Summary
Detta protokoll presenterar ett unikt sätt att generera cellkulturer i centrala nervsystemet från embryonala mushjärnor dag 17 för neuro(immun)logiforskning. Denna modell kan analyseras med hjälp av olika experimentella tekniker, inklusive RT-qPCR, mikroskopi, ELISA och flödescytometri.
Abstract
Modeller av centrala nervsystemet (CNS) måste rekapitulera det komplexa nätverket av sammankopplade celler som finns in vivo. CNS består främst av neuroner, astrocyter, oligodendrocyter och mikroglia. På grund av ökande ansträngningar för att ersätta och minska djuranvändningen har en mängd olika in vitro-cellodlingssystem utvecklats för att utforska medfödda cellegenskaper, vilket möjliggör utveckling av terapeutiska medel för CNS-infektioner och patologier. Medan vissa forskningsfrågor kan behandlas av humanbaserade cellodlingssystem, såsom (inducerade) pluripotenta stamceller, har arbetet med mänskliga celler sina egna begränsningar när det gäller tillgänglighet, kostnader och etik. Här beskriver vi ett unikt protokoll för att isolera och odla celler från embryonala mushjärnor. De resulterande blandade neurala cellkulturerna efterliknar flera cellpopulationer och interaktioner som finns i hjärnan in vivo. Jämfört med nuvarande ekvivalenta metoder efterliknar detta protokoll närmare hjärnans egenskaper och samlar också fler celler, vilket möjliggör att mer experimentella förhållanden kan undersökas från en gravid mus. Vidare är protokollet relativt enkelt och mycket reproducerbart. Dessa kulturer har optimerats för användning i olika skalor, inklusive 96-brunnsbaserade skärmar med hög genomströmning, 24-brunnsmikroskopianalys och 6-brunnskulturer för flödescytometri och omvänd transkription-kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) analys. Denna odlingsmetod är ett kraftfullt verktyg för att undersöka infektion och immunitet inom ramen för en del av komplexiteten i CNS med bekvämligheten av in vitro-metoder.
Introduction
Att förbättra vår förståelse av centrala nervsystemet (CNS) är avgörande för att förbättra terapeutiska alternativ för många neuroinflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar. CNS, ett komplext nätverk av sammankopplade celler i hjärnan, ryggmärgen och optiska nerver, består av neuroner, oligodendrocyter, astrocyter och deras medfödda immunceller, microglia1. Ett in vitro-tillvägagångssätt kan ofta drastiskt minska antalet möss som krävs för att utföra meningsfull forskning; CNS: s komplexa natur gör det emellertid omöjligt att rekapitulera in vivo-situationen med hjälp av cellinjer. Blandade neurala cellkulturer ger ett extremt värdefullt forskningsverktyg för att undersöka neuro(immun)logiska frågor i en relevant modell, i linjemed principerna Replacement, Reduction and Refinement (3R) 2,3.
Thomson et al. beskrev en cellodlingsmetod med prenatala ryggmärgsceller som differentieras till alla de ovan nämnda huvudsakliga CNS-celltyperna4. Detta system har också synapsbildning, myeliniserade axoner och noder av Ranvier. Huvudbegränsningen med denna odlingsmetod är att den, eftersom den är ryggmärg, inte på ett användbart sätt modellerar hjärnan, och cellutbytet från embryonal dag 13 (E13) ryggmärg är sammandragande. Således begränsar detta antalet experimentella förhållanden som kan undersökas. Därför syftade denna studie till att utveckla ett nytt cellodlingssystem som rekapitulerar hjärnans egenskaper med ökat cellutbyte för att minska kraven på djur.
