Rastreamento de Canais Iônicos em Células Cancerosas
Summary
O direcionamento farmacológico dos canais iônicos é uma abordagem promissora para o tratamento de tumores sólidos. Protocolos detalhados são fornecidos para caracterizar a função de canais iônicos em células cancerosas e avaliar os efeitos de moduladores de canais iônicos na viabilidade do câncer.
Abstract
Os canais iônicos são críticos para o desenvolvimento celular e manutenção da homeostase celular. A perturbação da função dos canais iônicos contribui para o desenvolvimento de uma ampla gama de distúrbios ou canalopatias. As células cancerosas utilizam canais iônicos para impulsionar seu próprio desenvolvimento, bem como para melhorar como um tumor e assimilar em um microambiente que inclui várias células não cancerosas. Além disso, aumentos nos níveis de fatores de crescimento e hormônios dentro do microambiente tumoral podem resultar em maior expressão de canais iônicos, o que contribui para a proliferação e sobrevivência das células cancerígenas. Assim, o direcionamento farmacológico de canais iônicos é potencialmente uma abordagem promissora para o tratamento de neoplasias sólidas, incluindo cânceres cerebrais primários e metastáticos. Neste trabalho, são descritos protocolos para caracterizar a função de canais iônicos em células cancerosas e abordagens para analisar moduladores de canais iônicos para determinar seu impacto na viabilidade do câncer. Estes incluem a coloração de uma célula (s) para um canal iônico (s), testar o estado polarizado da mitocôndria, estabelecer a função do canal iônico usando eletrofisiologia e realizar ensaios de viabilidade para avaliar a potência da droga.
Introduction
As proteínas transportadoras de membrana são fundamentais para a comunicação entre as células, bem como para a manutenção da homeostase celular. Entre as proteínas de transporte de membrana, os canais iônicos servem para impulsionar o crescimento e desenvolvimento das células e para manter o estado das células em ambientes desafiadores e em mudança. Também tem sido relatado que canais iônicos conduzem e apoiam o desenvolvimento de tumores sólidos, tanto sistemicamente quanto no sistema nervoso central (SNC)1,2. Por exemplo, os canais de KCa3.1 são responsáveis por regular o potencial de membrana e controlar o volume celular, o que é importante na regulação do ciclo celular. Canais defeituosos de KCa3.1 têm sido relatados como contribuintes para a proliferação anormal de célulastumorais3. Além disso, os canais iônicos podem contribuir para a disseminação metastática de cânceres. Canais de potencial receptor transitório (TRP), por exemplo, estão envolvidos no influxo de Ca 2+ e Mg2+; Esse influxo ativa várias quinases e proteínas de choque térmico que têm a função de regular a matriz extracelular ao redor de um tumor, o que é, por sua vez, importante para iniciar a metástase docâncer4.
Uma vez que os canais iónicos podem contribuir para o desenvolvimento de cancros, podem também ser alvos para o tratamento do cancro relacionado com medicamentos. Por exemplo, a resistência às modalidades de tratamento, incluindo quimioterapia e nova imunoterapia, está relacionada à desregulação da função dos canais iônicos 5,6,7. Além disso, canais iônicos estão emergindo como importantes alvos de fármacos para impedir o crescimento e desenvolvimento de cânceres, sendo examinados fármacos reaproveitados de pequenas moléculas (aprovados pela FDA), bem como biopolímeros, incluindo anticorposmonoclonais 1,2,8,9. Embora tenha havido muito progresso nessa frente, a descoberta de medicamentos para o câncer de canal iônico permanece subdesenvolvida. Isto é em parte devido aos desafios únicos de estudar os canais iônicos em células cancerosas. Por exemplo, existem limitações técnicas na montagem de ensaios eletrofisiológicos para compostos de ação lenta e diferenças temporais na ativação de canais e ação de drogas. Além disso, a solubilidade dos compostos também pode impedir o progresso, já que a maioria dos sistemas de eletrofisiologia automatizados comumente usados atualmente utilizam substratos hidrofóbicos, que podem contribuir para artefatos como resultado da adsorção de compostos. Além disso, grandes terapêuticas moleculares bioorgânicas, como produtos naturais, peptídeos e anticorpos monoclonais, são tecnicamente desafiadoras de rastrear usando ensaios eletrofisiológicos convencionais10. Finalmente, as propriedades bioelétricas das células cancerosas permanecem pouco compreendidas11.
Enquanto isso, a coloração por imunofluorescência dos canais iônicos é muitas vezes desafiadora. Isso se deve, em parte, à complexidade de suas estruturas e seu contexto na membrana, que impactam a capacidade de gerar e empregar anticorpos para estudos de microscopia. É especialmente importante que os anticorpos usados para corar os canais iônicos sejam validados quanto à especificidade, afinidade e reprodutibilidade. Anticorpos comerciais para canais iônicos devem ser considerados com base em sua estratégia de validação e registro de publicação. Os experimentos devem incluir controles negativos para demonstrar a falta de ligação inespecífica por knockdown ou knockout da proteína-alvo. Alternativamente, linhagens celulares nas quais a proteína-alvo está ausente ou em baixa abundância com base em determinações de RNAm ou proteínas podem servir como controles negativos. Por exemplo, este estudo mostra a localização da subunidade do receptor (GABA) Gabra5 em uma linhagem celular de meduloblastoma (D283). Células D283 com knockdown de siRNA e células Daoy, outra linhagem celular de meduloblastoma cerebelar, foram coradas para Gabra5 e não apresentaram coloração apreciável (dados não mostrados).
Aqui, são apresentados métodos para analisar e testar a função dos canais iônicos, bem como o efeito dos moduladores dos canais iônicos sobre as células cancerosas. São fornecidos protocolos para (1) coloração de células para um canal iônico, (2) teste do estado polarizado das mitocôndrias, (3) estabelecimento da função do canal iônico usando eletrofisiologia e (4) validação in vitro de fármacos. Esses protocolos enfatizam estudos do receptor tipo A do ácido gama-aminobutírico (GABAA) 2,12,13,14,15,16, um canal de ânion cloreto e do principal receptor inibitório de neurotransmissores. No entanto, os métodos apresentados aqui se aplicam ao estudo de muitas outras células cancerosas e canais iônicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alterações na função do canal iônico alteram as cascatas de sinalização intracelular, o que pode afetar o funcionamento geral de uma célula. Na última década, tornou-se cada vez mais claro que os canais iônicos são importantes para o crescimento de células cancerígenas e metástases. É importante ressaltar que muitos canais iônicos são alvos primários de terapêuticas aprovadas visando uma ampla gama de distúrbios24. Pesquisadores investigaram se os canais iônicos poderiam ser …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio da Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation à S.S. e do financiamento da Harold C. Schott Foundation da Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, à S.S.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
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