בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים
Summary
המיקוד הפרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בגידולים מוצקים. פרוטוקולים מפורטים ניתנים לאפיון תפקוד תעלות היונים בתאים סרטניים ולהערכת ההשפעות של אפנון תעלות יונים על כדאיות הסרטן.
Abstract
תעלות יונים הן קריטיות להתפתחות התא ולשמירה על הומאוסטזיס התא. ההפרעה בתפקוד תעלת היונים תורמת להתפתחות מגוון רחב של הפרעות או תעלות. תאים סרטניים מנצלים תעלות יונים כדי להניע את התפתחותם, כמו גם כדי להשתפר כגידול ולהיטמע במיקרו-סביבה הכוללת תאים לא סרטניים שונים. יתר על כן, עלייה ברמות גורמי הגדילה וההורמונים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול יכולה לגרום לביטוי משופר של תעלות יונים, מה שתורם להתרבות תאים סרטניים ולהישרדותם. לפיכך, מיקוד פרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בממאירויות מוצקות, כולל סרטן מוח ראשוני וגרורתי. להלן מתוארים פרוטוקולים לאפיון תפקודן של תעלות יונים בתאים סרטניים וגישות לניתוח מודולטורים של תעלות יונים כדי לקבוע את השפעתם על כדאיות הסרטן. אלה כוללים צביעת תא(ים) עבור תעלות יונים, בדיקת המצב המקוטב של מיטוכונדריה, ביסוס תפקוד תעלת יונים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, וביצוע בדיקות כדאיות כדי להעריך את עוצמת התרופה.
Introduction
חלבוני הובלת ממברנות הם קריטיים לתקשורת בין תאים, כמו גם לשמירה על הומאוסטזיס תאי. בין חלבוני הובלת הממברנה, תעלות יונים משמשות להנעת גדילה והתפתחות של תאים ולשמירה על מצב התאים בסביבות מאתגרות ומשתנות. כמו כן, דווח כי תעלות יונים מניעות ותומכות בהתפתחות גידולים מוצקים, הן מערכתית והן במערכת העצבים המרכזית (CNS)1,2. לדוגמה, תעלות KCa3.1 אחראיות על ויסות פוטנציאל הממברנה ובקרת נפח התא, דבר חשוב בוויסות מחזור התא. תעלות KCa3.1 פגומות דווחו כתורמות להתרבות חריגה של תאי גידול3. יתר על כן, תעלות יונים עשויות לתרום להפצה גרורתית של סרטן. ערוצי פוטנציאל קולטן חולף (TRP), למשל, מעורבים בזרם Ca 2+ ו- Mg2+; זרם זה מפעיל מספר קינאזות וחלבוני הלם חום שתפקידם לווסת את המטריצה החוץ תאית המקיפה גידול, שהיא, בתורה, חשובה להתחלת גרורות סרטניות4.
מאחר שתעלות יונים יכולות לתרום להתפתחות סרטן, הן עשויות גם להיות מטרות לטיפול תרופתי בסרטן. לדוגמה, עמידות לשיטות טיפול, כולל כימותרפיה ואימונותרפיה חדשנית, קשורה לתפקוד לקוי של תעלות יונים 5,6,7. בנוסף, תעלות יונים מתגלות כמטרות תרופתיות חשובות המעכבות צמיחה והתפתחות של סרטן, כאשר נבדקות תרופות למולקולות קטנות (מאושרות על ידי ה-FDA), כמו גם ביופולימרים, כולל נוגדנים חד-שבטיים 1,2,8,9. בעוד שחלה התקדמות רבה בחזית זו, גילוי תרופות לסרטן תעלות יונים נותר לא מפותח. זאת, בין היתר, בשל האתגרים הייחודיים של חקר תעלות יונים בתאים סרטניים. לדוגמה, ישנן מגבלות טכניות בהגדרת בדיקות אלקטרופיזיולוגיות עבור תרכובות בעלות פעולה איטית והבדלים זמניים בהפעלת ערוצים ובפעולת תרופות. יתר על כן, מסיסות התרכובות יכולה גם לעכב התקדמות, מכיוון שרוב מערכות האלקטרופיזיולוגיה האוטומטיות הנמצאות בשימוש כיום משתמשות במצעים הידרופוביים, אשר עשויים לתרום לממצאים כתוצאה מספיגת תרכובות. בנוסף, טיפולים מולקולריים ביו-אורגניים גדולים כגון מוצרים טבעיים, פפטידים ונוגדנים חד-שבטיים מאתגרים מבחינה טכנית לסינון באמצעות בדיקות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונליות10. לבסוף, התכונות הביו-חשמליות של תאים סרטניים עדיין אינן מובנות כראוי11.