Med Thomson et al. som utgångspunkt utvecklade vi en cellodlingsmodell som enbart härrör från prenatala mushjärnor. Dessa kulturer har samma cellpopulationer, sammankoppling och behandlingsalternativ som ryggmärgskulturerna, förutom att det finns mindre myelinisering i jämförelse. Att ha en CNS-in vitro-modell med ett ungefär trefaldigt högre cellutbyte är dock effektivare, vilket kräver färre möss och mindre tid att bearbeta embryon. Vi optimerade detta unika odlingssystem för flera nedströmsapplikationer och skalor, inklusive användning av glastäckglas för mikroskopianalys och olika storlekar av plastbrunnsplattor, inklusive 96-brunnsplattor för forskning med hög genomströmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök följde lokala lagar och riktlinjer för djuranvändning och godkändes av den lokala etikprövningskommittén vid University of Glasgow. Djur hölls under specifika patogenfria förhållanden i enlighet med UK Animals Scientific Procedures Act 1986, under överinseende av en UK Home Office Project License. För denna studie användes egna uppfödda vuxna C57BL / 6J-möss. Användning av unga kvinnor (8-12 veckor) rekommenderas på grund av den högre framgångsgraden för graviditeten. Hanar kan återanvändas för flera omgångar av avel. Figur 1 representerar en schematisk översikt över den beskrivna metoden för att generera blandade neuronala och gliakulturer.
1. Beredning av förbrukningsvaror för vävnadsodling
- Förbered tallrikar och/eller tallrikar som innehåller mikroskopitäcken inuti ett säkerhetsskåp av klass 2. Sterilisera alla reagens eller autoklav för att säkerställa sterilitet under odlingsperioden.
- Tillsätt lämplig volym BA-PLL (13,2 μg/ml poly-L-lysinhydrobromid [PLL] i borsyrabuffert [BA] [50 mM borsyra, 12,5 mM natriumtetraborat, pH 8,5]; se materialtabell) till varje brunn (1 000 μl/brunn i en 6-brunnsplatta, 100 μl/brunn i en 96-brunnsplatta; volymerna sammanfattas i tabell 1). För mikroskopitäckglas, tillsätt 20 ml BA-PLL till en vävnadsodlingsskål med en diameter på 9 cm innehållande 200 sterila täckglas och virvla för att fördela jämnt.
- Inkubera vid 37 °C i 1–2 timmar.
- Ta bort BA-PLL-lösningen från varje brunn eller skål som innehåller mikroskopitäckglas och tvätta genom att tillsätta 20 ml sterilt vatten, virvla täckglasen och sedan ta bort vattnet. Upprepa detta tvättsteg tre gånger. För en skål som innehåller täckglas, lämna sterilt vatten i vävnadsodlingsskålen på den slutliga tvätten för att enkelt ta bort täckglasen.
- Ta bort så mycket vätska som möjligt med en steril pipett och låt torka i minst 2 timmar till över natten.
- Förvara de belagda plattorna vid 4 °C i upp till 2 månader.
OBS: Den beredda borsyran med poly-l-lysin (BA-PLL) lösning kan återanvändas upp till tre gånger, tillsätt ny PLL varje gång. Förvara BA-PLL vid 4 °C. Rätter behandlas med BA-PLL, eftersom PLL tillåter cellerna att sticka ner och växa. Utan denna behandling kommer cellerna att lyfta efter cirka 1 veckas odling och inte längre kunna differentiera.
2. Dissektion av E17 embryonala hjärnor
- Samhysa en eller flera honmöss med en hanmus. Kontrollera kvinnorna dagligen för en slempropp, vilket indikerar att parning har ägt rum.
OBS: Alla "pluggade" honmöss måste separeras från hanen för att säkerställa rätt startdatum för dräktigheten. Möss kan vägas för att bekräfta graviditet eller övervakas visuellt. - Slakta den dräktiga musen vid E17 med lämpliga metoder i enlighet med lokala djurskyddsriktlinjer och lagar, till exempel genom att höja koncentrationen av koldioxid (CO2), en dödlig överdos av bedövningsmedel eller förskjutning av nacken.
