Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

संक्रमण और जन्मजात प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए भ्रूण माउस दिमाग से मिश्रित न्यूरोनल और ग्लियल सेल संस्कृतियों की स्थापना

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65331
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1School of Infection and Immunity, University of Glasgow, 2Faculty of Science and Technology, Institute of Technology, University of Tartu

Summary

यह प्रोटोकॉल न्यूरो (इम्यूनो) लॉजी अनुसंधान के लिए भ्रूण के दिन 17 माउस दिमाग से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सेल संस्कृतियों को उत्पन्न करने का एक अनूठा तरीका प्रस्तुत करता है। इस मॉडल का विश्लेषण आरटी-क्यूपीसीआर, माइक्रोस्कोपी, एलिसा और फ्लो साइटोमेट्री सहित विभिन्न प्रयोगात्मक तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है।

Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के मॉडल को विवो में पाए जाने वाले परस्पर कोशिकाओं के जटिल नेटवर्क को फिर से तैयार करना चाहिए।सीएनएस में मुख्य रूप से न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया होते हैं। पशु उपयोग को बदलने और कम करने के बढ़ते प्रयासों के कारण, जन्मजात सेल गुणों का पता लगाने के लिए विभिन्न प्रकार के इन विट्रो सेल कल्चर सिस्टम विकसित किए गए हैं, जो सीएनएस संक्रमण और विकृति के लिए चिकित्सीय विकास की अनुमति देते हैं। जबकि कुछ शोध प्रश्नों को मानव-आधारित सेल कल्चर सिस्टम द्वारा संबोधित किया जा सकता है, जैसे कि (प्रेरित) प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल, मानव कोशिकाओं के साथ काम करने की उपलब्धता, लागत और नैतिकता के संबंध में अपनी सीमाएं हैं। यहां, हम भ्रूण माउस दिमाग से कोशिकाओं को अलग करने और संवर्धन करने के लिए एक अद्वितीय प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परिणामस्वरूप मिश्रित तंत्रिका कोशिका संस्कृतियां विवो में मस्तिष्क में पाए जाने वाले कई सेल आबादी और इंटरैक्शन की नकल करती हैं। वर्तमान समकक्ष विधियों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल मस्तिष्क की विशेषताओं की अधिक बारीकी से नकल करता है और अधिक कोशिकाओं को भी इकट्ठा करता है, इस प्रकार एक गर्भवती माउस से अधिक प्रयोगात्मक स्थितियों की जांच करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत आसान और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। इन संस्कृतियों को विभिन्न पैमानों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें 96-अच्छी तरह से आधारित उच्च थ्रूपुट स्क्रीन, 24-वेल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण और फ्लो साइटोमेट्री और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) विश्लेषण के लिए 6-वेल कल्चर शामिल हैं। यह संस्कृति विधि इन विट्रो विधियों की सुविधा के साथ सीएनएस की कुछ जटिलता के संदर्भ में संक्रमण और प्रतिरक्षा की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की हमारी समझ में सुधार कई न्यूरोइन्फ्लेमेटरी और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए चिकित्सीय विकल्पों में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है। सीएनएस, मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और ऑप्टिक नसों के भीतर परस्पर जुड़ी कोशिकाओं का एक जटिल नेटवर्क है, जिसमें न्यूरॉन्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और उनकी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं, माइक्रोग्लिया1 शामिल हैं। एक इन विट्रो दृष्टिकोण अक्सर सार्थक शोध करने के लिए आवश्यक चूहों की संख्या को काफी कम कर सकता है; हालांकि, सीएनएस की जटिल प्रकृति सेल लाइनों का उपयोग करके विवो स्थिति को फिर से परिभाषित करना असंभव बनाती है। मिश्रित तंत्रिका कोशिका संस्कृतियां प्रतिस्थापन, कमी और शोधन (3आर) सिद्धांतों2,3 के अनुरूप, एक प्रासंगिक मॉडल में न्यूरो (इम्यूनो) लॉजी प्रश्नों की जांच करने के लिए एक अत्यंत मूल्यवान शोध उपकरण प्रदान करती हैं।

थॉमसन एट अल ने प्रसवपूर्व रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं का उपयोग करके एक सेल कल्चर विधि का वर्णन किया जो उपरोक्त सभी मुख्य सीएनएससेल प्रकारों में अंतर करता है। इस प्रणाली में सिनैप्स गठन, माइलिनेटेड अक्षतंतु और रैनवियर के नोड्स भी हैं। इस संवर्धन विधि की मुख्य सीमा यह है कि, रीढ़ की हड्डी होने के नाते, यह मस्तिष्क को उपयोगी रूप से मॉडल नहीं करता है, और भ्रूण के दिन 13 (ई 13) रीढ़ की हड्डी से कोशिका की पैदावार संकुचित हो रही है। इस प्रकार, यह प्रयोगात्मक स्थितियों की संख्या को सीमित करता है जिनकी जांच की जा सकती है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य एक नई सेल संस्कृति प्रणाली विकसित करना है जो जानवरों के लिए आवश्यकताओं को कम करने के लिए बढ़ी हुई सेल उपज के साथ मस्तिष्क की विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करता है।

एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में थॉमसन एट अल का उपयोग करते हुए, हमने प्रसवपूर्व माउस दिमाग से विशुद्ध रूप से प्राप्त एक सेल कल्चर मॉडल विकसित किया। इन संस्कृतियों में रीढ़ की हड्डी संस्कृतियों के समान सेल आबादी, इंटरकनेक्टिविटी और उपचार के विकल्प हैं, सिवाय इसके कि तुलना से कम माइलिनेशन है। हालांकि, लगभग तीन गुना अधिक सेल उपज के साथ एक सीएनएस इन विट्रो मॉडल होना अधिक कुशल है, जिसमें कम चूहों और कम समय प्रसंस्करण भ्रूण की आवश्यकता होती है। हमने इस अनूठी संस्कृति प्रणाली को कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों और पैमानों के लिए अनुकूलित किया, जिसमें माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए ग्लास कवरलिप्स और प्लास्टिक वेल प्लेटों के विभिन्न आकारों का उपयोग करना शामिल है, जिसमें उच्च थ्रूपुट अनुसंधान के लिए 96-वेल प्लेटें शामिल हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों ने पशु उपयोग के लिए स्थानीय कानूनों और दिशानिर्देशों का अनुपालन किया, और ग्लासगो विश्वविद्यालय में स्थानीय नैतिक समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। जानवरों को यूके होम ऑफिस प्रोजेक्ट लाइसेंस के तत्वावधान में यूके एनिमल्स साइंटिफिक प्रोसीजर एक्ट 1986 के अनुसार विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। इस अध्ययन के लिए, इन-हाउस ब्रेड वयस्क C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया गया था। गर्भावस्था की उच्च सफलता दर के कारण युवा महिलाओं (8-12 सप्ताह) के उपयोग की सिफारिश की जाती है; प्रजनन के कई दौर के लिए नर का पुन: उपयोग किया जा सकता है। चित्रा 1 मिश्रित न्यूरोनल और ग्लियल संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए वर्णित विधि के एक योजनाबद्ध अवलोकन का प्रतिनिधित्व करता है।

1. ऊतक संवर्धन उपभोग्य सामग्रियों की तैयारी

  1. क्लास 2 सुरक्षा कैबिनेट के अंदर माइक्रोस्कोपी कवरलिप्स युक्त प्लेटें और / या व्यंजन तैयार करें। संस्कृति अवधि के दौरान बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए सभी अभिकर्मकों या आटोक्लेव को निष्फल करें।
  2. बोरिक एसिड बफर [बीए] [50 एमएम बोरिक एसिड, 12.5 एमएम सोडियम टेट्राबोरेट, पीएच 8.5] में बीए-पीएलएल (13.2 μg/mL पॉली-एल-लाइसिनहाइड्रोब्रोमाइड [पीएलएल]; प्रत्येक कुएं में (6-वेल प्लेट में 1,000 μL/well, 96-वेल प्लेट में 100 μL/well; वॉल्यूम ्स को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है) की उपयुक्त मात्रा जोड़ें। माइक्रोस्कोपी कवरलिप्स के लिए, 200 बाँझ कवरलिप्स युक्त 9 सेमी व्यास के टिशू कल्चर डिश में 20 एमएल बीए-पीएलएल जोड़ें, और समान रूप से वितरित करने के लिए घुमाएं।
  3. 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. माइक्रोस्कोपी कवरलिप्स युक्त प्रत्येक कुएं या डिश से बीए-पीएलएल समाधान निकालें, और 20 मिलीलीटर बाँझ पानी जोड़कर, कवरलिप्स को घुमाकर और फिर पानी को हटाकर धोएं। इस धोने के चरण को तीन बार दोहराएं। कवरलिप्स युक्त डिश के लिए, कवरलिप्स को आसानी से हटाने के लिए अंतिम धोने पर टिशू कल्चर डिश में बाँझ पानी छोड़ दें।
  5. बाँझ पिपेट के साथ जितना संभव हो उतना तरल निकालें और रात भर कम से कम 2 घंटे तक सूखने दें।
  6. लेपित प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने तक स्टोर करें।
    नोट: पॉली-एल-लाइसिन (बीए-पीएलएल) समाधान के साथ तैयार बोरिक एसिड को हर बार नए पीएलएल को जोड़ते हुए तीन बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है। बीए-पीएलएल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। व्यंजन ों को बीए-पीएलएल के साथ इलाज किया जाता है, क्योंकि पीएलएल कोशिकाओं को नीचे चिपकने और बढ़ने की अनुमति देता है। इस उपचार के बिना, कोशिकाएं संस्कृति के लगभग 1 सप्ताह के बाद उठेंगी और अब अंतर करने में सक्षम नहीं होंगी।