בינתיים, צביעת האימונופלואורסנציה של תעלות יונים היא לעתים קרובות מאתגרת. זה נובע, בין השאר, מהמורכבות של המבנים שלהם וההקשר שלהם בקרום, המשפיעים על היכולת לייצר ולהשתמש בנוגדנים למחקרי מיקרוסקופיה. חשוב במיוחד שהנוגדנים המשמשים להכתמת תעלות יונים יאומתו עבור ספציפיות, אהדה ויכולת שחזור. יש לשקול נוגדנים מסחריים לתעלות יונים על סמך אסטרטגיית האימות שלהם והיסטוריית הפרסום שלהם. ניסויים צריכים לכלול בקרות שליליות כדי להדגים את היעדר קשירה לא ספציפית על ידי הפלה או נוקאאוט של חלבון המטרה. לחלופין, קווי תאים שבהם חלבון המטרה נעדר או בשפע נמוך בהתבסס על mRNA או קביעת חלבונים עשויים לשמש כבקרות שליליות. לדוגמה, מחקר זה מראה לוקליזציה של תת-יחידת קולטן (GABA) Gabra5 בקו תאי מדולובלסטומה (D283). תאי D283 עם הפלה של siRNA ותאי Daoy, קו תאי מדולובלסטומה צרבלרי נוסף, הוכתמו עבור Gabra5 ולא הראו צביעה ניכרת (הנתונים לא מוצגים).
כאן, שיטות מוצגות לנתח ולהעריך תפקוד ערוץ יונים, כמו גם את ההשפעה של אפנן ערוץ יונים על תאים סרטניים. פרוטוקולים מסופקים עבור (1) צביעת תאים עבור תעלת יונים, (2) בדיקת המצב המקוטב של מיטוכונדריה, (3) ביסוס תפקוד תעלת יונים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, ו (4) אימות תרופות במבחנה. פרוטוקולים אלה מדגישים מחקרים של קולטן חומצה גמא-אמינובוטירית מסוג A (GABAA) 2,12,13,14,15,16, תעלת אניון כלוריד וקולטן נוירוטרנסמיטר מעכב עיקרי. עם זאת, השיטות המוצגות כאן חלות על חקר תאים סרטניים רבים אחרים ותעלות יונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים בתפקוד תעלות היונים משנים את מפל האיתות התוך-תאי, מה שיכול להשפיע על התפקוד הכללי של התא. במהלך העשור האחרון, התברר יותר ויותר כי תעלות יונים חשובות לצמיחת תאים סרטניים וגרורות. חשוב לציין, תעלות יונים רבות הן מטרות עיקריות לטיפולים מאושרים המכוונים למגוון רחב של הפרעות24<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על תמיכתה של קרן משפחת תומאס א. ופמלה מ. מישל ל- S.S. וקרן הרולד ס. שוט למימון הקתדרה ע”ש הרולד ס. שוט, המכללה לרפואה של אוניברסיטת קליפורניה, ל- S.S.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
References
- Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
- Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
- Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
- Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
- Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
- Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
- Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
- Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
- Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
- Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
- Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
- Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
- Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
- Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
- Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
- Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
- Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
- Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
- Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
- Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
- Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
- Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
- Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
- Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
- Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
- Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
- Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).
