Summary
该协议提供了一种从胚胎第17天小鼠大脑生成中枢神经系统细胞培养物的独特方法，用于神经（免疫）学研究。该模型可以使用各种实验技术进行分析，包括RT-qPCR，显微镜，ELISA和流式细胞术。
Abstract
中枢神经系统（CNS）的模型必须概括 体内发现 的相互连接的细胞的复杂网络。中枢神经系统主要由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞组成。由于越来越多的努力替代和减少动物的使用，已经开发了各种 体外 细胞培养系统来探索先天细胞特性，从而可以开发针对CNS感染和病理的治疗方法。虽然某些研究问题可以通过基于人类的细胞培养系统来解决，例如（诱导的）多能干细胞，但与人类细胞一起工作在可用性、成本和伦理方面有其自身的局限性。在这里，我们描述了一种从胚胎小鼠大脑中分离和培养细胞的独特方案。由此产生的混合神经细胞培养物模拟 体内大脑中发现的几种细胞群和相互作用。与目前的等效方法相比，该协议更接近于模拟大脑的特征，并且还获得了更多的细胞，从而允许从一只怀孕的小鼠中研究更多的实验条件。此外，该协议相对容易且高度可重复。这些培养物已经过优化，可用于各种规模，包括基于 96 孔的高通量筛选、24 孔显微镜分析和用于流式细胞术和逆转录定量聚合酶链反应 （RT-qPCR） 分析的 6 孔培养物。这种培养方法是在CNS的一些复杂性背景下研究感染和免疫力的有力工具，并且体 外 方法很方便。
Introduction
提高我们对中枢神经系统（CNS）的理解对于改善许多神经炎症和神经退行性疾病的治疗选择至关重要。中枢神经系统是大脑、脊髓和视神经内相互连接的细胞的复杂网络，包括神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞及其先天免疫细胞小胶质细胞1。 体外 方法通常可以大大减少进行有意义研究所需的小鼠数量;然而，CNS的复杂性使得不可能使用细胞系概括 体内 情况。混合神经细胞培养物提供了一种非常有价值的研究工具，用于研究相关模型中的神经（免疫）学问题，符合替换、减少和改进（3Rs）原则2，3。
Thomson等人描述了一种使用产前脊髓细胞分化为上述所有主要CNS细胞类型4的细胞培养方法。该系统还具有突触形成，髓鞘轴突和Ranvier节点。这种培养方法的主要局限性是，作为脊髓，它不能有效地模拟大脑，并且胚胎第13天（E13）脊髓的细胞产量正在收缩。因此，这限制了可以研究的实验条件的数量。因此，本研究旨在开发一种新的细胞培养系统，通过提高细胞产量来概括大脑的特征，以减少对动物的需求。
以Thomson等人为起点，我们开发了一种纯粹来自产前小鼠大脑的细胞培养模型。这些培养物具有与脊髓培养物相同的细胞群、互连性和治疗选择，只是相比之下髓鞘形成较少。然而，具有大约三倍细胞产量的CNS 体外 模型更有效，需要更少的小鼠和更少的胚胎处理时间。我们针对多种下游应用和规模优化了这种独特的培养系统，包括使用玻璃盖玻片进行显微镜分析，以及使用各种尺寸的塑料孔板，包括用于高通量研究的 96 孔板。
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Protocol
所有动物实验均符合当地动物使用法律和准则，并得到格拉斯哥大学当地伦理审查委员会的批准。根据1986年英国动物科学程序法，在英国内政部项目许可证的主持下，动物被饲养在特定的无病原体条件下。在这项研究中，使用了内部繁殖的成年C57BL / 6J小鼠。由于怀孕成功率较高，建议使用年轻女性（8-12周）;雄性可以重复使用进行多轮繁殖。 图1 表示所述生成混合神经元和神经胶质培养物的方法的示意图。
1. 组织培养耗材的制备
- 在 2 类安全柜内准备装有显微镜盖玻片的板和/或培养皿。对所有试剂或高压灭菌器进行灭菌，以确保培养期间无菌。
