Screening van ionkanalen in kankercellen
Summary
De farmacologische targeting van ionkanalen is een veelbelovende benadering voor de behandeling van solide tumoren. Gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor het karakteriseren van ionkanaalfunctie in kankercellen en het testen van de effecten van ionkanaalmodulatoren op de levensvatbaarheid van kanker.
Abstract
Ionkanalen zijn van cruciaal belang voor celontwikkeling en het behoud van celhomeostase. De verstoring van de ionkanaalfunctie draagt bij aan de ontwikkeling van een breed scala aan aandoeningen of channelopathieën. Kankercellen gebruiken ionkanalen om hun eigen ontwikkeling te stimuleren, maar ook om te verbeteren als een tumor en om te assimileren in een micro-omgeving die verschillende niet-kankercellen omvat. Bovendien kunnen verhogingen van de niveaus van groeifactoren en hormonen in de micro-omgeving van de tumor resulteren in een verbeterde ionkanaalexpressie, wat bijdraagt aan de proliferatie en overleving van kankercellen. De farmacologische targeting van ionkanalen is dus potentieel een veelbelovende benadering voor de behandeling van solide maligniteiten, waaronder primaire en gemetastaseerde hersenkankers. Hierin worden protocollen beschreven om de functie van ionkanalen in kankercellen te karakteriseren en benaderingen om modulatoren van ionkanalen te analyseren om hun impact op de levensvatbaarheid van kanker te bepalen. Deze omvatten het kleuren van een cel (en) voor een ionkanaal (en), het testen van de gepolariseerde toestand van mitochondriën, het vaststellen van de ionkanaalfunctie met behulp van elektrofysiologie en het uitvoeren van levensvatbaarheidstests om de potentie van het geneesmiddel te beoordelen.
Introduction
Membraantransporteiwitten zijn van cruciaal belang voor de communicatie tussen cellen, evenals voor het behoud van cellulaire homeostase. Onder de membraantransporteiwitten dienen ionkanalen om de groei en ontwikkeling van cellen te stimuleren en de toestand van cellen in uitdagende en veranderende omgevingen te behouden. Van ionkanalen is ook gemeld dat ze de ontwikkeling van solide tumoren stimuleren en ondersteunen, zowel systemisch als in het centrale zenuwstelsel (CZS)1,2. KCa3.1-kanalen zijn bijvoorbeeld verantwoordelijk voor het reguleren van het membraanpotentiaal en het regelen van het celvolume, wat belangrijk is bij de regulering van de celcyclus. Van defecte KCa3.1-kanalen is gemeld dat ze bijdragen aan de abnormale proliferatie van tumorcellen3. Verder kunnen ionkanalen bijdragen aan de metastatische verspreiding van kankers. Transient receptor potential (TRP) kanalen zijn bijvoorbeeld betrokken bij Ca 2+ en Mg2+ influx; Deze instroom activeert verschillende kinasen en heat shock-eiwitten die functioneren om de extracellulaire matrix rond een tumor te reguleren, wat op zijn beurt belangrijk is voor het initiëren van kankermetastase4.