2. ई 17 भ्रूण यी मस्तिष्क का विच्छेदन

  1. एक नर माउस के साथ एक या कई मादा चूहों को सह-घर दें। बलगम प्लग के लिए रोजाना महिलाओं की जांच करें, यह दर्शाता है कि संभोग हुआ है।
    नोट: गर्भावस्था की सही शुरुआत की तारीख सुनिश्चित करने के लिए किसी भी "प्लग" मादा चूहों को नर से अलग करने की आवश्यकता होती है। गर्भावस्था की पुष्टि करने के लिए चूहों का वजन किया जा सकता है या नेत्रहीन निगरानी की जा सकती है।
  2. स्थानीय पशु कल्याण मार्गदर्शन और कानूनों के अनुपालन में उचित तरीकों का उपयोग करके ई 17 पर गर्भवती माउस को मार दें, उदाहरण के लिए, कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) एकाग्रता, एक घातक एनेस्थेटिक ओवरडोज, या गर्दन की अव्यवस्था बढ़ाकर।
    नोट: चुनी गई विधि भ्रूण को बाधित नहीं करना चाहिए। इस अध्ययन के लिए, कार्बन डाइऑक्साइड गैस की बढ़ती सांद्रता के संपर्क में आने के बाद ऊरु धमनी को अलग करके मृत्यु की पुष्टि का उपयोग गर्भवती बांधों को मारने के लिए किया गया था।
  3. मारे गए, गर्भवती माउस को एक विच्छेदन बोर्ड पर अपनी पीठ पर रखें; जबकि इसे नीचे पिन करना आवश्यक नहीं है, यह अनुभवहीन शोधकर्ताओं के लिए इसे आसान बना सकता है। बल का उपयोग करके पेट की मध्य रेखा को पिंच करें। तेज कैंची का उपयोग करके, जननांग से रिबकेज तक मध्य रेखा पर त्वचा और पेरिटोनियम के माध्यम से पेट को काट लें, सावधान रहें कि गर्भाशय पंचर न हो।
    1. माउस गर्भाशय में दो सींग होते हैं, प्रत्येक में आमतौर पर एक से पांच भ्रूण होते हैं। भ्रूण युक्त गर्भाशय को मां से निकालें और तुरंत इसे बर्फ पर रखें।
  4. प्लेसेंटा के किनारे जर्दी की बोरी के माध्यम से काटें, भ्रूण को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें, और भ्रूण को उनकी जर्दी बोरी से हटा दें।
  5. भ्रूण को तुरंत हटा दें। बर्फ पर कैल्शियम (सीए2 +) और मैग्नीशियम (मिलीग्राम2 +) (एचबीएसएस -/-) के बिना हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ एक डिश में कटे हुए सिर जोड़ें।
    नोट: यदि जीनोटाइपिंग की आवश्यकता होती है, तो आनुवंशिक विश्लेषण के लिए इस स्तर पर पूंछ को हटा सकते हैं। जब कई जीनोटाइप की उम्मीद की जाती है, तो प्रत्येक भ्रूण के सिर को संवर्धन के लिए अलग से रखा जाना चाहिए।
  6. कोण बल का उपयोग करके, सिर को बाईं ओर की ओर रखें।
  7. बल के एक किनारे से आंख को छेदें, दूसरे के साथ ठोड़ी को मजबूती से पकड़ें।
  8. झपकी से शुरू करते हुए, धीरे से खोपड़ी की त्वचा को मध्य रेखा के साथ स्नूट की नोक की ओर फाड़ दें।
  9. रीढ़ की हड्डी के माध्यम से प्रवेश करना, एक सफेद अंडाकार के रूप में ध्यान देने योग्य, मस्तिष्क को उजागर करते हुए, मध्य रेखा के साथ खोपड़ी को खोलने के लिए कोण बल का उपयोग करें।
  10. धीरे से खोपड़ी को ऊपर की ओर की ओर छीलें, मस्तिष्क को उजागर करें।
  11. मस्तिष्क को खोपड़ी से बाहर उठाएं, एक बार मस्तिष्क को पूरी तरह से हटा दिए जाने के बाद खोपड़ी का निपटान करें।
  12. बल का उपयोग करके, मेनिंगेस को हटा दें, जो घने रक्त वाहिकाओं के साथ एक पतली झिल्ली के रूप में ध्यान देने योग्य हैं।
  13. दिमाग को एक बिजौ ( सामग्री की तालिका देखें) में रखें जिसमें बर्फ पर 2 मिलीलीटर एचबीएसएस -/
  14. शेष दिमाग के साथ चरण 2.6 से 2.13 दोहराएं, प्रति बिजौ चार दिमाग तक जोड़ें।
  15. बिजौ में 10x ट्रिप्सिन के 250 μL जोड़ें और बिजौ को हिलाकर दिमाग को ट्रिट्यूरेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस बिंदु से आगे के सभी चरणों को बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में किया जाना चाहिए।
  16. सोयाबीन ट्रिप्सिन (एसडी) अवरोधक के 2 मिलीलीटर (लीबोविट्ज़ एल -15, सोयाबीन से 0.52 मिलीग्राम / एमएल ट्रिप्सिन अवरोधक, 40 μg / mL DNase I, 3 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए] अंश V; सामग्री की तालिका देखें) को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखकर -20 डिग्री सेल्सियस से पिघलाएं।
  17. प्रत्येक बिजौ युक्त दिमाग में 2 एमएल एसडी अवरोधक जोड़ें (प्रति बिजौ जिसमें चार दिमाग होते हैं), इसे समान रूप से फैलाने के लिए बिजौ को फिर से हिलाएं।
    नोट: एसडी अवरोधक नमूनों के अनावश्यक पाचन को रोकने और सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए ट्रिप्सिन गतिविधि को कम करता है।
  18. सेंट्रीफ्यूजेशन के बिना, प्रत्येक बिजौ से 2 एमएल सुपरनैटेंट निकालें और 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, सेल क्लंप को स्थानांतरित न करने के लिए सावधान रहें।
  19. 5 एमएल सिरिंज से जुड़ी 19 ग्राम सुई के साथ बिजौ में शेष कोशिकाओं को दो बार सस्पेंशन करके ट्राइट्यूरेट करें। यह एक गाढ़ा बलगम जैसा मिश्रण बनाएगा।
    1. 21 ग्राम सुई का उपयोग करके दो बार दोहराएं। यदि झुरमुट शेष हैं, तो 21 ग्राम सुई के साथ एक बार फिर से ट्राइट्यूरेट करें।
  20. 23 ग्राम सुई का उपयोग करके कोशिकाओं को बिजौ से उसी 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (चरण 2.18 से) में स्थानांतरित करें।
  21. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  22. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सभी सुपरनैटेंट को हटा दें और इसे एक और 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, सावधान रहें कि आवश्यक कोशिकाओं वाले तल पर ढीली गोली को परेशान न करें।
  23. 5 मिनट के लिए आरटी पर 200 x g पर फिर से सतह पर तैरनेवाला को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: यह कदम आवश्यक नहीं है, लेकिन अगर किसी को कई कोशिकाओं की आवश्यकता होती है या कुछ भ्रूण होते हैं, तो कोई सतह पर तैरने वाले से अधिक से अधिक कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए इस चरण को कर सकता है।
  24. 10 एमएल प्लेटिंग मीडिया (पीएम) (49% डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम [डीएमईएम], 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन [पेन / स्ट्रेप], 25% घोड़े के सीरम, सीए 2 + और एमजी2 + [एचबीएसएस + /+] के साथ 25% एचबीएसएस का उपयोग करके, पूरे सेल निलंबन को बनाने के लिए दो छर्रों को एक साथ मिलाएं और फिर से निलंबित करें।
  25. ट्राइपैन ब्लू और या तो हेमोसाइटोमीटर या डिजिटल सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और पीएम के साथ सेल निलंबन को 1.8 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।

3. कोशिकाओं को चढ़ाना

  1. तालिका 1 में दिए गए अनुसार आवश्यक प्रारूप में सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा जोड़ें: 6-वेल प्रारूप में 1,000 μL प्रति वेल, 96-वेल प्रारूप में 50 μL प्रति वेल, या 100 μL प्रति कवरस्लिप।
  2. 5% -7% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर2-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं का पालन करने की जांच करें।
  3. मीडिया को हटा दें और नए भेदभाव मीडिया (डीएम +: डीएम- जिसमें 10 μg / mL इंसुलिन शामिल हैं) के साथ टॉप अप करें। डीएम-: डीएमईएम, 1% पेन / स्ट्रेप, 50 एनएम हाइड्रोकार्टिसोन, 10 एनजी / एमएल बायोटिन, 2.5 एमएल 100 एक्स एन 1 मीडिया पूरक; सामग्री की तालिका देखें)। खंड तालिका 1 में विस्तृत हैं। बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करके किसी भी फ्लोटिंग कवरलिप्स को दबाएं।

