فحص القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية
Summary
يعد الاستهداف الدوائي للقنوات الأيونية نهجا واعدا لعلاج الأورام الصلبة. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتوصيف وظيفة القناة الأيونية في الخلايا السرطانية وفحص آثار معدلات القناة الأيونية على صلاحية السرطان.
Abstract
القنوات الأيونية ضرورية لنمو الخلايا والحفاظ على الاتزان الداخلي الخلوي. يساهم اضطراب وظيفة القناة الأيونية في تطوير مجموعة واسعة من الاضطرابات أو اعتلال القنوات. تستخدم الخلايا السرطانية القنوات الأيونية لدفع تطورها ، وكذلك للتحسن كورم واستيعابها في بيئة دقيقة تضم العديد من الخلايا غير السرطانية. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي الزيادات في مستويات عوامل النمو والهرمونات داخل البيئة المكروية للورم إلى تعزيز تعبير القناة الأيونية ، مما يساهم في تكاثر الخلايا السرطانية وبقائها. وبالتالي ، فإن الاستهداف الدوائي للقنوات الأيونية من المحتمل أن يكون نهجا واعدا لعلاج الأورام الخبيثة الصلبة ، بما في ذلك سرطانات الدماغ الأولية والنقيلي. هنا ، يتم وصف بروتوكولات لتوصيف وظيفة القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية وطرق تحليل معدلات القنوات الأيونية لتحديد تأثيرها على صلاحية السرطان. وتشمل هذه تلطيخ خلية (خلايا) لقناة (قنوات) أيونية ، واختبار الحالة المستقطبة للميتوكوندريا ، وإنشاء وظيفة القناة الأيونية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية ، وإجراء فحوصات الجدوى لتقييم فعالية الدواء.
Introduction
تعد بروتينات النقل الغشائي ضرورية للتواصل بين الخلايا، وكذلك للحفاظ على الاتزان الداخلي الخلوي. من بين بروتينات نقل الأغشية ، تعمل القنوات الأيونية على دفع نمو الخلايا وتطورها والحفاظ على حالة الخلايا في البيئات الصعبة والمتغيرة. كما تم الإبلاغ عن القنوات الأيونية لدفع ودعم تطور الأورام الصلبة ، سواء بشكل منهجي أو في الجهاز العصبي المركزي (CNS)1,2. على سبيل المثال ، قنوات KCa3.1 مسؤولة عن تنظيم إمكانات الغشاء والتحكم في حجم الخلية ، وهو أمر مهم في تنظيم دورة الخلية. تم الإبلاغ عن قنوات KCa3.1 المعيبة للمساهمة في الانتشار غير الطبيعي للخلايا السرطانية3. علاوة على ذلك ، قد تساهم القنوات الأيونية في الانتشار النقيلي للسرطانات. على سبيل المثال ، تشارك قنوات إمكانات المستقبلات العابرة (TRP) في تدفق الكالسيوم 2+ والمغنيسيوم2+. ينشط هذا التدفق العديد من الكينازات وبروتينات الصدمة الحرارية التي تعمل على تنظيم المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالورم ، والتي بدورها مهمة لبدء ورم خبيث للسرطان4.
نظرا لأن القنوات الأيونية يمكن أن تساهم في تطور السرطانات ، فقد تكون أيضا أهدافا لعلاج السرطان المرتبط بالأدوية. على سبيل المثال ، ترتبط مقاومة طرق العلاج ، بما في ذلك العلاج الكيميائي والعلاج المناعي الجديد ، بعدم تنظيم وظيفة القناة الأيونية5،6،7. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر القنوات الأيونية كأهداف دوائية مهمة لإعاقة نمو وتطور السرطانات ، مع فحص الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة المعاد استخدامها (المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء) ، وكذلك البوليمرات الحيوية ، بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة1،2،8،9. في حين كان هناك تقدم كبير على هذه الجبهة ، لا يزال اكتشاف دواء سرطان القناة الأيونية متخلفا. ويرجع ذلك جزئيا إلى التحديات الفريدة لدراسة القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية. على سبيل المثال ، هناك قيود تقنية في إعداد مقايسات الفيزيولوجيا الكهربية للمركبات بطيئة المفعول والاختلافات الزمنية في تنشيط القناة وعمل الدواء. علاوة على ذلك ، يمكن أن تعيق قابلية ذوبان المركبات التقدم أيضا ، حيث أن معظم أنظمة الفيزيولوجيا الكهربية الآلية المستخدمة عادة اليوم تستخدم ركائز كارهة للماء ، والتي قد تساهم في القطع الأثرية نتيجة الامتزاز المركب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاجات الجزيئية العضوية الحيوية الكبيرة مثل المنتجات الطبيعية والببتيدات والأجسام المضادة وحيدة النسيلة تمثل تحديا تقنيا للفحص باستخدام فحوصات الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية10. أخيرا ، تظل الخصائص الكهربائية الحيوية للخلايا السرطانية غير مفهومةبشكل جيد 11.
وفي الوقت نفسه ، غالبا ما يكون تلطيخ التألق المناعي للقنوات الأيونية أمرا صعبا. ويرجع ذلك جزئيا إلى تعقيد هياكلها وسياقها في الغشاء ، مما يؤثر على القدرة على توليد واستخدام الأجسام المضادة لدراسات الفحص المجهري. من المهم بشكل خاص التحقق من صحة الأجسام المضادة المستخدمة لتلطيخ القنوات الأيونية للتأكد من خصوصيتها وتقاربها وقابليتها للتكاثر. يجب النظر في الأجسام المضادة التجارية للقنوات الأيونية بناء على استراتيجية التحقق من صحتها وسجل النشر. يجب أن تتضمن التجارب ضوابط سلبية لإثبات عدم وجود ارتباط غير محدد إما عن طريق ضربة قاضية أو خروج المغلوب من البروتين المستهدف. بدلا من ذلك ، قد تكون خطوط الخلايا التي يكون فيها البروتين المستهدف غائبا أو بوفرة منخفضة بناء على تحديد mRNA أو البروتين بمثابة ضوابط سلبية. على سبيل المثال ، تظهر هذه الدراسة توطين الوحدة الفرعية لمستقبلات (GABA) Gabra5 في خط خلايا الورم الأرومي النخاعي (D283). تم تلطيخ خلايا D283 ذات ضربة قاضية siRNA وخلايا Daoy ، وهي خط آخر من خلايا الورم الأرومي النخاعي المخيخي ، ل Gabra5 ولم تظهر أي تلطيخ ملموس (البيانات غير معروضة).
هنا ، يتم تقديم طرق لتحليل وفحص وظيفة القناة الأيونية ، وكذلك تأثير معدلات القناة الأيونية على الخلايا السرطانية. يتم توفير بروتوكولات ل (1) خلايا تلطيخ لقناة أيونية ، (2) اختبار الحالة المستقطبة للميتوكوندريا ، (3) إنشاء وظيفة القناة الأيونية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية ، و (4) التحقق من صحة الأدوية في المختبر. تؤكد هذه البروتوكولات على دراسات مستقبلات حمض جاما أمينوبتيريك من النوع A (GABAA)2،12،13،14،15،16 ، وقناة أنيون كلوريد ومستقبلات ناقل عصبي مثبط رئيسي. ومع ذلك ، فإن الطرق المعروضة هنا تنطبق على دراسة العديد من الخلايا السرطانية والقنوات الأيونية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
التغييرات في وظيفة القناة الأيونية تغير شلالات الإشارات داخل الخلايا ، والتي يمكن أن تؤثر على الأداء العام للخلية. على مدى العقد الماضي ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن القنوات الأيونية مهمة لنمو الخلايا السرطانية وورم خبيث. الأهم من ذلك ، أن العديد من القنوات الأيونية هي أهداف أساسية للعل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالدعم المقدم من مؤسسة عائلة توماس إي وباميلا ميشيل إلى إس إس وتمويل مؤسسة هارولد سي شوت لكرسي هارولد سي سكوت الممنوح ، كلية الطب بجامعة كاليفورنيا ، إلى إس إس.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
References
- Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
- Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
- Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
- Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
- Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
- Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
- Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
- Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
- Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
- Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
- Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
- Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
- Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
- Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
- Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
- Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
- Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
- Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
- Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
- Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
- Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
- Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
- Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
- Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
- Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
- Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
- Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).