Aangezien ionkanalen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van kankers, kunnen ze ook doelwitten zijn voor de behandeling van geneesmiddelengerelateerde kanker. Resistentie tegen behandelingsmodaliteiten, waaronder chemotherapie en nieuwe immunotherapie, is bijvoorbeeld gerelateerd aan ontregeling van de ionkanaalfunctie 5,6,7. Bovendien komen ionkanalen naar voren als belangrijke medicijndoelen om de groei en ontwikkeling van kankers te belemmeren, waarbij hergebruikte geneesmiddelen met kleine moleculen (door de FDA goedgekeurd) worden onderzocht, evenals biopolymeren, waaronder monoklonale antilichamen 1,2,8,9. Hoewel er op dit front veel vooruitgang is geboekt, blijft de ontdekking van ionkanaalkankergeneesmiddelen onderontwikkeld. Dit komt deels door de unieke uitdagingen van het bestuderen van ionkanalen in kankercellen. Er zijn bijvoorbeeld technische beperkingen bij het opzetten van elektrofysiologische assays voor langzaam werkende verbindingen en temporele verschillen in kanaalactivering en medicijnwerking. Verder kan de oplosbaarheid van verbindingen ook de vooruitgang belemmeren, omdat de meeste geautomatiseerde elektrofysiologische systemen die tegenwoordig vaak worden gebruikt, hydrofobe substraten gebruiken, die kunnen bijdragen aan artefacten als gevolg van samengestelde adsorptie. Bovendien zijn grote bio-organische moleculaire therapieën zoals natuurlijke producten, peptiden en monoklonale antilichamen technisch uitdagend om te screenen met behulp van conventionele elektrofysiologische assays10. Ten slotte blijven de bio-elektrische eigenschappen van kankercellen slecht begrepen11.
Ondertussen is de immunofluorescentiekleuring van ionkanalen vaak een uitdaging. Dit is deels te wijten aan de complexiteit van hun structuren en hun context in het membraan, die van invloed zijn op het vermogen om zowel antilichamen te genereren als te gebruiken voor microscopiestudies. Het is vooral belangrijk dat de antilichamen die worden gebruikt om ionkanalen te kleuren worden gevalideerd op specificiteit, affiniteit en reproduceerbaarheid. Commerciële antilichamen voor ionkanalen moeten worden overwogen op basis van hun validatiestrategie en publicatierecord. Experimenten moeten negatieve controles omvatten om het gebrek aan niet-specifieke binding aan te tonen door knockdown of knock-out van het doeleiwit. Als alternatief kunnen cellijnen waarin het doeleiwit afwezig of in lage abundantie is op basis van mRNA- of eiwitbepalingen dienen als negatieve controles. Deze studie toont bijvoorbeeld de lokalisatie van de (GABA) receptor subunit Gabra5 in een medulloblastoom cellijn (D283). D283-cellen met een siRNA-knockdown en Daoy-cellen, een andere cerebellaire medulloblastoomcellijn, waren gekleurd voor Gabra5 en vertoonden geen merkbare kleuring (gegevens niet getoond).
Hier worden methoden gepresenteerd om de ionkanaalfunctie te analyseren en te testen, evenals het effect van ionkanaalmodulatoren op kankercellen. Er zijn protocollen voorzien voor (1) het kleuren van cellen voor een ionkanaal, (2) het testen van de gepolariseerde toestand van mitochondriën, (3) het vaststellen van de ionkanaalfunctie met behulp van elektrofysiologie en (4) in vitro medicijnvalidatie. Deze protocollen benadrukken studies van de type A gamma-aminoboterzuur (GABAA) receptor 2,12,13,14,15,16, een chloride anion kanaal en belangrijke remmende neurotransmitter receptor. De hier gepresenteerde methoden zijn echter van toepassing op het bestuderen van vele andere kankercellen en ionkanalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veranderingen in de ionkanaalfunctie veranderen intracellulaire signaalcascades, die de algehele werking van een cel kunnen beïnvloeden. In het afgelopen decennium is het steeds duidelijker geworden dat ionkanalen belangrijk zijn voor de groei en uitzaaiingen van kankercellen. Belangrijk is dat veel ionkanalen primaire doelwitten zijn voor goedgekeurde therapieën die zich richten op een breed scala aan aandoeningen24. Onderzoekers hebben onderzocht of ionkanalen anti-kankerdoelen kunnen zijn, en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van de Thomas E. &; Pamela M. Mischell Family Foundation aan S.S. en de Harold C. Schott Foundation financiering van de Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, aan S.S.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
References
- Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
- Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
- Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
- Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
- Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
- Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
- Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
- Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
- Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
- Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
- Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
- Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
- Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
- Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
- Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
- Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
- Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
- Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
- Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
- Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
- Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
- Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
- Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
- Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
- Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
- Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
- Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).
