha todos esses tipos celulares é uma ferramenta útil e versátil para investigar como o cérebro pode reagir a um estímulo. A capacidade de estudar essas células, e suas interações, em um contexto in vitro significa que uma grande variedade de técnicas pode ser empregada para investigar várias questões experimentais facilmente. Delineamos um método rápido e eficiente para obter e cultivar os principais tipos de células do SNC a partir do cérebro pré-natal, que pode mimetizar populações celulares individuais no cérebro de camundongos adultos12.
Protocolos previamente estabelecidos para a geração de culturas do SNC utilizam a medula espinhal E13.5 4,5. Além de ter um modelo adequado para a medula espinhal, é altamente relevante ter um modelo que recapitule o cérebro. Portanto, cérebros desses camundongos E13.5 foram originalmente usados para gerar as culturas do SNC aqui descritas usando o mesmo protocolo. No entanto, após a DIV14, as células começaram a formar grandes agregados com corpos celulares neuronais densamente empacotados. Embora os astrócitos estivessem presentes, não está claro se eles estavam distribuídos uniformemente. Não está claro se as células no centro desses corpos celulares receberiam nutrientes e oxigênio suficientes do meio de cultura como as células de fora receberiam. Ao experimentarem privação de oxigênio e nutrientes, os neurônios estão sujeitos a passar por apoptose e liberar sinais de estresse para as células gliais13, o que pode levar a um fenótipo pró-inflamatório14. Acreditava-se que a neurogênese fosse uma provável causa desses agregados densamente compactados, e essa fase diminui com E1715. Quando cérebros de embriões de camundongos E17 foram usados, as células ainda formavam redes, mas não se agrupavam nos grandes agregados vistos em E13.5, e, portanto, eram consideradas como uma idade mais adequada para as culturas cerebrais a serem geradas.
A técnica atual também resulta em maior número de células obtidas de uma gestação (média de 1 x 10 7 células/cérebro em comparação com 3-4 x 106 células/medula espinhal)7. Para uma rata prenhe média com 8-10 embriões, isso se correlaciona com até 54 condições experimentais diferentes no formato de placa de 6 poços, ou 150 condições experimentais para microscopia (em comparação com 19 e 64, respectivamente, da medula espinhal). Como tal, essas culturas de SNC são uma ótima ferramenta para reduzir o número necessário de camundongos16. Em particular, o formato de 96 poços pode ser facilmente usado para ensaios de alto rendimento, como permitir a triagem de candidatos a medicamentos antes dos testes em animais, reduzindo consideravelmente o número de animais necessários para tais estudos. Espera-se que isso melhore a baixa taxa de sucesso dos testes de drogas do SNC em animais e melhore a tradução para ensaios clínicos em humanos17,18.
As culturas atingem o pico de maturidade por DIV21. As contagens de células aumentam até este ponto de tempo, após o qual as células começam a degenerar com números decrescentes de cada tipo de célula. Isso foi medido tanto observando o número de células quantificadas (Figura 2N) quanto o número de núcleos picnóticos (colorações DAPI densas) (Figura 2M). Embora os marcadores de desenvolvimento nestina e NG2 ainda estejam expressos em DIV14 (Figura 2G) e DIV21 (Figura 2J), isso se deve ao fato de alguns dos astrócitos passarem por astrogliose, que regula positivamente a nestina19, enquanto alguns dos oligodendrócitos não estão totalmente maduros e, portanto, ainda expressam alguma NG220. Com base na validação microscópica, apenas uma pequena parcela das células ainda expressa marcadores de desenvolvimento em comparação com as células totalmente maduras pela DIV21 (Figura 2I,L); portanto, as culturas estão em grande parte maduras por esta altura. É importante notar que, in vivo, a densidade da micróglia é altamente variável em todo o SNC murino. O nível de micróglia, definido pela expressão de Iba1 por microscopia, encontra-se no limite superior dessa densidade em nossas culturas12. A alta porcentagem de micróglias que sobrevivem ao procedimento de citometria de fluxo é provavelmente devido à micróglia ser mais robusta do que outras células do SNC, que geralmente têm extensões delicadas e, portanto, são mais propensas a serem danificadas durante a preparação da citometria de fluxo.
Leva apenas 3 semanas após a dissecção até que as células estejam prontas para experimentação, que é mais curta do que a maioria dos métodos in vitro baseados em humanos, como organoides ou modelos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas21. Enquanto a pesquisa in vivo for necessária para garantir a segurança de novas terapêuticas, o uso de métodos de cultura celular in vitro como o nosso ajudará a testar toxicidade e eficácia de forma eficiente antes de testar em animais, reduzindo a necessidade de animais e melhorando a tradução da pesquisa de in vitro para in vivo. Esperançosamente, isso acabará levando a uma tradução mais eficiente para ensaios clínicos baseados em humanos também. Em última análise, essas culturas foram criadas para permitir o estudo do SNC. Enquanto os sistemas in vitro não conseguem expressar completamente a complexidade do SNC, as culturas primárias derivadas de células representam com maior precisão as propriedades in vivo do SNC22,23. Abordagens in vitro podem permitir uma abordagem mais redutora para investigar o SNC na ausência de células imunes infiltrantes24 e a integridade da barreira hematoencefálica25. Remover essa camada de complexidade pode facilitar o desvendar de mecanismos. Como tal, o presente sistema de cultivo é uma ferramenta útil para responder a perguntas de pesquisa que complementam a pesquisa in vivo com animais.
A capacidade de colher, isolar e cultivar células do SNC já avançou muito nossa compreensão do SNC inato16. Este artigo demonstra a dissecção de cérebros de camundongos E17 e a trituração e cultura resultantes das células para gerar um sistema de cultura celular contendo todos os principais tipos celulares do SNC. Múltiplas técnicas moleculares têm sido empregadas nessas culturas, mostrando a eficácia dessas culturas na investigação do SNC.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos membros dos laboratórios Edgar e Linington, particularmente ao Prof. Chris Linington, à Dra. Diana Arseni e à Dra. Katja Muecklisch, por seus conselhos, comentários úteis e assistência com a alimentação das culturas enquanto criamos essas culturas. Um agradecimento especial ao Dr. Muecklisch por fornecer os pontos de partida para os pipelines do Cell Profiler. Este trabalho foi apoiado pela Sociedade MS (bolsa 122) e pela fundação Yuri e Lorna Chernajovsky para MP; Financiamento da Universidade de Glasgow para JC e MP; e Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) e Medical Research Council (MRV0109721) para GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
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