4. संस्कृतियों को बनाए रखना

नोट: इन संस्कृतियों को इष्टतम विकास और भेदभाव का समर्थन करने के लिए सप्ताह में तीन बार भोजन की आवश्यकता होती है। संस्कृतियां डीआईवी ( इन विट्रो) पर प्रयोगों के लिए इष्टतम स्वास्थ्य और परिपक्वता तक पहुंच जाएंगी। कोशिकाओं को 28 दिनों तक संस्कृति में रखा जा सकता है, जिसके बाद संस्कृतियां जल्दी से पतित हो जाती हैं।

  1. DIV12 तक प्रति सप्ताह तीन बार, सतह पर तैरनेवाले के हिस्से को ताजा डीएम + के साथ बदलें, 6-वेल प्रारूप में 500 μL प्रति वेल, 96-वेल प्रारूप में 50 μL प्रति वेल, या तीन कवरलिप युक्त 500 μL प्रति डिश को हटाकर, और 6-वेल प्रारूप में 600 μL प्रति वेल, 96-वेल प्रारूप में 60 μL प्रति वेल, या 600 μL प्रति कवरस्लिप डिश (तालिका 1)।
  2. DIV13 से प्रति सप्ताह तीन बार, सतह पर तैरनेवाले के हिस्से को ताजा डीएम के साथ बदलें- 6-वेल प्रारूप में 500 μL प्रति वेल, 96-वेल प्रारूप में 50 μL प्रति वेल, या तीन कवरलिप वाले 500 μL प्रति डिश को हटाकर, और 6-वेल प्रारूप में 600 μL प्रति वेल, 96-वेल प्रारूप में 60 μL प्रति वेल जोड़कर, या 600 μL प्रति कवरस्लिप डिश (तालिका 1)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

माइक्रोस्कोपी
ग्लास कवरलिप्स पर उगाई गई संस्कृतियां माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण करने के लिए आदर्श हैं। संस्कृतियों के विकास की कल्पना करने के लिए, कवरलिप्स को DIV0 (एक बार कोशिकाओं को संलग्न करने के बाद) से DIV28 तक कई समय बिंदुओं पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में तय किया गया था। संस्कृतियों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए दाग दिया गया था जैसा किपहले तीन अलग-अलग धुंधला संयोजनों का उपयोग करके वर्णित किया गया था: एनजी 2 (अपरिपक्व ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स) और नेस्टीन (न्यूरोनल स्टेम / पूर्वज कोशिकाएं) विकास मार्करों के रूप में, एसएमआई 31 (अक्षतंतु), एमबीपी (माइलिन), और न्यून (न्यूरॉन सेल बॉडी) न्यूरोनल मार्कर के रूप में, या सीएनपी (ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स), जीएफएपी (एस्ट्रोसाइट्स), और आईबीए 1 (माइक्रोग्लिया) ग्लियल मार्कर (चित्रा 2)।

सेलप्रोफाइलर पाइपलाइनों (',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल-पॉजिटिव (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1) के आधार पर) का उपयोग करके विभिन्न सेल प्रकारों की मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रत्येक व्यक्तिगत डेटा बिंदु प्रति टाइमपॉइंट तीन कवरलिप्स से ली गई औसतन 10 छवियों से उत्पन्न हुआ था। माइक्रोग्लिया, न्यूरॉन्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के लिए, प्रति 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल-पॉजिटिव (डीएपीआई +) सेल सेल के प्रकार के प्रतिशत की गणना की गई थी। एस्ट्रोसाइट्स की संख्या निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की संख्या के बजाय दृश्य के प्रतिशत क्षेत्र का उपयोग किया गया था। यह अलग-अलग कोशिकाओं के बीच अंतर करने में कठिनाइयों के कारण था क्योंकि वे अक्सर अतिव्यापी होते थे (चित्रा 2 एम, एन)। संस्कृतियां DIV21 पर चरम परिपक्वता और सेल घनत्व तक पहुंच गईं, जिसके बाद संस्कृतियों का पतन शुरू हो गया (चित्रा 2 एन)।

महत्वपूर्ण रूप से, इन संस्कृतियों को आसानी से दवाओं के साथ इलाज किया जा सकता है, जैसे कि संभावित चिकित्सीय, या इन विट्रो संक्रमणों का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। इस उदाहरण में, कवरलिप्स पर संस्कृतियों को 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित किया गया था और अत्यधिक न्यूरोट्रोपिक वायरस सेमलिकी फॉरेस्ट वायरस (एसएफवी) (स्ट्रेन एसएफवी 6)6 से संक्रमित किया गया था, जो संक्रमित कोशिकाओं में जेडएसग्रीन व्यक्त करता है। संक्रमण की बहुलता (एमओआई- प्रति कोशिका में जोड़े गए वायरस कणों की संख्या) 0.05, जैसा कि बेबी हैम्स्टर किडनी (बीएचके) कोशिकाओं पर टाइटकिया गया था, का उपयोग निम्न-स्तरीय संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए किया गया था। 0-72 घंटे के पोस्ट-संक्रमण (एचपीआई) के बाद, संस्कृतियों को 4% पीएफए में तय किया गया था और इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा विश्लेषण के लिए दाग दिया गया था। चित्रा 3 दिखाता है कि, विवो संक्रमण के अनुरूप, एसएफवी मुख्य रूप से ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स6 को संक्रमित करता है।

