संक्रमण और जन्मजात प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए भ्रूण माउस दिमाग से मिश्रित न्यूरोनल और ग्लियल सेल संस्कृतियों की स्थापना
Summary
यह प्रोटोकॉल न्यूरो (इम्यूनो) लॉजी अनुसंधान के लिए भ्रूण के दिन 17 माउस दिमाग से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सेल संस्कृतियों को उत्पन्न करने का एक अनूठा तरीका प्रस्तुत करता है। इस मॉडल का विश्लेषण आरटी-क्यूपीसीआर, माइक्रोस्कोपी, एलिसा और फ्लो साइटोमेट्री सहित विभिन्न प्रयोगात्मक तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है।
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के मॉडल को विवो में पाए जाने वाले परस्पर कोशिकाओं के जटिल नेटवर्क को फिर से तैयार करना चाहिए।सीएनएस में मुख्य रूप से न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया होते हैं। पशु उपयोग को बदलने और कम करने के बढ़ते प्रयासों के कारण, जन्मजात सेल गुणों का पता लगाने के लिए विभिन्न प्रकार के इन विट्रो सेल कल्चर सिस्टम विकसित किए गए हैं, जो सीएनएस संक्रमण और विकृति के लिए चिकित्सीय विकास की अनुमति देते हैं। जबकि कुछ शोध प्रश्नों को मानव-आधारित सेल कल्चर सिस्टम द्वारा संबोधित किया जा सकता है, जैसे कि (प्रेरित) प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल, मानव कोशिकाओं के साथ काम करने की उपलब्धता, लागत और नैतिकता के संबंध में अपनी सीमाएं हैं। यहां, हम भ्रूण माउस दिमाग से कोशिकाओं को अलग करने और संवर्धन करने के लिए एक अद्वितीय प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परिणामस्वरूप मिश्रित तंत्रिका कोशिका संस्कृतियां विवो में मस्तिष्क में पाए जाने वाले कई सेल आबादी और इंटरैक्शन की नकल करती हैं। वर्तमान समकक्ष विधियों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल मस्तिष्क की विशेषताओं की अधिक बारीकी से नकल करता है और अधिक कोशिकाओं को भी इकट्ठा करता है, इस प्रकार एक गर्भवती माउस से अधिक प्रयोगात्मक स्थितियों की जांच करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत आसान और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। इन संस्कृतियों को विभिन्न पैमानों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें 96-अच्छी तरह से आधारित उच्च थ्रूपुट स्क्रीन, 24-वेल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण और फ्लो साइटोमेट्री और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) विश्लेषण के लिए 6-वेल कल्चर शामिल हैं। यह संस्कृति विधि इन विट्रो विधियों की सुविधा के साथ सीएनएस की कुछ जटिलता के संदर्भ में संक्रमण और प्रतिरक्षा की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की हमारी समझ में सुधार कई न्यूरोइन्फ्लेमेटरी और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए चिकित्सीय विकल्पों में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है। सीएनएस, मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और ऑप्टिक नसों के भीतर परस्पर जुड़ी कोशिकाओं का एक जटिल नेटवर्क है, जिसमें न्यूरॉन्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और उनकी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं, माइक्रोग्लिया1 शामिल हैं। एक इन विट्रो दृष्टिकोण अक्सर सार्थक शोध करने के लिए आवश्यक चूहों की संख्या को काफी कम कर सकता है; हालांकि, सीएनएस की जटिल प्रकृति सेल लाइनों का उपयोग करके विवो स्थिति को फिर से परिभाषित करना असंभव बनाती है। मिश्रित तंत्रिका कोशिका संस्कृतियां प्रतिस्थापन, कमी और शोधन (3आर) सिद्धांतों2,3 के अनुरूप, एक प्रासंगिक मॉडल में न्यूरो (इम्यूनो) लॉजी प्रश्नों की जांच करने के लिए एक अत्यंत मूल्यवान शोध उपकरण प्रदान करती हैं।
थॉमसन एट अल ने प्रसवपूर्व रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं का उपयोग करके एक सेल कल्चर विधि का वर्णन किया जो उपरोक्त सभी मुख्य सीएनएससेल प्रकारों में अंतर करता है। इस प्रणाली में सिनैप्स गठन, माइलिनेटेड अक्षतंतु और रैनवियर के नोड्स भी हैं। इस संवर्धन विधि की मुख्य सीमा यह है कि, रीढ़ की हड्डी होने के नाते, यह मस्तिष्क को उपयोगी रूप से मॉडल नहीं करता है, और भ्रूण के दिन 13 (ई 13) रीढ़ की हड्डी से कोशिका की पैदावार संकुचित हो रही है। इस प्रकार, यह प्रयोगात्मक स्थितियों की संख्या को सीमित करता है जिनकी जांच की जा सकती है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य एक नई सेल संस्कृति प्रणाली विकसित करना है जो जानवरों के लिए आवश्यकताओं को कम करने के लिए बढ़ी हुई सेल उपज के साथ मस्तिष्क की विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करता है।
एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में थॉमसन एट अल का उपयोग करते हुए, हमने प्रसवपूर्व माउस दिमाग से विशुद्ध रूप से प्राप्त एक सेल कल्चर मॉडल विकसित किया। इन संस्कृतियों में रीढ़ की हड्डी संस्कृतियों के समान सेल आबादी, इंटरकनेक्टिविटी और उपचार के विकल्प हैं, सिवाय इसके कि तुलना से कम माइलिनेशन है। हालांकि, लगभग तीन गुना अधिक सेल उपज के साथ एक सीएनएस इन विट्रो मॉडल होना अधिक कुशल है, जिसमें कम चूहों और कम समय प्रसंस्करण भ्रूण की आवश्यकता होती है। हमने इस अनूठी संस्कृति प्रणाली को कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों और पैमानों के लिए अनुकूलित किया, जिसमें माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए ग्लास कवरलिप्स और प्लास्टिक वेल प्लेटों के विभिन्न आकारों का उपयोग करना शामिल है, जिसमें उच्च थ्रूपुट अनुसंधान के लिए 96-वेल प्लेटें शामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएनएस एक जटिल नेटवर्क है जो मस्तिष्क से रीढ़ की हड्डी तक फैला हुआ है और इसमें कई सेल प्रकार होते हैं, मुख्य रूप से न्यूरॉन्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया1। चूंकि प्रत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एडगर और लाइनिंगटन प्रयोगशालाओं के सदस्यों, विशेष रूप से प्रोफेसर क्रिस लाइनिंगटन, डॉ डायना आर्सेनी और डॉ कटजा मुक्लिश को उनकी सलाह, उपयोगी टिप्पणियों और संस्कृतियों को खिलाने में सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, जबकि हम इन संस्कृतियों को स्थापित करते हैं। सेल प्रोफाइलर पाइपलाइनों के लिए शुरुआती बिंदु प्रदान करने के लिए डॉ म्यूक्लिश को विशेष धन्यवाद। इस काम को एमएस सोसाइटी (अनुदान 122) और यूरी और लोर्ना चेर्नाजोव्स्की फाउंडेशन द्वारा एमपी को समर्थित किया गया था; ग्लासगो विश्वविद्यालय जेसी और एमपी को वित्त पोषण; और वेलकम ट्रस्ट (217093/जेड/19/जेड) और मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एमआरवी0109721) जीजेजी के लिए।
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
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