OBS: Den valda metoden får inte störa embryona. För denna studie användes exponering för en stigande koncentration av koldioxidgas följt av bekräftelse av döden genom att skära av lårbensartären för att slakta gravida dammar. - Placera den utgallrade, gravida musen på ryggen på ett dissektionskort; Även om det inte är nödvändigt att fästa det, kan det göra det lättare för oerfarna forskare. Nyp mittlinjen i buken med pincett. Använd en skarp sax, skär upp buken genom huden och bukhinnan över mittlinjen från könsorganen till bröstkorgen, var försiktig så att du inte punkterar livmodern.
- Musens livmoder har två horn, var och en innehåller vanligtvis ett till fem embryon. Ta bort livmodern som innehåller embryon från moderen och placera den omedelbart på is.
- Skär genom äggula säcken på sidan av placenta, var försiktig så att du inte skadar embryon och ta bort embryon från äggula säcken.
- Omedelbart halshugga embryonerna. Lägg de halshuggna huvudena i en skål med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) utan kalcium (Ca 2+) och magnesium (Mg2+) (HBSS-/-) på is.
OBS: Om genotypning krävs kan man ta bort svansen i detta skede för genetisk analys. När flera genotyper förväntas bör huvudet på varje embryo hållas separat för odling. - Använd vinklade pincett och placera huvudet på sidan vänd åt vänster.
- Pierce ögat med ena kanten av pincetten, håll hakan fast med den andra.
- Börja vid nacken, riv försiktigt hårbotten längs mittlinjen mot nosens spets.
- Gå in genom ryggmärgen, märkbar som en vit oval, använd de vinklade pincetterna för att spricka upp skallen längs mittlinjen och exponera hjärnan.
- Dra försiktigt bort skallen på sidan uppåt och exponera hjärnan.
- Lyft hjärnan ur skallen, kassera skallen när hjärnan har tagits bort helt.
- Använd pincetten, ta bort meningesna, som är märkbara som ett tunt membran med täta blodkärl.
- Placera hjärnorna i en bijou (se materialtabell) som innehåller 2 ml HBSS-/- på is.
- Upprepa steg 2.6 till 2.13 med de återstående hjärnorna och lägg till upp till fyra hjärnor per bijou.
- Tillsätt 250 μL 10x trypsin till bijou och triturera hjärnorna genom att skaka bijou. Inkubera i 15 minuter vid 37 °C.
OBS: Alla steg från denna punkt och framåt bör utföras i en steril vävnadsodlingshuv. - Tina 2 ml sojaböntrypsinhämmare (SD) (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml trypsinhämmare från sojabönor, 40 μg/ml DNas I, 3 mg/ml bovint serumalbumin [BSA] fraktion V; se Materialförteckning) från -20 °C genom att placera den vid 37 °C.
- Tillsätt 2 ml SD-hämmare till varje bijou som innehåller hjärnor (per bijou som innehåller upp till fyra hjärnor), skaka bijou igen för att sprida den jämnt.
OBS: SD-hämmare minskar trypsinaktiviteten för att förhindra onödig matsmältning av proverna och bevara cellens livskraft. - Utan centrifugering, avlägsna 2 ml av supernatanten från varje bijou och överför till ett 15 ml centrifugrör, var försiktig så att du inte överför cellklumpar.
- Triturera de återstående cellerna i bijou med en 19 G nål fäst vid en 5 ml spruta genom att aspirera suspensionen två gånger. Detta kommer att skapa en tjock slemliknande blandning.
- Upprepa två gånger till med en 21 G nål. Om det finns klumpar kvar, triturera en gång till med 21 G-nålen.
- Överför cellerna från bijou till samma 15 ml centrifugrör (från steg 2.18) med en 23 G nål.
- Centrifugera vid 200 x g vid rumstemperatur (RT) i 5 minuter.
- Ta bort all supernatant med en 5 ml serologisk pipett och överför den till ett annat 15 ml centrifugrör, var försiktig så att den inte stör den lösa pelleten i botten som innehåller de nödvändiga cellerna.
