Etablera blandade neuronala och gliacellskulturer från embryonala mushjärnor för att studera infektion och medfödd immunitet
Summary
Detta protokoll presenterar ett unikt sätt att generera cellkulturer i centrala nervsystemet från embryonala mushjärnor dag 17 för neuro(immun)logiforskning. Denna modell kan analyseras med hjälp av olika experimentella tekniker, inklusive RT-qPCR, mikroskopi, ELISA och flödescytometri.
Abstract
Modeller av centrala nervsystemet (CNS) måste rekapitulera det komplexa nätverket av sammankopplade celler som finns in vivo. CNS består främst av neuroner, astrocyter, oligodendrocyter och mikroglia. På grund av ökande ansträngningar för att ersätta och minska djuranvändningen har en mängd olika in vitro-cellodlingssystem utvecklats för att utforska medfödda cellegenskaper, vilket möjliggör utveckling av terapeutiska medel för CNS-infektioner och patologier. Medan vissa forskningsfrågor kan behandlas av humanbaserade cellodlingssystem, såsom (inducerade) pluripotenta stamceller, har arbetet med mänskliga celler sina egna begränsningar när det gäller tillgänglighet, kostnader och etik. Här beskriver vi ett unikt protokoll för att isolera och odla celler från embryonala mushjärnor. De resulterande blandade neurala cellkulturerna efterliknar flera cellpopulationer och interaktioner som finns i hjärnan in vivo. Jämfört med nuvarande ekvivalenta metoder efterliknar detta protokoll närmare hjärnans egenskaper och samlar också fler celler, vilket möjliggör att mer experimentella förhållanden kan undersökas från en gravid mus. Vidare är protokollet relativt enkelt och mycket reproducerbart. Dessa kulturer har optimerats för användning i olika skalor, inklusive 96-brunnsbaserade skärmar med hög genomströmning, 24-brunnsmikroskopianalys och 6-brunnskulturer för flödescytometri och omvänd transkription-kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) analys. Denna odlingsmetod är ett kraftfullt verktyg för att undersöka infektion och immunitet inom ramen för en del av komplexiteten i CNS med bekvämligheten av in vitro-metoder.
Introduction
Att förbättra vår förståelse av centrala nervsystemet (CNS) är avgörande för att förbättra terapeutiska alternativ för många neuroinflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar. CNS, ett komplext nätverk av sammankopplade celler i hjärnan, ryggmärgen och optiska nerver, består av neuroner, oligodendrocyter, astrocyter och deras medfödda immunceller, microglia1. Ett in vitro-tillvägagångssätt kan ofta drastiskt minska antalet möss som krävs för att utföra meningsfull forskning; CNS: s komplexa natur gör det emellertid omöjligt att rekapitulera in vivo-situationen med hjälp av cellinjer. Blandade neurala cellkulturer ger ett extremt värdefullt forskningsverktyg för att undersöka neuro(immun)logiska frågor i en relevant modell, i linjemed principerna Replacement, Reduction and Refinement (3R) 2,3.
Thomson et al. beskrev en cellodlingsmetod med prenatala ryggmärgsceller som differentieras till alla de ovan nämnda huvudsakliga CNS-celltyperna4. Detta system har också synapsbildning, myeliniserade axoner och noder av Ranvier. Huvudbegränsningen med denna odlingsmetod är att den, eftersom den är ryggmärg, inte på ett användbart sätt modellerar hjärnan, och cellutbytet från embryonal dag 13 (E13) ryggmärg är sammandragande. Således begränsar detta antalet experimentella förhållanden som kan undersökas. Därför syftade denna studie till att utveckla ett nytt cellodlingssystem som rekapitulerar hjärnans egenskaper med ökat cellutbyte för att minska kraven på djur.
Med Thomson et al. som utgångspunkt utvecklade vi en cellodlingsmodell som enbart härrör från prenatala mushjärnor. Dessa kulturer har samma cellpopulationer, sammankoppling och behandlingsalternativ som ryggmärgskulturerna, förutom att det finns mindre myelinisering i jämförelse. Att ha en CNS-in vitro-modell med ett ungefär trefaldigt högre cellutbyte är dock effektivare, vilket kräver färre möss och mindre tid att bearbeta embryon. Vi optimerade detta unika odlingssystem för flera nedströmsapplikationer och skalor, inklusive användning av glastäckglas för mikroskopianalys och olika storlekar av plastbrunnsplattor, inklusive 96-brunnsplattor för forskning med hög genomströmning.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNS är ett komplext nätverk som sträcker sig från hjärnan ner till ryggmärgen och består av många celltyper, främst neuroner, oligodendrocyter, astrocyter och microglia1. Eftersom varje cell har en viktig roll för att upprätthålla homeostas och generera lämpliga svar på utmaningar i CNS 9,10,11, är ett odlingssystem som innehåller alla dessa celltyper ett användbart och mångsidigt verktyg för att undersöka h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Edgar och Linington labs, särskilt Prof. Chris Linington, Dr Diana Arseni och Dr Katja Muecklisch, för deras råd, hjälpsamma kommentarer och hjälp med att mata kulturerna medan vi sätter upp dessa kulturer. Ett särskilt tack går till Dr Muecklisch för att tillhandahålla utgångspunkterna för Cell Profiler-rörledningarna. Detta arbete stöddes av MS Society (bidrag 122) och Yuri och Lorna Chernajovsky foundation till MP; University of Glasgow finansiering till JC och MP; och Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) och Medical Research Council (MRV0109721) till GJG.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).