QRT-PCR
माइक्रोस्कोपी के अलावा, इन सीएनएस संस्कृतियों का उपयोग आणविक विधियों द्वारा विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जैसे कि उपचार के लिए एमआरएनए प्रतिक्रियाओं के आरटी-क्यूपीसीआर। जन्मजात एंटीवायरल प्रतिक्रिया की आगे जांच करने के लिए, 6-वेल प्लेट कल्चर को 24 घंटे के लिए शक्तिशाली एंटीवायरल साइटोकिन इंटरफेरॉन बीटा (आईएफएन -β) की खुराक की एक श्रृंखला के साथ इलाज किया गया था। संस्कृतियों को गुआनिडियम-थायोसाइनेट / फिनोल के साथ जोड़ा गया था, और आरएनए को अलग किया गया था, सीडीएनए में परिवर्तित किया गया था, और क्यूपीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया था जैसा कि पहले वर्णित7 था। इस विधि का उपयोग करके, कई जीनों की अंतर अभिव्यक्ति को मापा जा सकता है। यहां, सीसीएल 5 के अपरेगुलेशन को हाउसकीपिंग जीन 18 एस के खिलाफ निर्धारित किया गया था। सीसीएल 5 एक केमोटैक्टिक साइटोकिन (केमोकाइन) है जो भड़काऊ प्रतिक्रिया में शामिल है। आईएफएन -β उपचार के परिणामस्वरूप संस्कृतियों में सीसीएल 5 एमआरएनए का उन्नयन हुआ (चित्रा 4 ए)।

एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा)
संस्कृतियों का 96-अच्छी तरह से प्रारूप उपचार के उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है। यह जांचने के लिए कि क्या सीसीएल 5 एमआरएनए के अपरेगुलेशन के परिणामस्वरूप सीसीएल 5 प्रोटीन की अभिव्यक्ति होती है, सीसीएल 5 को निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलिसा द्वारा संस्कृतियों के सुपरनैटेंट में मापा गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। इस उदाहरण में, खुराक-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने के लिए आईएफएन -β की 27 वृद्धिशील खुराक के साथ 96-वेल संस्कृतियों का डुप्लिकेट में इलाज किया गया था (चित्रा 4 बी)। बढ़ी हुई एमआरएनए अभिव्यक्ति (चित्रा 4 ए) के अनुरूप, सतह पर तैरने वाले में जारी सीसीएल 5 में वृद्धि हुई थी। जैसा कि अपेक्षित था, चित्रा 4 सी एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति के बीच एक स्पष्ट सहसंबंध प्रदर्शित करता है।

फ्लो साइटोमेट्री
फ्लो साइटोमेट्री एक साथ कई इंट्रा- और / या बाह्य मार्करों की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जटिल, अत्यधिक इंटरैक्टिव संस्कृतियों का विश्लेषण करना सेल क्षति और मृत्यु के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब कोशिकाओं को प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए संस्कृति से एकल-सेल निलंबन में ले जाया जाता है। 0.05% -0.5% ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए), ईडीटीए के बिना 1x-10x ट्रिप्सिन और कोमल पृथक्करण अभिकर्मक का उपयोग करके विभिन्न प्रोटोकॉल की तुलना करते हुए, यह पाया गया कि 6-वेल प्लेट कल्चर को 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ इलाज करने के बाद, कोशिकाओं को एकल-सेल निलंबन बनाने के लिए कोमल ट्रिट्यूरेशन के साथ उठाया गया था। विशेष रूप से सीएनएस कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, सेल की तैयारी के दौरान कोमल होना, धोने के चरणों को कम करना और कोशिकाओं को हर समय 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखने के लिए बहुत सावधानी बरतना महत्वपूर्ण है।

इस एकल-सेल निलंबन में व्यवहार्यता और सेल प्रकारों का आकलन करने के लिए, कोशिकाओं को सीडी 45, सीडी 11 बी, ओ 4, एसीएसए -2 और सीडी 24 के खिलाफ व्यवहार्यता डाई और फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया थाताकि संस्कृतियों में प्रत्येक व्यक्तिगत सेल आबादी के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिल सके 8 (चित्रा 5)। इस विधि से लगभग 70% सेल व्यवहार्यता प्राप्त की गई थी, जो लगभग 2 x 10 6 व्यवहार्य, एकल कोशिकाएं प्रति6-वेल प्लेट (चित्रा 5 सी) थी। माइक्रोस्कोपी परिणामों (चित्रा 2 एन) के अनुरूप, माइक्रोग्लिया, न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की बड़ी संख्या थी, जबकि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स कम से कम प्रचुर मात्रा में थे।

