Detección de canales iónicos en células cancerosas
Summary
La focalización farmacológica de los canales iónicos es un enfoque prometedor para el tratamiento de tumores sólidos. Se proporcionan protocolos detallados para caracterizar la función de los canales iónicos en las células cancerosas y analizar los efectos de los moduladores de los canales iónicos en la viabilidad del cáncer.
Abstract
Los canales iónicos son fundamentales para el desarrollo celular y el mantenimiento de la homeostasis celular. La perturbación de la función de los canales iónicos contribuye al desarrollo de una amplia gama de trastornos o canalopatías. Las células cancerosas utilizan canales iónicos para impulsar su propio desarrollo, así como para mejorar como tumor y asimilarse en un microambiente que incluye varias células no cancerosas. Además, los aumentos en los niveles de factores de crecimiento y hormonas dentro del microambiente tumoral pueden resultar en una mayor expresión de canales iónicos, lo que contribuye a la proliferación y supervivencia de las células cancerosas. Por lo tanto, la focalización farmacológica de los canales iónicos es potencialmente un enfoque prometedor para el tratamiento de neoplasias malignas sólidas, incluidos los cánceres cerebrales primarios y metastásicos. En este trabajo se describen protocolos para caracterizar la función de los canales iónicos en células cancerosas y enfoques para analizar los moduladores de los canales iónicos para determinar su impacto en la viabilidad del cáncer. Estos incluyen la tinción de una célula para un canal iónico, la prueba del estado polarizado de las mitocondrias, el establecimiento de la función del canal iónico mediante electrofisiología y la realización de ensayos de viabilidad para evaluar la potencia del fármaco.
Introduction
Las proteínas transportadoras de membrana son fundamentales para la comunicación entre las células, así como para mantener la homeostasis celular. Entre las proteínas transportadoras de membrana, los canales iónicos sirven para impulsar el crecimiento y desarrollo de las células y para mantener el estado de las células en entornos desafiantes y cambiantes. También se ha descrito que los canales iónicos impulsan y apoyan el desarrollo de tumores sólidos, tanto sistémicamente como en el sistema nervioso central (SNC)1,2. Por ejemplo, los canales KCa3.1 son responsables de regular el potencial de membrana y controlar el volumen celular, lo cual es importante en la regulación del ciclo celular. Se ha descrito que los canales defectuosos de KCa3.1 contribuyen a la proliferación anormal de las células tumorales3. Además, los canales iónicos pueden contribuir a la diseminación metastásica de los cánceres. Los canales de potencial receptor transitorio (TRP), por ejemplo, están implicados en la entrada de Ca 2+ y Mg2+; Esta afluencia activa varias quinasas y proteínas de choque térmico que funcionan para regular la matriz extracelular que rodea a un tumor, lo que a su vez es importante para iniciar la metástasis del cáncer4.
Dado que los canales iónicos pueden contribuir al desarrollo de cánceres, también pueden ser objetivos para el tratamiento del cáncer relacionado con medicamentos. Por ejemplo, la resistencia a las modalidades de tratamiento, incluida la quimioterapia y la inmunoterapia novedosa, está relacionada con la desregulación de la función de los canales iónicos 5,6,7. Además, los canales iónicos están emergiendo como importantes dianas farmacológicas para impedir el crecimiento y el desarrollo de cánceres, con fármacos de moléculas pequeñas reutilizados (aprobados por la FDA) que se están examinando, así como biopolímeros, incluidos los anticuerpos monoclonales 1,2,8,9. Si bien ha habido muchos avances en este frente, el descubrimiento de fármacos contra el cáncer por canales iónicos sigue estando poco desarrollado. Esto se debe en parte a los desafíos únicos de estudiar los canales iónicos en las células cancerosas. Por ejemplo, existen limitaciones técnicas en la configuración de ensayos electrofisiológicos para compuestos de acción lenta y diferencias temporales en la activación del canal y la acción del fármaco. Además, la solubilidad de los compuestos también puede impedir el progreso, ya que la mayoría de los sistemas de electrofisiología automatizados que se utilizan habitualmente hoy en día utilizan sustratos hidrófobos, que pueden contribuir a la formación de artefactos como resultado de la adsorción de los compuestos. Además, las terapias moleculares bioorgánicas de gran tamaño, como los productos naturales, los péptidos y los anticuerpos monoclonales, son técnicamente difíciles de cribar mediante ensayos de electrofisiología convencionales10. Por último, las propiedades bioeléctricas de las células cancerosas siguen siendo poco conocidas11.
Mientras tanto, la tinción por inmunofluorescencia de los canales iónicos suele ser un reto. Esto se debe, en parte, a la complejidad de sus estructuras y su contexto en la membrana, que afectan a la capacidad de generar y emplear anticuerpos para estudios de microscopía. Es especialmente importante que los anticuerpos utilizados para teñir los canales iónicos sean validados en cuanto a especificidad, afinidad y reproducibilidad. Los anticuerpos comerciales para los canales iónicos deben considerarse en función de su estrategia de validación y su historial de publicación. Los experimentos deben incluir controles negativos para demostrar la falta de unión inespecífica por knockdown o knockout de la proteína diana. Alternativamente, las líneas celulares en las que la proteína diana está ausente o en baja abundancia en función de las determinaciones de ARNm o proteínas pueden servir como controles negativos. Por ejemplo, este estudio muestra la localización de la subunidad del receptor (GABA) Gabra5 en una línea celular de meduloblastoma (D283). Las células D283 con una eliminación de siRNA y las células Daoy, otra línea celular de meduloblastoma cerebeloso, se tiñeron para Gabra5 y no mostraron tinción apreciable (datos no mostrados).
Aquí, se presentan métodos para analizar y ensayar la función de los canales iónicos, así como el efecto de los moduladores de los canales iónicos en las células cancerosas. Se proporcionan protocolos para (1) teñir células para un canal iónico, (2) probar el estado polarizado de las mitocondrias, (3) establecer la función del canal iónico mediante electrofisiología y (4) validación in vitro del fármaco. Estos protocolos enfatizan los estudios del receptor 2,12,13,14,15,16 del ácido gamma-aminobutírico tipo A (GABAA), un canal de anión cloruro y un receptor de neurotransmisor inhibidor mayor. Sin embargo, los métodos presentados aquí se aplican al estudio de muchas otras células cancerosas y canales iónicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los cambios en la función de los canales iónicos alteran las cascadas de señalización intracelular, lo que puede afectar el funcionamiento general de una célula. Durante la última década, se ha vuelto cada vez más claro que los canales iónicos son importantes para el crecimiento y la metástasis de las células cancerosas. Es importante destacar que muchos canales iónicos son objetivos primarios para terapias aprobadas dirigidas a una amplia gama de trastornos24. Los investigadores han i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo de la Fundación de la Familia Thomas E. y Pamela M. Mischell a S.S. y el financiamiento de la Fundación Harold C. Schott de la Cátedra Harold C. Schott de la Facultad de Medicina de la UC, a S.S.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
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