- Centrifugera supernatanten igen vid 200 x g vid rumstemperatur i 5 minuter.
OBS: Detta steg är inte nödvändigt, men om man behöver många celler eller har få embryon, kan man utföra detta steg för att återställa så många celler som möjligt från supernatanten. - Använd 10 ml pläteringsmedium (PM) (49% Dulbeccos modifierade örnmedium [DMEM], 1% penicillin / streptomycin [Pen/Strep], 25% hästserum, 25% HBSS med Ca 2+ och Mg2+ [HBSS +/+]; se materialtabell), kombinera och resuspendera de två pelletsna tillsammans för att skapa en hel cellsuspension.
- Räkna cellerna med trypanblått och antingen en hemocytometer eller digital cellräknare och späd cellsuspensionen med PM till en koncentration av 1,8 x 106 celler / ml.
3. Plätering av cellerna
- Lägg till erforderlig volym av cellsuspensionen till önskat format enligt tabell 1: 1 000 μl per brunn i 6-brunnsformat, 50 μl per brunn i 96-brunnsformat eller 100 μl per täckglas.
- Inkubera i 2-4 timmar vid 37 °C med 5%-7% CO2. Kontrollera att cellerna har fastnat med hjälp av ett inverterat mikroskop.
- Ta bort mediet och fyll på med nya differentieringsmedier (DM+: DM- inklusive 10 μg/ml insulin. DM-: DMEM, 1% Pen / Strep, 50 nM hydrokortison, 10 ng / ml biotin, 2,5 ml 100x N1 media tillägg; se Materialförteckning). Volymerna beskrivs närmare i tabell 1. Tryck ner eventuella flytande täckglas med en steril pipettspets.
4. Bevara kulturerna
OBS: Dessa kulturer kräver utfodring tre gånger i veckan för att stödja optimal tillväxt och differentiering. Kulturerna kommer att nå optimal hälsa och mognad för experiment på DIV (dagar in vitro) 21. Celler kan hållas i kultur i upp till 28 dagar, varefter kulturerna snabbt degenererar.
- Tre gånger i veckan fram till DIV12, ersätt en del av supernatanten med färsk DM+ genom att avlägsna 500 μL per brunn i 6-brunnsformat, 50 μL per brunn i 96-brunnsformat eller 500 μL per skål som innehåller tre täckglas, och tillsätta 600 μL per brunn i 6-brunnsformat, 60 μL per brunn i 96-brunnsformat, eller 600 μl per täckskiffer (tabell 1).
- Tre gånger i veckan från DIV13 och framåt, ersätt en del av supernatanten med färsk DM- genom att avlägsna 500 μL per brunn i 6-brunnsformat, 50 μL per brunn i 96-brunnsformat eller 500 μL per skål innehållande tre täckglas, och tillsätta 600 μL per brunn i 6-brunnsformat, 60 μL per brunn i 96-brunnsformat, eller 600 μl per täckskiffer (tabell 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskopi
Kulturer som odlas på glasöverdrag är idealiska att analysera med mikroskopi. För att visualisera utvecklingen av kulturerna fixerades täckglasen i 4% paraformaldehyd (PFA) vid flera tidpunkter från DIV0 (när celler fästes) till DIV28. Kulturerna färgades för immunofluorescensavbildning som tidigare beskrivits5 med tre olika färgningskombinationer: NG2 (omogna oligodendrocyter) och nestin (neuronala stam-/stamceller) som utvecklingsmarkörer, SMI31 (axoner), MBP (myelin) och NeuN (neuroncellkropp) som neuronala markörer, eller CNP (oligodendrocyter), GFAP (astrocyter) och Iba1 (mikroglia) som gliamarkörer (figur 2).
De olika celltyperna kvantifierades med hjälp av CellProfiler-pipelines (baserat på ′,6-diamidino-2-fenylindolpositiv (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). Varje enskild datapunkt genererades från i genomsnitt 10 bilder tagna från tre täckblad per tidpunkt. För mikroglia, neuroner och oligodendrocyter beräknades procentandelen celltyp per 4′,6-diamidino-2-fenylindolpositiv (DAPI +) cell. Det procentuella synfältet användes istället för antalet celler för att kvantifiera antalet astrocyter. Detta berodde på svårigheter att skilja mellan de enskilda cellerna eftersom de ofta överlappade varandra (figur 2M,N). Kulturerna nådde maximal mognad och celltäthet vid DIV21, varefter kulturerna började brytas ned (figur 2N).
Det är viktigt att dessa kulturer lätt kan behandlas med läkemedel, såsom potentiella terapier, eller användas för att spåra in vitro-infektioner . I detta exempel överfördes kulturer på täckglas till en platta med 24 brunnar och infekterades med det mycket neurotropa viruset Semliki Forest virus (SFV) (stam SFV6)6, som uttrycker zsGreen i infekterade celler. En mängd infektioner (MOI-antalet viruspartiklar tillsatta per cell) på 0,05, titrerade på njurceller från babyhamster (BHK), användes för att säkerställa infektion på låg nivå. Efter 0-72 h efter infektion (hpi) fixerades odlingarna i 4% PFA och färgades för analys med immunofluorescerande avbildning. Figur 3 illustrerar att SFV, i linje med in vivo-infektion , huvudsakligen infekterar oligodendrocyter och neuroner6.
qRT-PCR
Förutom mikroskopi kan dessa CNS-kulturer användas för analys med molekylära metoder, såsom RT-qPCR av mRNA-svar på behandling. För att ytterligare undersöka det medfödda antivirala svaret behandlades 6-brunnsplattkulturer med en rad doser av det potenta antivirala cytokininterferon-beta (IFN-β) i 24 timmar. Odlingar lyserades med guanidiumtiocyanat/fenol och RNA isolerades, omvandlades till cDNA och analyserades med qPCR som tidigare beskrivits7. Med hjälp av denna metod kan differentiellt uttryck av många gener mätas. Här kvantifierades uppregleringen av Ccl5 mot hushållsgenen 18. CCL5 är ett kemotaktiskt cytokin (kemokin) involverat i det inflammatoriska svaret. IFN-β behandling resulterade i en uppreglering av Ccl5-mRNA i kulturerna (figur 4A).
Enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA)
Kulturformatet med 96 brunnar är ett utmärkt verktyg för screening av behandlingar med hög genomströmning. För att undersöka om uppregleringen av Ccl5 mRNA resulterar i uttryck av CCL5-protein mättes CCL5 i supernatanten av kulturerna med ELISA, enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell). I detta exempel behandlades 96-brunnskulturer i två exemplar med 27 inkrementella doser av IFN-β för att generera en dos-responskurva (figur 4B). I linje med det ökade mRNA-uttrycket (figur 4A) skedde en ökning av CCL5 som frisattes i supernatanten. Som förväntat visar figur 4C en tydlig korrelation mellan mRNA och proteinuttryck.
Flödescytometri
Flödescytometri är ett kraftfullt verktyg för att samtidigt undersöka uttrycket av många intra- och/eller extracellulära markörer. Att analysera komplexa, mycket interaktiva kulturer med flödescytometri kan dock vara utmanande på grund av cellskador och död när man tar celler från odling till en encellssuspension för bearbetning och analys. Genom att jämföra en mängd olika protokoll med användning av 0,05% -0,5% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 1x-10x trypsin utan EDTA och mild dissociationsreagens, fann man att efter behandling av 6-brunnsplattkulturerna med 0,05% trypsin-EDTA i 10 minuter vid 37 ° C med mild omrörning, lyftes cellerna med mild trituration för att skapa en encellssuspension. Speciellt för flödescytometrisk analys av CNS-celler är det viktigt att vara försiktig under cellberedningen, minimera tvättsteg och vara mycket noga med att hålla cellerna vid 4 ° C eller på is hela tiden.
För att bedöma livskraften och celltyperna i denna encellssuspension färgades cellerna med ett livskraftigt färgämne och fluorescerande märkta antikroppar mot CD45, CD11b, O4, ACSA-2 och CD24 för att möjliggöra visualisering av varje enskild cellpopulation i kulturerna8 (figur 5). Cirka 70% cellviabilitet erhölls från denna metod, i genomsnitt cirka 2 x 10 6 livskraftiga, enskilda celler per 6-brunnsplatta (figur 5C). I linje med mikroskopiresultaten (figur 2N) fanns det ett stort antal mikroglia, neuroner och astrocyter, medan oligodendrocyter var minst rikliga.
Figur 1: Schematisk översikt över den beskrivna metoden för att generera blandade neuronala och gliakulturer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: E17 CNS-kulturer färgade för immunofluorescensavbildande cellmarkörer över tid. Celler fixerades med 4% PFA innan de permeabiliserades och färgades för att visualisera olika populationer. Representativa bilder av (A,D,G,J,M) utvecklingsmarkörer NG2 (oligodendrocytprekursorceller) och nestin (neuronala och gliaprekursorceller), (B,E,H,K,N) neuronmarkörer SMI31 (axoner), MBP (myelin) och NeuN (neuroncellkropp) och (C,F,I,L,O) gliamarkörer CNP (oligodendrocyter), GFAP (astrocyter) och Iba1 (mikroglia). Skalstreck = 50 μm. (P) Antal DAPI per mm2, n = 3, var och en n från tekniska triplater med 10 bilder per trippel. (Q) Cellantal som en procentandel av DAPI + -celler (mikroglia, oligodendrocyter och neuroner) och procentandel av synfältet (astrocyter), n = 3, var och en n från tekniska triplikater med 10 bilder per trippel. Felstaplar är ± standardfel för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Semliki Forest virus (SFV) infektion av E17 CNS-kulturer över tid. Representativa bilder av oinfekterade kontrollkulturer (A,C,E,G) och kulturer infekterade med 0,05 MOI SFV (B,D,F,H). Cellerna infekterades i 0-48 timmar och färgades med CNP (oligodendrocytmarkör) och NeuN (neuronmarkör) (AD) eller GFAP (astrocytmarkör) och Iba1 (mikroglialmarkör) (E-H). Vita pilar indikerar en infekterad cell. Denna stam av SFV uttrycker det gröna fluorescerande proteinet zsGreen för att möjliggöra spårning av virusinfektion. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: CCL5 mRNA och proteinuttryck av E17 CNS-kulturer efter IFN-β behandling. Cellerna behandlades i 6-brunnsplattformat (mRNA) eller 96-brunnsplattformat (protein) i 24 timmar med ett intervall av doser av IFN-β. (A) Uttryck av Ccl5 mRNA efter behandling med 0-100 ng/ml IFN-β, biologiskt n = 2, vardera taget från tekniska triplikater. B) CCL5-koncentrationen i supernatanten efter 0-100 ng/ml IFNβ-behandling, biologisk n = 1, tagen från tekniska triplikat. (C) Cellulär mRNA Ccl5-uppreglering kontra CCL5-proteinkoncentration i supernatanten med log trendline. Felstaplar är ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Flödescytometri gating strategi för att generera encellspopulationer från E17 CNS-kulturer. Cellerna dissocierades med 0,05% trypsin-EDTA, färgades med lämpliga antikroppar och sorterades i enskilda cellpopulationer. (A–C) Gating strategi för att sortera efter levande, enskilda celler. (D) Strategi för att välja för mikroglia (CD45 + CD11b +). (E) Strategi för att välja oligodendrocyter (CD45- CD11b- O4+). (F) Strategi för sortering efter astrocyter (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+ CD24+) och neuroner (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) Enskilda cellpopulationer överlagrade på varandra och visar diskreta populationer. (H) Enskilda celltyper i procent av det totala antalet celler som sorteras, n = 4. Felstaplar är ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Obligatoriskt format | BA-PLL/brunn | Vatten för tvätt | Volymceller i pläteringsmedia (PM) för att platta ut | Fylla på media | Ta bort/lägg till vid utfodring av kulturer (3x/vecka) |
| 6 brunn format (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL Media |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| 96 brunnsformat (0.32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL DM+ | -50 μL Media |
| +60 μL DM+/- | |||||
| Täckglas i skålformat | 20 ml per 200 täckglas | 20 ml | 100 μl per täckglas | +600 μL DM+ | -500 μL Media |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
Tabell 1: Erforderliga volymer för beredning av belagd vävnadsodlingsplast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CNS är ett komplext nätverk som sträcker sig från hjärnan ner till ryggmärgen och består av många celltyper, främst neuroner, oligodendrocyter, astrocyter och microglia1. Eftersom varje cell har en viktig roll för att upprätthålla homeostas och generera lämpliga svar på utmaningar i CNS 9,10,11, är ett odlingssystem som innehåller alla dessa celltyper ett användbart och mångsidigt verktyg för att undersöka hur hjärnan kan reagera på en stimulans. Möjligheten att studera dessa celler och deras interaktioner i ett in vitro-sammanhang innebär att en mängd olika tekniker kan användas för att enkelt undersöka olika experimentella frågor. Vi har skisserat en snabb och effektiv metod för att erhålla och odla de viktigaste CNS-celltyperna från den prenatala hjärnan, som kan efterlikna enskilda cellpopulationer i den vuxna mushjärnan12.
Tidigare etablerade protokoll för generering av CNS-kulturer använder E13.5 ryggmärg 4,5. Förutom att ha en lämplig modell för ryggmärgen är det mycket relevant att ha en modell som rekapitulerar hjärnan. Därför användes hjärnor från dessa E13.5-möss ursprungligen för att generera CNS-kulturerna som beskrivs här med samma protokoll. Men efter DIV14 började cellerna bilda stora aggregat med tätt packade neuronala cellkroppar. Medan astrocyter var närvarande är det inte klart om de var jämnt fördelade. Det är oklart om cellerna i mitten av dessa cellkroppar skulle få tillräckligt med näringsämnen och syre från odlingsmediet som cellerna utanför skulle. När man upplever syre och näringsbrist kan neuroner gå igenom apoptos och släppa stresssignaler till gliaceller13, vilket kan leda till en proinflammatorisk fenotyp14. Neurogenes ansågs vara en trolig orsak till dessa tätt packade aggregat, och denna fas avtar med E1715. När hjärnor från E17-musembryon användes bildade cellerna fortfarande nätverk men kluster inte i de stora aggregat som ses i E13.5 och ansågs därför vara en lämpligare ålder för hjärnkulturerna att genereras från.
Den nuvarande tekniken resulterar också i ett större antal celler från en graviditet (i genomsnitt 1 x 10 7 celler/hjärna jämfört med 3-4 x 106 celler/ryggmärg)7. För en genomsnittlig gravid mus med 8-10 embryon korrelerar detta med upp till 54 olika experimentella förhållanden i 6-brunnsplattformatet, eller 150 experimentella betingelser för mikroskopi (jämfört med 19 respektive 64 från ryggmärgen). Som sådan är dessa CNS-kulturer ett utmärkt verktyg för att minska det nödvändiga antalet möss16. I synnerhet kan 96-brunnsformatet enkelt användas för analyser med hög genomströmning, till exempel för att möjliggöra screening av läkemedelskandidater före testning på djur, vilket avsevärt minskar antalet djur som krävs för sådana studier. Detta kommer förhoppningsvis att förbättra den låga framgångsgraden för att testa CNS-läkemedel på djur och förbättra översättningen till kliniska prövningar på människor17,18.
Kulturerna når toppmognad vid DIV21. Cellantalet ökar fram till denna tidpunkt, varefter cellerna börjar degenerera med minskande antal av varje typ av cell. Detta mättes både genom att titta på de kvantifierade cellnumren (figur 2N) samt antalet pyknotiska kärnor (täta DAPI-fläckar) (figur 2M). Medan utvecklingsmarkörerna nestin och NG2 fortfarande uttrycks på DIV14 (figur 2G) och DIV21 (figur 2J), beror detta på att några av astrocyterna går igenom astroglios, vilket uppreglerar nestin19, medan några av oligodendrocyterna inte är helt mogna och därför fortfarande uttrycker en del NG220. Baserat på mikroskopivalideringen uttrycker endast en liten del av cellerna fortfarande utvecklingsmarkörer jämfört med de fullt mogna cellerna med DIV21 (figur 2I, L); Därför är kulturerna i stort sett mogna vid denna tid. Observera att in vivo är densiteten av microglia mycket varierande över murin CNS. Nivån av mikroglia, som definieras av Iba1-uttryck med mikroskopi, ligger i den höga änden av denna densitet i våra kulturer12. Den höga andelen mikroglia som överlever flödescytometriproceduren beror sannolikt på att mikroglia är mer robust än andra CNS-celler, som i allmänhet har känsliga förlängningar och därför är mer benägna att skadas under flödescytometriberedning.
Det tar bara 3 veckor efter dissektion tills cellerna är redo för experiment, vilket är kortare än de flesta humanbaserade in vitro-metoder, såsom organoider eller inducerade pluripotenta stamcellshärledda modeller21. Så länge in vivo-forskning krävs för att säkerställa säkerheten för nya terapier, kommer användning av in vitro-cellodlingsmetoder som vår att hjälpa till att testa toxicitet och effektivitet effektivt före testning på djur, minska behovet av djur och förbättra översättningen av forskning från in vitro till in vivo. Förhoppningsvis kommer detta så småningom att leda till effektivare översättning till humanbaserade kliniska prövningar också. I slutändan skapades dessa kulturer för att möjliggöra studier av CNS. Även om in vitro-system inte fullt ut kan uttrycka komplexiteten hos CNS, representerar primära cellhärledda kulturer mer exakt in vivo CNS-egenskaper 22,23. In vitro-metoder kan möjliggöra en mer reduktiv metod för att undersöka CNS i frånvaro av infiltrerande immunceller24 och blod-hjärnbarriärens integritet25. Att ta bort detta lager av komplexitet kan göra det lättare att riva upp mekanismer. Som sådant är det nuvarande odlingssystemet ett användbart verktyg för att svara på forskningsfrågor som kompletterar in vivo djurförsök.
Förmågan att skörda, isolera och odla CNS-celler har redan i hög grad avancerat vår förståelse av den medfödda CNS16. Denna artikel demonstrerar dissektionen av E17-mushjärnor och den resulterande triturationen och odlingen av cellerna för att generera ett cellodlingssystem som innehåller alla huvudcelltyper i CNS. Flera molekylära tekniker har använts på dessa kulturer, vilket visar hur effektiva dessa kulturer har för att undersöka CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Edgar och Linington labs, särskilt Prof. Chris Linington, Dr Diana Arseni och Dr Katja Muecklisch, för deras råd, hjälpsamma kommentarer och hjälp med att mata kulturerna medan vi sätter upp dessa kulturer. Ett särskilt tack går till Dr Muecklisch för att tillhandahålla utgångspunkterna för Cell Profiler-rörledningarna. Detta arbete stöddes av MS Society (bidrag 122) och Yuri och Lorna Chernajovsky foundation till MP; University of Glasgow finansiering till JC och MP; och Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) och Medical Research Council (MRV0109721) till GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