Figure 1
चित्रा 1: मिश्रित न्यूरोनल और ग्लियल संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए वर्णित विधि का योजनाबद्ध अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ई 17 सीएनएस संस्कृतियों को समय के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग सेल मार्करों के लिए दाग दिया गया। कोशिकाओं को अलग-अलग आबादी की कल्पना करने के लिए परमेबिलाइज्ड और दागदार होने से पहले 4% पीएफए के साथ तय किया गया था। (ए, डी, जी, जे, एम) विकास मार्कर एनजी 2 (ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाएं) और नेस्टीन (न्यूरोनल और ग्लियल अग्रदूत कोशिकाएं), (बी, ई, एच, के, एन) न्यूरोनल मार्कर एसएमआई 31 (अक्षतंतु), एमबीपी (माइलिन), और न्यून (न्यूरॉन सेल बॉडी), और (सी, एफ, आई, एल, ओ) ग्लियल मार्कर सीएनपी (ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स), जीएफएपी (एस्ट्रोसाइट्स), और आईबीए 1 (माइक्रोग्लिया)। स्केल बार = 50 μm. (P) DAPI प्रति मिमी2, n = 3 की गणना, प्रत्येक n प्रति तीन प्रतियों में 10 छवियों की तकनीकी तीन प्रतियों से। (Q) सेल डीएपीआई + कोशिकाओं (माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स) के प्रतिशत और दृश्य क्षेत्र (एस्ट्रोसाइट्स) के प्रतिशत के रूप में गिना जाता है, एन = 3, प्रत्येक एन प्रति तीन प्रतियों की 10 छवियों की तकनीकी तीन प्रतियों से। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की ± मानक त्रुटि हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: समय के साथ ई 17 सीएनएस संस्कृतियों का सेमलिकी वन वायरस (एसएफवी) संक्रमण। असंक्रमित नियंत्रण संस्कृतियों (ए, सी, ई, जी) और 0.05 एमओआई एसएफवी (बी, डी, एफ, एच) से संक्रमित संस्कृतियों की प्रतिनिधि छवियां। कोशिकाओं को 0-48 घंटे के लिए संक्रमित किया गया था और सीएनपी (ऑलिगोडेंड्रोसाइट मार्कर) और न्यून (न्यूरॉन मार्कर) (ए-डी) या जीएफएपी (एस्ट्रोसाइट मार्कर) और आईबीए 1 (माइक्रोग्लियल मार्कर) (ई-एच) से दाग दिया गया था। सफेद तीर एक संक्रमित कोशिका का संकेत देते हैं। एसएफवी का यह तनाव वायरल संक्रमण के अनुरेखण को सक्षम करने के लिए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन जेडएसग्रीन को व्यक्त करता है। स्केल सलाखों = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आईएफएन -β उपचार के बाद ई17 सीएनएस संस्कृतियों की सीसीएल 5 एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति। कोशिकाओं को आईएफएन -β की खुराक की एक श्रृंखला के साथ 24 घंटे के लिए 6-वेल प्लेट प्रारूप (एमआरएनए) या 96-वेल प्लेट प्रारूप (प्रोटीन) में इलाज किया गया था। (ए) 0-100 एनजी /एमएल आईएफएन -β, जैविक एन = 2 के साथ उपचार के बाद सीसीएल 5 एमआरएनए की अभिव्यक्ति, प्रत्येक तकनीकी तीन प्रतियों से लिया गया है। (बी) 0-100 एनजी/एमएल आईएफएन उपचार के बाद सतह पर तैरनेवाला में सीसीएल 5 सांद्रता, जैविक एन = 1, तकनीकी तीन प्रतियों से लिया गया। (सी) लॉग ट्रेंडलाइन के साथ सुपरनैटेंट में सेलुलर एमआरएनए सीसीएल 5 अपरेगुलेशन बनाम सीसीएल 5 प्रोटीन एकाग्रता। त्रुटि पट्टियाँ SEM ± हैं. कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ई 17 सीएनएस संस्कृतियों से एकल-कोशिका आबादी उत्पन्न करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। कोशिकाओं को 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके अलग किया गया था, उचित एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था, और व्यक्तिगत सेल आबादी में क्रमबद्ध किया गया था। (A-C) जीवित, एकल कोशिकाओं के लिए क्रमबद्ध करने की रणनीति। (डी) माइक्रोग्लिया (सीडी 45 + सीडी 11 बी +) के लिए चयन करने की रणनीति। (ई) ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (सीडी 45- सीडी 11 बी- ओ 4 +) का चयन करने की रणनीति। (एफ) एस्ट्रोसाइट्स (सीडी 45- सीडी 11 बी- ओ 4- एसीएसए -2 + सीडी 24 +) और न्यूरॉन्स (सीडी 45- सीडी 11 बी- ओ 4- एसीएसए -2- सीडी 24 +) के लिए क्रमबद्ध करने की रणनीति। (जी) अलग-अलग सेल आबादी एक-दूसरे पर हावी हो जाती है, जो असतत आबादी दिखाती है। (एच) क्रमबद्ध कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में अलग-अलग सेल प्रकार, एन = 4। त्रुटि पट्टियाँ SEM ± हैं. कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आवश्यक प्रारूप बीए-पीएलएल / धोने के लिए पानी प्लेटिंग मीडिया (पीएम) में वॉल्यूम सेल को प्लेट आउट किया जाता है। मीडिया को टॉप अप करना संस्कृतियों को खिलाते समय निकालें / जोड़ें (3x / सप्ताह)
6 अच्छी तरह से प्रारूप (9.6cm2) 1000 μL 1000 μL 1000 μL -400 μL -500 μL मीडिया
+600 μL DM+ +600 μL DM+/-
96 अच्छी तरह से प्रारूप (0.32 सेमी2) 100μL 100 μL 50 μL +60 μL DM+ -50 μL मीडिया
+60 μL DM+/-
डिश प्रारूप में कवरस्लिप 20 एमएल प्रति 200 कवरलिप्स 20 एमएल 100 μL per coverslip +600 μL DM+ -500 μL मीडिया
+300 μL PM +600 μL DM+/-

तालिका 1: लेपित ऊतक संस्कृति प्लास्टिक की तैयारी के लिए आवश्यक मात्रा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सीएनएस एक जटिल नेटवर्क है जो मस्तिष्क से रीढ़ की हड्डी तक फैला हुआ है और इसमें कई सेल प्रकार होते हैं, मुख्य रूप से न्यूरॉन्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया1। चूंकि प्रत्येक कोशिका की होमोस्टैसिस को बनाए रखने और सीएनएस 9,10,11 में चुनौतियों के लिए उचित प्रतिक्रिया उत्पन्न करने में महत्वपूर्ण भूमिका होती है, एक संस्कृति प्रणाली जिसमें ये सभी सेल प्रकार शामिल होते हैं, यह जांचने के लिए एक उपयोगी और बहुमुखी उपकरण है कि मस्तिष्क उत्तेजना पर कैसे प्रतिक्रिया कर सकता है। इन विट्रो संदर्भ में इन कोशिकाओं और उनकी बातचीत का अध्ययन करने की क्षमता का मतलब है कि विभिन्न प्रयोगात्मक प्रश्नों की आसानी से जांच करने के लिए विभिन्न प्रकार की तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है। हमने प्रसवपूर्व मस्तिष्क से मुख्य सीएनएस सेल प्रकारों को प्राप्त करने और कल्चर करने के लिए एक त्वरित और कुशल विधि की रूपरेखा तैयार की है, जो वयस्क माउस मस्तिष्क12 में व्यक्तिगत सेल आबादी की नकल कर सकती है।