- 向每个孔中加入适当体积的 BA-PLL（13.2 μg/mL 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 [PLL] 中的硼酸缓冲液 [BA] [50 mM 硼酸，12.5 mM 四硼酸钠，pH 8.5];参见 材料表）（6 孔板中为 1，000 μL/孔，96 孔板中为 100 μL/孔; 表 1 总结了体积）。对于显微镜盖玻片，将 20 mL BA-PLL 加入包含 200 张无菌盖玻片的 9 cm 直径组织培养皿中，并涡旋以均匀分布。
- 在37°C孵育1-2小时。
- 从每个孔或含有显微镜盖玻片的培养皿中取出BA-PLL溶液，并通过加入20 mL无菌水，旋转盖玻片，然后除去水来洗涤。重复此洗涤步骤三次。对于含有盖玻片的培养皿，在最后一次洗涤时将无菌水留在组织培养皿中，以便轻松去除盖玻片。
- 用无菌移液管尽可能多地去除液体，并干燥至少2小时至过夜。
- 将涂层板在4°C下储存长达2个月。
注意：制备的硼酸与聚-l-赖氨酸（BA-PLL）溶液最多可重复使用三次，每次添加新的PLL。将BA-PLL储存在4°C。 培养皿用BA-PLL处理，因为PLL允许细胞粘附并生长。如果没有这种处理，细胞将在培养约1周后提升，不再能够分化。
2. 解剖E17胚胎脑
- 与雄性小鼠共同容纳一只或多只雌性小鼠。每天检查雌性是否有粘液栓，表明已经交配。
注意：任何“堵塞”的雌性小鼠都需要与雄性小鼠分开，以确保正确的妊娠开始日期。可以称量小鼠以确认怀孕或目视监测。 - 使用符合当地动物福利指南和法律的适当方法在E17上剔除怀孕小鼠，例如，通过提高二氧化碳（CO2）浓度，致命麻醉剂过量或颈部脱臼。
注意：所选择的方法不得破坏胚胎。在这项研究中，暴露于浓度上升的二氧化碳气体中，然后通过切断股动脉确认死亡，用于扑杀怀孕的水坝。 - 将被淘汰的怀孕小鼠背放在解剖板上;虽然不需要固定它，但它可能会让没有经验的研究人员更容易。用镊子捏住腹部的中线。使用锋利的剪刀，从生殖器到胸腔的中线通过皮肤和腹膜切开腹部，注意不要刺穿子宫。
- 小鼠子宫有两个角，每个角通常包含一到五个胚胎。从母亲身上取出含有胚胎的子宫，并立即将其放在冰上。
- 切开胎盘侧面的蛋黄袋，注意不要损坏胚胎，然后将胚胎从蛋黄袋中取出。
- 立即将胚胎斩首。将斩首的头加入装有汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的盘中，不含钙（Ca 2+）和镁（Mg2+）（HBSS-/-）。
注意：如果需要基因分型，可以在此阶段去除尾巴进行遗传分析。当预期有多个基因型时，应单独保存每个胚胎的头部以进行培养。 - 使用倾斜的镊子，将头部朝左放置。
- 用镊子的一个边缘刺穿眼睛，用另一个边缘牢牢地握住下巴。
- 从颈背开始，沿着中线向鼻尖轻轻撕裂头皮的皮肤。
- 通过脊髓进入，明显为白色椭圆形，使用倾斜的镊子沿着中线打开头骨，露出大脑。
- 轻轻地将头骨朝上一侧剥开，露出大脑。
- 将大脑从颅骨中取出，一旦大脑被完全移除，就处理掉头骨。
- 使用镊子去除脑膜，脑膜明显为具有致密血管的薄膜。
- 将大脑放入含有2mL HBSS-/-的冰上。
- 用剩余的大脑重复步骤2.6到2.13，每个bijou最多四个大脑。
- 向bijou中加入250μL 10x胰蛋白酶，并通过摇动bijo来研磨大脑。在37°C孵育15分钟。
注意：从这一点开始的所有步骤都应在无菌组织培养罩中进行。 - 将2mL大豆胰蛋白酶（SD）抑制剂（Leibovitz L-15，来自大豆的0.52mg / mL胰蛋白酶抑制剂，40μg/ mL脱氧核糖核酸酶I，3mg / mL牛血清白蛋白[BSA]级分V;见 材料表）从-20°C解冻，将其置于37°C。
- 向每个包含大脑的bijou中加入2mL SD抑制剂（每个bijou最多包含四个大脑），再次摇动bijou以使其均匀分散。
注意：SD抑制剂降低胰蛋白酶活性，以防止不必要的样品消化并保持细胞活力。 - 在不离心的情况下，从每个bijou中取出2 mL上清液并转移到15 mL离心管中，注意不要转移细胞团块。
- 通过吸出悬浮液两次，用连接到5mL注射器的19G针头研磨bijou中的剩余细胞。这将产生浓稠的粘液样混合物。
- 使用21 G针头再重复两次。如果仍有团块，请用 21 G 针再次研磨。
- 使用 23 G 针将细胞从 bijou 转移到相同的 15 mL 离心管（来自步骤 2.18）。
- 在室温（RT）下以200× g 离心5分钟。
- 使用5 mL血清移液管除去所有上清液，并将其转移到另一个15 mL离心管中，注意不要干扰底部含有所需细胞的松散沉淀。
- 在室温下再次以200× g 离心上清液5分钟。
注意：此步骤不是必需的，但是如果需要许多细胞或胚胎很少，则可以执行此步骤以从上清液中回收尽可能多的细胞。 - 使用10 mL电镀培养基（PM）（49%Dulbecco的改良鹰培养基[DMEM]，1%青霉素/链霉素[Pen/Strep]，25%马血清，25%HBSS与Ca 2+和Mg2 + [HBSS+/+];参见材料表），将两个沉淀组合并重悬在一起以产生全细胞悬液。
- 使用台盼蓝和血细胞计数器或数字细胞计数器计数细胞，并用PM稀释细胞悬液至1.8 x 106 个细胞/ mL的浓度。
3. 电镀细胞
- 将所需体积的细胞悬液添加到所需格式，如表1所示：6孔格式每孔 1，000 μL，96孔格式每孔50 μL，或每盖玻片100 μL。
- 在37°C与5%-7%CO2孵育2-4小时。使用倒置显微镜检查细胞是否粘附。
- 取出培养基并加满新的分化培养基（DM+：DM-，包括 10 μg/mL 胰岛素。DM-：DMEM、1% 笔/链球菌、50 nM 氢化可的松、10 ng/mL 生物素、2.5 mL 100x N1 培养基补充剂;见 材料表）。卷详见 表 1。使用无菌移液器吸头按下任何浮动盖玻片。
4. 维护文化
注意：这些培养物需要每周喂食三次，以支持最佳生长和分化。培养物将达到DIV（ 体外天数）实验的最佳健康和成熟度21。细胞可以在培养物中保存长达28天，之后培养物会迅速退化。
- 每周三次直到DIV12，用新鲜的DM+替换部分上清液，每孔去除500 μL（6孔形式），每孔50 μL（96孔形式）或每皿500 μL包含三个盖玻片，每孔添加600 μL（6孔形式），每孔60 μL（96孔形式）， 或每个盖玻片培养皿 600 μL（表 1）。
- 从DIV13开始每周三次，用新鲜DM-替换部分上清液，方法是以6孔形式每孔去除500μL，以96孔形式每孔去除50μL，或每张含有三个盖玻片的培养皿500μL，并以6孔形式每孔添加600μL，以96孔形式每孔添加60μL， 或每个盖玻片培养皿 600 μL（表 1）。
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Representative Results
显微术
在玻璃盖玻片上生长的培养物非常适合通过显微镜进行分析。为了可视化培养物的发展，将盖玻片固定在从DIV0（一旦细胞附着）到DIV28的多个时间点的4%多聚甲醛（PFA）中。如前 所述5使用三种不同的染色组合对培养物进行免疫荧光成像染色：NG2（未成熟的少突胶质细胞）和巢蛋白（神经元干/祖细胞）作为发育标志物，SMI31（轴突），MBP（髓磷脂）和NeuN（神经元细胞体）作为神经元标志物，或CNP（少突胶质细胞），GFAP（星形胶质细胞）和Iba1（小胶质细胞）作为神经胶质标志物（图2）。
使用CellProfiler管道（基于′，6-二脒基-2-苯基吲哚阳性（https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1））对各种细胞类型进行定量。每个单独的数据点由每个时间点从三个盖玻片中拍摄的 10 张图像生成。对于小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，计算每 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚阳性 （DAPI+） 细胞的细胞类型百分比。使用百分比视场代替细胞数量来量化星形胶质细胞的数量。这是由于难以区分单个细胞，因为它们经常重叠（图2M，N）。培养物在DIV21达到峰值成熟度和细胞密度，之后培养物开始降解（图2N）。
重要的是，这些培养物可以很容易地用药物（例如潜在的治疗方法）治疗，或用于追踪 体外 感染。在本例中，将盖玻片上的培养物转移到24孔板中，并感染高嗜神经性病毒Semliki Forest病毒（SFV）（菌株SFV6）6，该病毒在感染细胞中表达zsGreen。在小仓鼠肾（BHK）细胞上滴定的感染多重性（MOI-每个细胞添加的病毒颗粒数）为0.05，以确保低水平感染。感染后0-72小时（hpi）后，将培养物固定在4%PFA中并通过免疫荧光成像染色以进行分析。 图3 说明，与 体内 感染一致，SFV主要感染少突胶质细胞和神经元6。
qRT-PCR
除显微镜检查外，这些CNS培养物还可用于通过分子方法进行分析，例如mRNA对治疗的反应的RT-qPCR。为了进一步研究先天抗病毒反应，用一系列剂量的强效抗病毒细胞因子干扰素β（IFN-β）处理6孔板培养物24小时。用硫氰酸胍/苯酚裂解培养物，分离RNA，转化为cDNA，并通过qPCR进行分析，如前所述7。使用这种方法，可以测量许多基因的差异表达。在这里， Ccl5 的上调针对管家基因 18s进行了量化。CCL5是一种参与炎症反应的趋化细胞因子（趋化因子）。IFN-β处理导致培养物中 Ccl5 mRNA的上调（图4A）。
酶联免疫吸附测定 （ELISA）
96孔培养物是高通量筛选治疗的绝佳工具。为了研究 Ccl5 mRNA的上调是否导致CCL5蛋白的表达，根据制造商的说明，通过ELISA在培养物的上清液中测量CCL5（见 材料表）。在本例中，用27个增量剂量的IFN-β处理96孔培养物一式两份，以产生剂量反应曲线（图4B）。与mRNA表达的增加一致（图4A），上清液中释放的CCL5增加。正如预期的那样， 图4C 显示了mRNA与蛋白质表达之间的明显相关性。
流式细胞术
流式细胞术是同时研究许多细胞内和/或细胞外标志物表达的强大工具。然而，在将细胞从培养物中取出到单细胞悬液进行处理和分析时，由于细胞损伤和死亡，通过流式细胞术分析复杂、高度交互的培养物可能具有挑战性。比较使用0.05%-0.5%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、不含EDTA的1x-10x胰蛋白酶和温和解离试剂的各种方案，发现在用0.05%胰蛋白酶-EDTA在37°C下轻轻搅拌处理6孔板培养物10分钟后，用温和的研磨提升细胞以产生单细胞悬液。特别是对于CNS细胞的流式细胞术分析，在细胞制备过程中保持温和，尽量减少洗涤步骤，并始终小心地将细胞保持在4°C或冰上，这一点至关重要。
为了评估这种单细胞悬液中的活力和细胞类型，用活性染料和荧光标记的CD45、CD11b、O4、ACSA-2和CD24抗体染色细胞，以便可视化培养物 中的每个细胞群8（图5）。从该方法获得约70%的细胞活力，平均每6孔板约2 x 106 个活的单细胞（图5C）。与显微镜结果一致（图2N），有大量的小胶质细胞，神经元和星形胶质细胞，而少突胶质细胞的丰度最低。
图 1：所述生成混合神经元和神经胶质培养物的方法的示意图概述。 请单击此处查看此图的大图。
图 2：随着时间的推移对免疫荧光成像细胞标志物染色的 E17 CNS 培养物。 细胞在透化和染色之前用4%PFA固定以可视化不同的群体。（A，D，G，J，M）发育标志物NG2（少突胶质细胞前体细胞）和巢蛋白（神经元和神经胶质前体细胞），（B，E，H，K，N）神经元标志物SMI31（轴突），MBP（髓磷脂）和NeuN（神经元细胞体）和（C，F，I，L，O）神经胶质标志物CNP（少突胶质细胞），GFAP（星形胶质细胞）和Iba1（小胶质细胞）的代表性图像。比例尺 = 50 μm。 （P） 每毫米2 的 DAPI 计数，n = 3，每个 n 来自技术一式三份，每一式三份 10 张图像。（Q）细胞计数为DAPI +细胞（小胶质细胞，少突胶质细胞和神经元）的百分比和视野（星形胶质细胞）的百分比，n = 3，每个n来自技术一式三份，每三次10张图像。误差线±平均值的标准误差 （SEM）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：随着时间的推移，E17 CNS 培养物的 Semliki 森林病毒 （SFV） 感染。未感染的对照培养物（A，C，E，G）和感染0.05 MOI SFV（B，D，F，H）的培养物的代表性图像。将细胞感染0-48小时，并用CNP（少突胶质细胞标志物）和NeuN（神经元标志物）（A-D）或GFAP（星形胶质细胞标志物）和Iba1（小胶质细胞标志物）（E-H）染色。白色箭头表示受感染的细胞。这种SFV菌株表达绿色荧光蛋白zsGreen，以便能够追踪病毒感染。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：IFN-β 处理后 CCL5 mRNA 和 E17 CNS 培养物的蛋白表达。 用一系列剂量的IFN-β以6孔板形式（mRNA）或96孔板形式（蛋白质）处理细胞24小时。（A）用0-100ng / mL IFN-β处理后 Ccl5 mRNA的表达，生物学n = 2，每个取自技术一式三份。（B）0-100ng/mL IFNβ处理后上清液中的CCL5浓度，生物n = 1，取自技术一式三份。（C）细胞mRNA Ccl5 上调与上清液中CCL5蛋白浓度的对数趋势线。误差线± SEM。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：流式细胞术门控策略，从 E17 CNS 培养物中生成单细胞群。 使用0.05%胰蛋白酶-EDTA解离细胞，用适当的抗体染色，并分选成单个细胞群。（A-C）分选活单细胞的门控策略。（D）选择小胶质细胞（CD45 + CD11b +）的策略。（E）选择少突胶质细胞（CD45-CD11b-O4+）的策略。（F）星形胶质细胞（CD45-CD11b-O4-ACSA-2+ CD24+）和神经元（CD45-CD11b-O4-ACSA-2-CD24+）的分类策略。（G）单个细胞群相互重叠，显示离散的细胞群。（H）单个细胞类型占分选细胞总数的百分比，n = 4。误差线± SEM。 请点击此处查看此图的大图。
| 所需格式 | BA-PLL/井 | 洗涤用水 | 电镀介质 （PM） 中的体积细胞以电镀 | 充值媒体 | 饲喂培养物时去除/添加（3次/周） |
| 6 孔规格 （9.6cm2） | 1000 微升 | 1000 微升 | 1000 微升 | -400 微升 | -500 μL 培养基 |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| 96 孔规格 （0.32 cm2） | 100微升 | 100 微升 | 50 微升 | +60 μL DM+ | -50 μL 培养基 |
| +60 μL DM+/- | |||||
| 碟形盖玻片 | 每 200 张盖玻片 20 mL | 20毫升 | 每个盖玻片 100 μL | +600 μL DM+ | -500 μL 培养基 |
| +300 微升下午 | +600 μL DM+/- |
表1：制备包衣组织培养塑料所需的体积。
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Discussion
中枢神经系统是一个复杂的网络，从大脑到脊髓，由许多细胞类型组成，主要是神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞1。由于每个细胞在维持体内平衡和对CNS9，10，11中的挑战产生适当的反应方面都起着重要作用，因此包含所有这些细胞类型的培养系统是研究大脑如何对刺激做出反应的有用且通用的工具。在体外环境中研究这些细胞及其相互作用的能力意味着可以采用多种技术来轻松研究各种实验问题。我们概述了一种快速有效的方法来从产前大脑获取和培养主要的CNS细胞类型，该方法可以模拟成年小鼠大脑中的单个细胞群12。
先前建立的产生CNS培养物的方案使用E13.5脊髓4，5。除了有一个适合脊髓的模型外，拥有一个概括大脑的模型也非常重要。因此，来自这些E13.5小鼠的大脑最初用于使用相同的协议生成此处描述的CNS培养物。然而，在DIV14之后，细胞开始形成具有密集堆积神经元细胞体的大聚集体。虽然存在星形胶质细胞，但尚不清楚它们是否均匀分布。目前尚不清楚这些细胞体中心的细胞是否会像外面的细胞一样从培养基中获得足够的营养和氧气。当经历氧气和营养匮乏时，神经元容易经历细胞凋亡并向神经胶质细胞13释放应激信号，这可能导致促炎表型14。神经发生被认为是这些密集聚集体的可能原因，并且该阶段在E1715时消退。当使用来自E17小鼠胚胎的大脑时，细胞仍然形成网络，但没有聚集成E13.5中看到的大聚集体，因此被认为是更合适的年龄来产生大脑培养物。
目前的技术还导致从一次怀孕中获得更多数量的细胞（平均1 x 10 7细胞/大脑与3-4 x 106细胞/脊髓相比）7。对于具有8-10个胚胎的平均怀孕小鼠，这对应于多达54个6孔板格式的不同实验条件，或150个显微镜实验条件（与脊髓分别为19和64相比）。因此，这些CNS培养物是减少所需小鼠数量的好工具16。特别是，96孔格式可以很容易地用于高通量测定，例如能够在动物测试之前筛选候选药物，大大减少了此类研究所需的动物数量。这将有望提高在动物中测试CNS药物的低成功率，并改善对人体临床试验的转化17，18。
培养物在DIV21达到峰值成熟度。细胞计数增加直到这个时间点，之后细胞开始退化，每种类型细胞的数量减少。这是通过观察量化的细胞数（图2N）以及pyknotic nuc核的数量（致密的DAPI染色剂）（图2M）来测量的。虽然发育标志物巢蛋白和NG2仍然在DIV14（图2G）和DIV21（图2J）上表达，但这是由于一些星形胶质细胞经历了星形胶质细胞病，其上调巢蛋白19，而一些少突胶质细胞尚未完全成熟，因此仍然表达一些NG220。基于显微镜验证，与DIV21的完全成熟细胞相比，只有一小部分细胞仍表达发育标志物（图2I，L）;因此，此时文化已基本成熟。值得注意的是，在 体内，小胶质细胞的密度在小鼠中枢神经系统中变化很大。在我们的培养物中，由Iba1表达定义的小胶质细胞水平处于该密度的高端12。在流式细胞术程序中存活的小胶质细胞比例很高可能是由于小胶质细胞比其他CNS细胞更健壮，CNS细胞通常具有微妙的延伸，因此在流式细胞术制备过程中更容易受损。
解剖后只需3周即可使细胞准备好进行实验，这比大多数基于人类的体外方法（例如类器官或诱导多能干细胞衍生模型）短21。只要需要体内研究以确保新疗法的安全性，使用像我们这样的体外细胞培养方法将有助于在动物测试之前有效地测试毒性和功效，减少对动物的需求，并增强研究从体外到体内的转化。 希望这最终也能更有效地转化为基于人体的临床试验。最终，这些培养物的创建是为了允许研究中枢神经系统。虽然体外系统不能完全表达CNS的复杂性，但原代细胞来源的培养物更准确地代表了体内CNS特性22，23。体外方法可以允许在没有浸润免疫细胞24和血脑屏障完整性25的情况下研究CNS的更还原的方法。消除这一层复杂性可以更容易地解开机制。因此，目前的培养系统是回答补充体内动物研究的研究问题的有用工具。
收获、分离和培养中枢神经系统细胞的能力已经大大增进了我们对先天中枢神经系统16的理解。本文演示了对E17小鼠大脑的解剖以及由此产生的细胞研磨和培养，以产生包含CNS所有主要细胞类型的细胞培养系统。这些培养物上采用了多种分子技术，展示了这些培养物对研究中枢神经系统的有效性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢Edgar和Linington实验室的成员，特别是Chris Linington教授，Diana Arseni博士和Katja Muecklisch博士，感谢他们的建议，有用的评论，以及在我们建立这些文化时为文化提供营养的帮助。特别感谢Muecklisch博士为Cell Profiler管道提供了起点。这项工作得到了MS协会（赠款122）和尤里和洛娜·切尔纳约夫斯基基金会的支持;格拉斯哥大学资助JC和MP;以及惠康信托基金会（217093/Z/19/Z）和医学研究委员会（MRV0109721）给GJG。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
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