सीएनएस संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए पहले से स्थापित प्रोटोकॉल ई 13.5 रीढ़ की हड्डी 4,5 का उपयोग करते हैं। रीढ़ की हड्डी के लिए एक उपयुक्त मॉडल होने के अलावा, एक मॉडल होना अत्यधिक प्रासंगिक है जो मस्तिष्क को पुन: उत्पन्न करता है। इसलिए, इन E13.5 चूहों के दिमाग मूल रूप से उसी प्रोटोकॉल का उपयोग करके यहां वर्णित सीएनएस संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए गए थे। हालांकि, DIV14 के बाद, कोशिकाओं ने घनी आबादी वाले न्यूरोनल सेल निकायों के साथ बड़े समुच्चय बनाना शुरू कर दिया। जबकि एस्ट्रोसाइट्स मौजूद थे, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या वे समान रूप से वितरित किए गए थे। यह स्पष्ट नहीं है कि इन कोशिका निकायों के केंद्र में कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम से पर्याप्त पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्राप्त होंगे जैसा कि बाहर की कोशिकाएं करेंगी। ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की कमी का अनुभव करते समय, न्यूरॉन्स एपोप्टोसिस के माध्यम से जाने और ग्लियल कोशिकाओं13 को तनाव संकेत जारी करने के लिए उत्तरदायी होते हैं, जिससे प्रोइन्फ्लेमेटरी फेनोटाइप14 हो सकता है। न्यूरोजेनेसिस को इन घनी पैक समुच्चय का एक संभावित कारण माना जाता था, और यह चरण ई 1715 तक कम हो जाता है। जब ई 17 माउस भ्रूण से दिमाग का उपयोग किया गया था, तो कोशिकाओं ने अभी भी नेटवर्क का गठन किया, लेकिन ई 13.5 में देखे गए बड़े समुच्चय में क्लस्टर नहीं किया, और इसलिए मस्तिष्क संस्कृतियों से उत्पन्न होने के लिए अधिक उपयुक्त आयु के रूप में माना जाता था।

वर्तमान तकनीक के परिणामस्वरूप एक गर्भावस्था से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या अधिक होती है (3-4 x 106 कोशिकाओं / रीढ़ की हड्डी की तुलना में औसत 1 x 107 कोशिकाएं / मस्तिष्क)। 8-10 भ्रूण वाले औसत गर्भवती माउस के लिए, यह 6-वेल प्लेट प्रारूप में 54 विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों या माइक्रोस्कोपी के लिए 150 प्रयोगात्मक स्थितियों (रीढ़ की हड्डी से क्रमशः 19 और 64 की तुलना में) से संबंधित है। जैसे, ये सीएनएस संस्कृतियां चूहों की आवश्यक संख्या को कम करने के लिए एक महान उपकरणहैं। विशेष रूप से, 96-वेल प्रारूप का उपयोग आसानी से उच्च थ्रूपुट परख के लिए किया जा सकता है, जैसे कि जानवरों में परीक्षण से पहले दवा उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग को सक्षम करना, इस तरह के अध्ययनों के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को काफी कम करना। यह उम्मीद है कि जानवरों में सीएनएस दवाओं के परीक्षण की कम सफलता दर में सुधार होगाऔर मनुष्यों में नैदानिक परीक्षणों के अनुवाद में सुधार होगा।

संस्कृतियां DIV21 तक चरम परिपक्वता तक पहुंचती हैं। सेल की गिनती इस समय बिंदु तक बढ़ जाती है, जिसके बाद कोशिकाएं प्रत्येक प्रकार के सेल की घटती संख्या के साथ विघटित होने लगती हैं। यह परिमाणित सेल संख्या (चित्रा 2 एन) के साथ-साथ पाइनॉटिक नाभिक (घने डीएपीआई दाग) की संख्या (चित्रा 2 एम) को देखकर मापा गया था। जबकि विकासात्मक मार्कर नेस्टिन और एनजी 2 अभी भी DIV14 (चित्रा 2G) और DIV21 (चित्रा 2J) पर व्यक्त किए जाते हैं, यह एस्ट्रोग्लिओसिस से गुजरने वाले कुछ एस्ट्रोसाइट्स के कारण है, जो नेस्टिन19 को नियंत्रित करता है, जबकि कुछ ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स पूरी तरह से परिपक्व नहीं होते हैं और इसलिए अभी भी कुछ NG2 20 व्यक्त करते हैं। माइक्रोस्कोपी सत्यापन के आधार पर, कोशिकाओं का केवल एक छोटा सा हिस्सा अभी भी डीआईवी 21 (चित्रा 2 आई, एल) द्वारा पूरी तरह से परिपक्व कोशिकाओं की तुलना में विकास ता्मक मार्करों को व्यक्त करता है; इसलिए, संस्कृतियां इस समय तक काफी हद तक परिपक्व हो जाती हैं। ध्यान दें, विवो में, माइक्रोग्लिया का घनत्व मुराइन सीएनएस में अत्यधिक परिवर्तनशील है। माइक्रोग्लिया का स्तर, जैसा कि माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके आईबीए 1 अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया है,हमारी संस्कृतियों में इस घनत्व के उच्च अंत में है। फ्लो साइटोमेट्री प्रक्रिया से बचने वाले माइक्रोग्लिया का उच्च प्रतिशत माइक्रोग्लिया के अन्य सीएनएस कोशिकाओं की तुलना में अधिक मजबूत होने की संभावना है, जिसमें आम तौर पर नाजुक एक्सटेंशन होते हैं, और इसलिए फ्लो साइटोमेट्री तैयारी के दौरान क्षतिग्रस्त होने की अधिक संभावना होती है।

विच्छेदन के बाद केवल 3 सप्ताह लगते हैं जब तक कि कोशिकाएं प्रयोग के लिए तैयार नहीं होती हैं, जो अधिकांश मानव-आधारित इन विट्रो विधियों की तुलना में कम है, जैसे कि ऑर्गेनोइड्स या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मॉडल21। जब तक नए चिकित्सीय की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए विवो अनुसंधान की आवश्यकता होती है, तब तक हमारे जैसे इन विट्रो सेल संवर्धन विधियों का उपयोग करने से जानवरों में परीक्षण से पहले विषाक्तता और प्रभावकारिता का कुशलतापूर्वक परीक्षण करने में सहायता मिलेगी, जानवरों की आवश्यकता कम हो जाएगी और इन विट्रो से विवो में अनुसंधान के अनुवाद को बढ़ाया जाएगा।उम्मीद है, यह अंततः मानव-आधारित नैदानिक परीक्षणों के लिए अधिक कुशल अनुवाद का नेतृत्व करेगा। अंततः, इन संस्कृतियों को सीएनएस के अध्ययन की अनुमति देने के लिए बनाया गया था। जबकि इन विट्रो सिस्टम सीएनएस की जटिलता को पूरी तरह से व्यक्त नहीं कर सकते हैं, प्राथमिक सेल-व्युत्पन्न संस्कृतियां विवो सीएनएस गुणों22,23 में अधिक सटीक रूप से प्रतिनिधित्व करती हैं। इन विट्रो दृष्टिकोण प्रतिरक्षा कोशिकाओं24 और रक्त-मस्तिष्क बाधा अखंडता25 में घुसपैठ की अनुपस्थिति में सीएनएस की जांच करने के लिए अधिक रिडक्टिव दृष्टिकोण की अनुमति दे सकते हैं। जटिलता की इस परत को हटाने से तंत्र को सुलझाना आसान हो सकता है। जैसे, वर्तमान संवर्धन प्रणाली अनुसंधान प्रश्नों का उत्तर देने के लिए एक उपयोगी उपकरण है जो विवो पशु अनुसंधान में पूरक है।

सीएनएस कोशिकाओं की कटाई, अलगाव और संवर्धन की क्षमता ने पहले से ही जन्मजात सीएनएस16 की हमारी समझ को बहुत उन्नत किया है। यह लेख ई 17 माउस दिमाग के विच्छेदन और सीएनएस के सभी मुख्य सेल प्रकारों वाले सेल कल्चर सिस्टम को उत्पन्न करने के लिए कोशिकाओं के परिणामस्वरूप पुनरावृत्ति और संवर्धन को प्रदर्शित करता है। इन संस्कृतियों पर कई आणविक तकनीकों को नियोजित किया गया है, जो सीएनएस की जांच के लिए इन संस्कृतियों की प्रभावशीलता को दर्शाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम एडगर और लाइनिंगटन प्रयोगशालाओं के सदस्यों, विशेष रूप से प्रोफेसर क्रिस लाइनिंगटन, डॉ डायना आर्सेनी और डॉ कटजा मुक्लिश को उनकी सलाह, उपयोगी टिप्पणियों और संस्कृतियों को खिलाने में सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, जबकि हम इन संस्कृतियों को स्थापित करते हैं। सेल प्रोफाइलर पाइपलाइनों के लिए शुरुआती बिंदु प्रदान करने के लिए डॉ म्यूक्लिश को विशेष धन्यवाद। इस काम को एमएस सोसाइटी (अनुदान 122) और यूरी और लोर्ना चेर्नाजोव्स्की फाउंडेशन द्वारा एमपी को समर्थित किया गया था; ग्लासगो विश्वविद्यालय जेसी और एमपी को वित्त पोषण; और वेलकम ट्रस्ट (217093/जेड/19/जेड) और मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एमआरवी0109721) जीजेजी के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Trypsin Sigma T4549-100ML To digest tissue
140 mm TC Dish Fisher 11339283 Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon Sarstedt 62554502 To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle Henke Sass Wolf 4710012040 For trituration of sample
21 G needle BD 304432 For trituration of sample
23 G needle Henke Sass Wolf 4710006030 For trituration of sample
35 mm TC Dish Corning 430165 Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe Fisher 15869152 For trituration of sample
6 well plate Corning 3516 To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux Fisher DIS080010R To put brains intp
96 well plate Corning 3596 To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE Miltenyi 130-123-284 For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps Dumont 0108-5/45-PO For dissection
Biotin Sigma B4501 For DM+/-
Boric Acid Sigma B6768-500G For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 Biolegend 101825 For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 Biolegend 103139 For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 Biolegend 101243 For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V Sigma A3059-10G For SD Inhibitor
CNP Abcam AB6319 Mature oligodendrocytes
Coverslip VWR 631-0149 To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors Sigma S3146-1EA For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine Gibco 21969-035 For DM+/-, and for plating media
DNase I Thermofisher 18047019 For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I Sigma D4263 For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermofisher 65-0865-14 Live / Dead stain
Fine forceps Dumont 0102-SS135-PO For dissection
GFAP Invitrogen 13-0300 Astrocytes
HBSS w Ca Mg Sigma H9269-500ML For plating media
HBSS w/o Ca Mg Sigma H9394-500ML For brains to be added to
Horse Serum Gibco 26050-070 For plating media
Hydrocortisone Sigma H0396 For DM+/-
Iba1 Alpha-Laboratories 019-1971 Microglia
Insulin Sigma I1882 For DM+
Leibovitz L-15 GIbco 11415-049 For SD Inhibitor
MBP Bio-Rad MCA409S Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit BioTechne DY478-05 ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement Sigma N6530-5ML For DM+/-
Nestin Merck MAB353 Neuronal stem/progenitor cells
NeuN Thermofisher PA578499 Neuronal cell body
NG2 Sigma AB5320 Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC Miltenyi 130-119-155 For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep Sigma P0781-100ML For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide Sigma P1274 For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31 BioLegend 801601 Axons
Sodium Tetraborate Sigma 221732-100G For boric acid buffer
Trizol Thermofisher 15596026 For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T9003-100MG For SD Inhibitor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
  4. Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
  5. Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
  6. Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
  7. Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
  8. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  9. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
  10. Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
  11. Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
  12. Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
  13. Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
  14. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
  15. Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
  16. Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
  17. Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
  18. Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
  19. Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
  20. Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
  21. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
  22. Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
  23. Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
  24. Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
  25. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).

Tags

इस महीने JoVE में अंक 196
संक्रमण और जन्मजात प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए भ्रूण माउस दिमाग से मिश्रित न्यूरोनल और ग्लियल सेल संस्कृतियों की स्थापना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gamble, A., Suessmilch, M.,… More

Gamble, A., Suessmilch, M., Bonestroo, A., Merits, A., Graham, G. J., Cavanagh, J., Edgar, J. M., Pingen, M. Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity. J. Vis. Exp. (196), e65331, doi:10.3791/65331 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter