Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Screening van ionkanalen in kankercellen

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65427
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Department of Neurology and Rehabilitation Medicine, Division of Neuro-Oncology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Saint Joseph, 3The Vontz Center for Molecular Studies, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

De farmacologische targeting van ionkanalen is een veelbelovende benadering voor de behandeling van solide tumoren. Gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor het karakteriseren van ionkanaalfunctie in kankercellen en het testen van de effecten van ionkanaalmodulatoren op de levensvatbaarheid van kanker.

Abstract

Ionkanalen zijn van cruciaal belang voor celontwikkeling en het behoud van celhomeostase. De verstoring van de ionkanaalfunctie draagt bij aan de ontwikkeling van een breed scala aan aandoeningen of channelopathieën. Kankercellen gebruiken ionkanalen om hun eigen ontwikkeling te stimuleren, maar ook om te verbeteren als een tumor en om te assimileren in een micro-omgeving die verschillende niet-kankercellen omvat. Bovendien kunnen verhogingen van de niveaus van groeifactoren en hormonen in de micro-omgeving van de tumor resulteren in een verbeterde ionkanaalexpressie, wat bijdraagt aan de proliferatie en overleving van kankercellen. De farmacologische targeting van ionkanalen is dus potentieel een veelbelovende benadering voor de behandeling van solide maligniteiten, waaronder primaire en gemetastaseerde hersenkankers. Hierin worden protocollen beschreven om de functie van ionkanalen in kankercellen te karakteriseren en benaderingen om modulatoren van ionkanalen te analyseren om hun impact op de levensvatbaarheid van kanker te bepalen. Deze omvatten het kleuren van een cel (en) voor een ionkanaal (en), het testen van de gepolariseerde toestand van mitochondriën, het vaststellen van de ionkanaalfunctie met behulp van elektrofysiologie en het uitvoeren van levensvatbaarheidstests om de potentie van het geneesmiddel te beoordelen.

Introduction

Membraantransporteiwitten zijn van cruciaal belang voor de communicatie tussen cellen, evenals voor het behoud van cellulaire homeostase. Onder de membraantransporteiwitten dienen ionkanalen om de groei en ontwikkeling van cellen te stimuleren en de toestand van cellen in uitdagende en veranderende omgevingen te behouden. Van ionkanalen is ook gemeld dat ze de ontwikkeling van solide tumoren stimuleren en ondersteunen, zowel systemisch als in het centrale zenuwstelsel (CZS)1,2. KCa3.1-kanalen zijn bijvoorbeeld verantwoordelijk voor het reguleren van het membraanpotentiaal en het regelen van het celvolume, wat belangrijk is bij de regulering van de celcyclus. Van defecte KCa3.1-kanalen is gemeld dat ze bijdragen aan de abnormale proliferatie van tumorcellen3. Verder kunnen ionkanalen bijdragen aan de metastatische verspreiding van kankers. Transient receptor potential (TRP) kanalen zijn bijvoorbeeld betrokken bij Ca 2+ en Mg2+ influx; Deze instroom activeert verschillende kinasen en heat shock-eiwitten die functioneren om de extracellulaire matrix rond een tumor te reguleren, wat op zijn beurt belangrijk is voor het initiëren van kankermetastase4.

Aangezien ionkanalen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van kankers, kunnen ze ook doelwitten zijn voor de behandeling van geneesmiddelengerelateerde kanker. Resistentie tegen behandelingsmodaliteiten, waaronder chemotherapie en nieuwe immunotherapie, is bijvoorbeeld gerelateerd aan ontregeling van de ionkanaalfunctie 5,6,7. Bovendien komen ionkanalen naar voren als belangrijke medicijndoelen om de groei en ontwikkeling van kankers te belemmeren, waarbij hergebruikte geneesmiddelen met kleine moleculen (door de FDA goedgekeurd) worden onderzocht, evenals biopolymeren, waaronder monoklonale antilichamen 1,2,8,9. Hoewel er op dit front veel vooruitgang is geboekt, blijft de ontdekking van ionkanaalkankergeneesmiddelen onderontwikkeld. Dit komt deels door de unieke uitdagingen van het bestuderen van ionkanalen in kankercellen. Er zijn bijvoorbeeld technische beperkingen bij het opzetten van elektrofysiologische assays voor langzaam werkende verbindingen en temporele verschillen in kanaalactivering en medicijnwerking. Verder kan de oplosbaarheid van verbindingen ook de vooruitgang belemmeren, omdat de meeste geautomatiseerde elektrofysiologische systemen die tegenwoordig vaak worden gebruikt, hydrofobe substraten gebruiken, die kunnen bijdragen aan artefacten als gevolg van samengestelde adsorptie. Bovendien zijn grote bio-organische moleculaire therapieën zoals natuurlijke producten, peptiden en monoklonale antilichamen technisch uitdagend om te screenen met behulp van conventionele elektrofysiologische assays10. Ten slotte blijven de bio-elektrische eigenschappen van kankercellen slecht begrepen11.

Ondertussen is de immunofluorescentiekleuring van ionkanalen vaak een uitdaging. Dit is deels te wijten aan de complexiteit van hun structuren en hun context in het membraan, die van invloed zijn op het vermogen om zowel antilichamen te genereren als te gebruiken voor microscopiestudies. Het is vooral belangrijk dat de antilichamen die worden gebruikt om ionkanalen te kleuren worden gevalideerd op specificiteit, affiniteit en reproduceerbaarheid. Commerciële antilichamen voor ionkanalen moeten worden overwogen op basis van hun validatiestrategie en publicatierecord. Experimenten moeten negatieve controles omvatten om het gebrek aan niet-specifieke binding aan te tonen door knockdown of knock-out van het doeleiwit. Als alternatief kunnen cellijnen waarin het doeleiwit afwezig of in lage abundantie is op basis van mRNA- of eiwitbepalingen dienen als negatieve controles. Deze studie toont bijvoorbeeld de lokalisatie van de (GABA) receptor subunit Gabra5 in een medulloblastoom cellijn (D283). D283-cellen met een siRNA-knockdown en Daoy-cellen, een andere cerebellaire medulloblastoomcellijn, waren gekleurd voor Gabra5 en vertoonden geen merkbare kleuring (gegevens niet getoond).

Hier worden methoden gepresenteerd om de ionkanaalfunctie te analyseren en te testen, evenals het effect van ionkanaalmodulatoren op kankercellen. Er zijn protocollen voorzien voor (1) het kleuren van cellen voor een ionkanaal, (2) het testen van de gepolariseerde toestand van mitochondriën, (3) het vaststellen van de ionkanaalfunctie met behulp van elektrofysiologie en (4) in vitro medicijnvalidatie. Deze protocollen benadrukken studies van de type A gamma-aminoboterzuur (GABAA) receptor 2,12,13,14,15,16, een chloride anion kanaal en belangrijke remmende neurotransmitter receptor. De hier gepresenteerde methoden zijn echter van toepassing op het bestuderen van vele andere kankercellen en ionkanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Immunolabeling van ionkanalen in gekweekte cellen

  1. Voorbereiding van de cellen en experimentele opstelling
    1. Onderhoud de cellen als een actief groeiende cultuur in 75 cm2 kweekkolven. Passeer de cellen eenmaal totdat ze 50% -90% confluent worden, afhankelijk van de verdubbelingstijd van de cellijn die wordt gebruikt.
      OPMERKING: Voor de huidige studie werden D283-cellen, een groep 3 medulloblastoomcellijn, gebruikt.
    2. Verzamel de cellen uit de kweekkolf in een centrifugebuis (15 ml of 50 ml) en voeg 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe om aanhangende cellen los te maken. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Tik na 5 minuten drie tot vijf keer op de kolf om de cellen los te maken. Verzamel de cellen in 10 ml medium met 10% FBS om de werking van de trypsine te stoppen.
    3. Centrifugeer op 480 x g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig het medium voorzichtig op. Verstoor de celkorrel niet.
    4. Resuspendie van de cellen in 5 ml tot 10 ml medium, afhankelijk van de dichtheid van de cultuur.
      OPMERKING: De dichtheid moet consistent zijn met actief groeiende cellen en is afhankelijk van de samenvloeiing van cellen in de kolf. Visuele beoordeling moet worden gebruikt om de optimale celdichtheid te benaderen; In het bijzonder moeten de cellen tussen 40% -90% confluent en gelijkmatig verdeeld zijn.
    5. Verwijder 100 μL cellen en voeg toe aan een buis van 1,5 ml met 100 μL 0,4% trypan blauw om niet-levensvatbare cellen te markeren. Incubeer 5-15 min bij RT, afhankelijk van de cellijn.
    6. Tel de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer (zie de tabel met materialen) in 10 μL oplossing. Tel de levende, niet-gekleurde cellen in elk van de vier hoeken van de 16 vierkanten van de hemocytometer. Vermenigvuldig het gemiddelde celnummer met de verdunningsfactor en met 10.000 om de cellen per milliliter (cellen/ml) te geven. Als alternatief kan een geautomatiseerde celteller worden gebruikt.
    7. Verdun cellen tot 1 x 105 cellen/ml in het kweekmedium dat voor elke cellijn is gespecificeerd. Zaad 1. 8 ml cellen in elk putje van een 6-putplaat met een coverslip van 22 mm x 22 mm die is voorgecoat met 0,1 mg/ml poly-D-lysine volgens de instructies van de fabrikant (zie de materiaaltabel).
      OPMERKING: Men kan het gebruik van zowel poly-D-Lysine als poly-L-Lysine willen testen, omdat er meldingen zijn van cellijnspecifieke voorkeuren17,18. Sommige cellijnen hebben proteasen die poly-L-lysine kunnen afbreken, terwijl er meldingen zijn dat poly-D-lysine giftig is voor sommige cellijnen. Daarentegen is gemeld dat neuronale cellen, zoals PC12, gezonder zijn op poly-D-lysine-oppervlakken.
    8. Kweek de cellen in een incubator met een bevochtigde 5% CO2-omgeving bij 37 °C gedurende een nacht om de cellen aan de deklaag te laten hechten. Onderzoek de aanhechting van de cellen onder een omgekeerde microscoop met een 20x objectief.
      OPMERKING: De cellen moeten volledig aan de deklaag worden bevestigd vóór de behandeling of directe immunokleuring. Op dit moment kunnen de cellen worden behandeld met geneesmiddelen (of voertuigcontrole) door de toevoeging van een geconcentreerde voorraad (bijvoorbeeld 600 μL van een 4x stockoplossing) of de vervanging van het medium door vers medium dat het medicijn in de gewenste 1x-concentratie bevat; De cellen kunnen vervolgens tot 48 uur extra worden teruggebracht naar de incubator. Met oplosmiddelen behandelde cellen zijn opgenomen om de effecten van het medicijn op het niveau en de lokalisatie van het doelmolecuul te beoordelen. In deze studie werden D283-cellen behandeld met 600 μL van een 3,2 μM-oplossing van een GABA A-receptorpositieve allosterische modulator, QH-II-06614 (zie de tabel met materialen), gedurende 48 uur. De controlecellen werden behandeld met een equivalent volume DMSO.
  2. Voorbereiding voor immunolabeling: fixatie, permeabilisatie en blokkering
    1. Spoel de cellen met 2,5 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mMKH2PO4, zie de materiaaltabel) en zuig de oplossing onmiddellijk op.
    2. Bevestig de cellen met 1 ml 4% PFA in 1x PBS gedurende 1 uur bij RT.
      OPMERKING: Hoewel 4% PFA het standaard fixatief is voor immunostaining, kan glutaaraldehyde of glyoxal ook worden gebruikt om membraaneiwitten voor immunofluorescentie te fixeren. Op alcohol gebaseerde fixatiemethoden, zoals behandelingen met ijskoude methanol, kunnen leiden tot minder goed bewaarde morfologie en een verlies van membraaneiwitten19,20.
    3. Was zes keer met 2,0 ml 1x PBS (5 min per wasbeurt) door te roeren op een shaker. Incubeer gedurende 1 uur bij RT in een blokkerende buffer bestaande uit 1x PBS met 0,8% Triton X-100 en 10% normaal serum dat overeenkomt met de gastheersoort van het primaire antilichaam (als alternatief kan 3% BSA of runderserumfractie V albumine worden gebruikt in plaats van normaal serum).
      OPMERKING: Deze stap wordt gebruikt om niet-specifieke binding te blokkeren.
  3. Immunolabeling
    OPMERKING: Na het toevoegen van de antilichamen geconjugeerd aan fluoroforen, moeten er snel metingen worden uitgevoerd om fotobleking te voorkomen. Incubaties met geconjugeerde antilichamen moeten worden beschermd tegen licht. Het gebruik van een montagemedium dat middelen bevat die vrije radicalen opruimen, zal fotobleking verminderen. Bewaar de platen in een lichtdichte, ondoorzichtige container (bij 4 °C) na het afdichten van de afdekplaten. Bij beeldvorming kan fotobleaching worden geminimaliseerd door de intensiteit van de excitatieverlichting en de belichtingstijden te beperken.
    1. Bereid een bevochtigde kamer door de bodem van een kweekschaal van 150 mm te bekleden met filtreerpapier. Bevochtig het filtreerpapier met steriel gedestilleerd water. Teken een raster van 3 x 2 op een stuk laboratoriumfolie dat op het filterpapier is gesneden en label het om de oriëntatie van de afdekstroken in de 6-putsplaat te behouden. Plaats de laboratoriumfilm op het filtreerpapier en stel de boven- en onderrand bloot om de kamer te bevochtigen.
    2. Bereid 100 μL per coverslip van de gewenste verdunning van primair antilichaam in 1x PBS met 3% BSA. Om het GABRA-geneiwitproduct te detecteren, gebruikt u konijn recombinant monoklonaal primair antilichaam met een verdunning van 1:200 (Gabra5-antilichaam, middengebied; zie de tabel met materialen).
      OPMERKING: Om empirisch de primaire antilichaamconcentratie te bepalen die het optimale signaal over de achtergrond produceert, gebruikt u een verdunningsreeks van het primaire antilichaam terwijl u de secundaire concentratie constant houdt. Verdunningen van 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 en 1:1.000 worden aanbevolen om optimale primaire antilichaamconcentraties vast te stellen.
    3. Breng de dekplaat van de blokoplossing in de 6-putplaat over naar de juiste locatie op het rooster dat op de laboratoriumfilm is getekend. Gooi de blokoplossing van de 6-putplaat weg en bewaar de plaat voor de wasstappen.
    4. Voeg voorzichtig 100 μL verdund primair antilichaam toe aan het midden van elke coverslip. Plaats de oplossing niet over de rand van de afdekplaat. Incubeer gedurende 1 uur bij RT.
    5. Voeg 2,5 ml 1x PBS toe aan elke put van de 6-putplaat. Breng de coverslip terug naar de juiste plaats in de 6-well plaat.
    6. Voer zes wasbeurten uit gedurende 5 minuten elk met 2,5 ml 1x PBS.
      OPMERKING: Laat de afdekstroken niet drogen tijdens de spoelstappen, omdat dit kan bijdragen aan een achtergrondfluorescentiesignaal.
    7. Breng de coverslips terug naar de juiste plaats op de laboratoriumfolie. Voeg voor elke coverslip 100 μL secundair antilichaam verdund in 1x PBS + 1%-5% BSA toe.
      OPMERKING: In eerste instantie worden secundaire antilichamen geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 (zie de tabel met materialen) gebruikt bij een verdunning van 1:1.000 in 1x PBS + 3% BSA. De secundaire antilichaamconcentratie kan worden geoptimaliseerd door de concentratie te verhogen om doeleiwitten met een lage abundantie te detecteren of de concentratie te verlagen om de achtergrond te verminderen, indien nodig.
    8. Minimaliseer voor de resterende stappen de blootstelling aan licht om het fotobleken van het geconjugeerde secundaire antilichaam te voorkomen. Bedek de kweekschaal met aluminiumfolie en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
    9. Breng de coverslips terug naar de 6-well plaat. Gebruik een shaker en voer zes wasbeurten uit gedurende 5 minuten elk met 2,5 ml 1x PBS. Verwijder de PBS door de plaat om te keren boven de gootsteen of een afvalcontainer. Laat de PBS na de laatste wasbeurt in de put zitten om het verwijderen van de dekplaat te vergemakkelijken.
    10. Label een microscoopglaasje voor elke coverslip. Voeg een druppel glycerolhoudend montagemedium met DAPI (om de kernen te kleuren) (zie de tabel met materialen) toe aan het midden van de dia.
    11. Verwijder met een tang de afdekplaat uit de put en plaats deze voorzichtig op de druppel van het montagemedium in het midden van de dia.
      OPMERKING: Vermijd de vorming van luchtbellen in het montagemedium.
    12. Gebruik kleine stukjes filterpapier om overtollig montagemedium te verwijderen. Sluit de randen van de coverslip af met nagellak en laat de nagellak volledig drogen voordat je het beeld maakt. Bewaar de glasglaasjes bij 4 °C in een ondoorzichtige plastic doos.
  4. Beeldvorming en analyse
    1. Verkrijg beelden met een fluorescentiemicroscoop onder een 40x objectief met dompelolie (zie de tabel met materialen).
    2. Visualiseer de fluorescentiebeelden met de juiste filters.
    3. OPMERKING: Gebruik voor Alexa Fluor 488 een excitatie / emissie van 496 nm / 519 nm; gebruik voor DAPI een excitatie/emissie van 358 nm/461 nm.
    4. Leg de digitale afbeeldingsbestanden vast en sla ze op. Een binningwaarde van 4 x 4 wordt gebruikt om de beeldverzamelingssnelheden te vergemakkelijken en de achtergrond te verkleinen.
    5. Bereid de definitieve beelden voor. De beelden kunnen worden verwerkt met ImageJ of in de handel verkrijgbare software. De resultaten zijn weergegeven in figuur 1.

2. Het testen van de gepolariseerde toestand van mitochondriën

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van de TMRE (tetramethylrhodamine, ethylester) test om het membraanpotentiaal in actieve mitochondriën te labelen, met behoud van een negatieve lading21,22. TMRE is een celdoorlatende, roodoranje, positief geladen kleurstof die zich ophoopt in actieve mitochondriën vanwege hun relatieve negatieve lading. Inactieve of gedepolariseerde mitochondriën hebben een verminderd membraanpotentiaal en slagen er niet in om TMRE proportioneel vast te leggen. FCCP (carbonylcyanide 4-[trifluoromethoxy] fenylhydrazon), een ionofoorontkoppelaar van oxidatieve fosforylering (OXPHOS), depolariseert mitochondriale membranen, waardoor de accumulatie en sekwestratie van TMRE23 wordt voorkomen. Dit wordt geïllustreerd in figuur 2.

  1. Voorbereiding van de cellen en experimentele opstelling
    1. Bewaar de cellen in75 cm 2 kweekkolven. Zuig het kweekmedium aan en spoel de cellen af met 1x PBS zonder calcium en magnesium.
    2. Voeg 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe om de aanhangende cellen los te maken. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en resuspensie de cellen in 10 ml medium.
    3. Verzamel de cellen uit de kweekkolf in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer op 480 x g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig het medium op.
    4. Resuspendeer de cellen in 5 ml tot 10 ml medium, afhankelijk van de oorspronkelijke samenvloeiing van de cultuur, zodat de celconcentratie 50-100 cellen per vierkant op de hemocytometer is. Pas het volume indien nodig aan om de benodigde celdichtheid te bieden voor een nauwkeurige telling.
    5. Verwijder 100 μL cellen en voeg toe aan een buis van 1,5 ml met 100 μL 0,4% trypanblauw. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Verdun de cellen tot 3 x 104 cellen/ml in kweekmedium zonder fenolrood.
      OPMERKING: DMEM-medium zonder fenolrood wordt gebruikt omdat blootstelling aan fenolrood de membraanpermeabiliteit remt en kan bijdragen aan autofluorescentie op de achtergrond.
    6. Zaai 2,5 ml van de celsuspensie (75.000 cellen) per put in een 6-putplaat met een 22 x 22 mm coverslip voorgecoat met poly-D-lysine volgens de instructies van de fabrikant (zie de tabel met materialen).
    7. Laat de cellen in een incubator groeien met bevochtigde 5% CO2 bij 37 °C gedurende een nacht om de cellen aan de deklaag te laten hechten.
    8. Onderzoek de aanhechting van cellen onder een omgekeerde microscoop met een 20x objectief. De cellen moeten volledig aan de dekplaat worden bevestigd voordat ze verder gaan.
  2. Voorraadoplossingen voorbereiden
    1. Om een 1 mM stamoplossing (1.000x) TMRE (MW = 514,96 g/mol) te bereiden (zie de materiaaltabel), lost u 1 mg TMRE op in 1,94 ml DMSO. Aliquot en bewaren bij −20 °C beschermd tegen licht. Vermijd herhaalde vries-/dooicycli.
    2. Om een 50 mM (2.500x) stamoplossing van FCCP (MW = 254,17 g/mol) (mitochondriale oxidatieve fosforyleringsontkoppeling) te bereiden, lost u 10 mg FCCP op in 786,9 μL DMSO. Aliquot en bewaren bij −20 °C beschermd tegen licht. Vermijd herhaalde vries-/dooicycli.
    3. OPMERKING: Bereide voorraadoplossingen maken deel uit van de TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (zie de Materiaaltabel).
  3. Vaststelling van de TMRE-concentratie voor de cellijnen
    1. Bereid een 500 nM werkende TMRE-oplossing in celkweekmedium. Bescherm de werkoplossing tegen licht.
    2. Voeg TMRE toe aan cellen die op de coverslips zijn gekweekt in een gemiddeld tot een eindconcentratiebereik tussen 50-200 nM. Doe dit door eerst het kweekmedium aan te zuigen en te vervangen door kweekmedium dat TMRE bevat.
    3. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Zorg ervoor dat u de behandelingstijden spreidt om beeldvorming mogelijk te maken, omdat de cellen live worden bekeken.
    4. Was de cellen twee keer met 1x PBS en keer de coverslip om op een microscoopglaasje met de uiteindelijke TMRE-concentratie.
    5. Breng onmiddellijk de levende cellen in beeld (piek Ex/Em = 549 nm/575 nm).
      OPMERKING: Beeld onmiddellijk de monsters af zodra ze uit de kweekomstandigheden zijn verwijderd, omdat de mitochondriale gezondheid wordt aangetast zodra de cellen uit het medium worden verwijderd en op een microscoopglaasje worden geplaatst. Als alternatief voor coverslips kunnen de cellen worden afgebeeld in schalen met glazen bodem.
    6. Leg de beelden vast met behulp van de beschikbare microscoop en software.
      OPMERKING: Stel experimentele microscopiebeeldvormingsparameters vast tijdens het TMRE-concentratieoptimalisatieproces en handhaaf dezelfde omstandigheden in volgende experimenten om een nauwkeurige gegevensvergelijking te garanderen. Het gedetailleerde protocol maakte gebruik van een confocale microscoop en compatibele software (zie de tabel met materialen).
    7. Selecteer de optimale TMRE-concentratie, die afhankelijk is van de cellijn.
      OPMERKING: De TMRE-concentratie die het beste signaal geeft om veranderingen in mitochondriale TMRE-niveaus op te lossen, is over het algemeen de laagste TMRE-concentratie, wat een gelijkmatig en gemakkelijk detecteerbaar fluorescentiesignaal geeft.
  4. De gepolariseerde toestand van een cel testen
    1. Testvoorbereiding
      1. Bereid de behandelingsstamoplossingen in de gewenste concentraties en bereid media voor met de uiteindelijke te bepalen concentratie. Voor FCCP moet de voorraadoplossing 20 mM zijn (bereid met DMSO uit een voorraadoplossing van 50 mM).
      2. Werk op een enkele coverslip tegelijk en voeg 1,8 ml medium plus de teststof toe aan de cellen.
      3. Incubeer de cellen met de teststof bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde omgeving gedurende de gewenste periode.
        OPMERKING: De behandelingstijden variëren afhankelijk van het mechanisme waarmee de teststof de mitochondriale membraanpotentiaal kan veranderen. Krachtige protonoforen zoals FCCP die snel en direct mitochondriale membraanpotentialen depolariseren, vereisen kort na de behandeling (binnen enkele minuten) analyse. Daarentegen kunnen behandelingseffecten met verbindingen die indirect van invloed zijn op de functie van de mitochondriale elektronentransportketen, zoals die welke de eiwitactivering of eiwitomzet veranderen of eiwitsynthese vereisen, langer duren om een effect te laten zien.
      4. Schakel tijdens de incubatie de microscoop in en stel deze in op de vooraf bepaalde optimale beeldparameters, inclusief in termen van versterking, laserintensiteit, beeldopnamesnelheid, gemiddelde en belichtingstijd.
      5. Voeg na de medicamenteuze behandelingsperiode 200 μL 10x TMRE (optimale concentratie hierboven bepaald) toe aan de controle- en met geneesmiddelen behandelde cellen.
      6. Incubeer gedurende 15-30 minuten bij 37 °C in 5% CO2 in een bevochtigde omgeving. Zuig het medium voorzichtig op en spoel de cellen eenmaal af met 1x PBS.
      7. Herhaal de 1x PBS-spoelstap om achtergrond veroorzaakt door het celkweekmedium of behandelingsverbindingen te voorkomen en keer de coverslip om op een microscoopglaasje met de behandelingsvoorwaarden.
      8. Stel je voor dat de cellen leven bij Ex/Em = 549 nm/575 nm. Verzamel met behulp van een confocale microscoop verschillende z-stackvelden met snelle beeldopname (512 pixels x 512 pixels, gemiddeld = 4) voorafgaand aan het verlies van celintegriteit.
      9. Sla het afbeeldingsbestand op en sla het op voor analyse. De procedure wordt herhaald voor de volgende experimentele toestand.
    2. Experimentele controles
      1. Gebruik een (negatieve) controle zonder behandeling, uitgevoerd zoals hierboven beschreven (stappen 3.1.1-3.1.8), waarbij de teststof in het medium ontbreekt.
      2. Gebruik een mitochondriale membraanpotentiaalverstoring (positieve) controle bestaande uit de protonofoorverbinding FCCP. Voeg 1,8 ml 20 μM FCCP (zie de materiaaltabel) in medium toe aan de cellen. Zoals hierboven beschreven (stappen 3.1.1-3.1.2; en cell imaging, zoals beschreven in de stappen 3.1.3-3.1.8), incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C in 5% CO2 in een bevochtigde omgeving voorafgaand aan kleuring met TMRE.
        OPMERKING: Zowel positieve als negatieve controles zijn vereist voor deze experimenten.
    3. Kwantificering
      1. Meet de vastgelegde pixelintensiteiten van individuele cellen uit een enkele representatieve afbeelding uit het centrale gebied van elke z-stack. In dit werk werd een enkel focusvlak geselecteerd om de analyse te vergemakkelijken.
      2. Analyseer de pixelintensiteiten van ten minste 30 cellen (in hun geheel) per behandeling. Gebruik Excel of Prism om de pixelintensiteiten voor elke behandeling te gemiddelden en presenteer in staafdiagramformaat met de standaardfout van het gemiddelde.
        OPMERKING: ImageJ kan ook worden gebruikt voor fluorescentiekwantificering. Als alternatief kan TMRE-kleuringsfluorescentie worden gekwantificeerd met commerciële softwareplatforms.

3. Ionkanaalfunctie vaststellen met behulp van elektrofysiologie

OPMERKING: De procedure in deze sectie beschrijft het gebruik van een geautomatiseerde elektrofysiologische test om teststoffen in een kankercellijn te screenen (figuur 3).

  1. De cellen voorbereiden
    1. Oogst cellen uit een gezonde cultuur zonder dode cellen en/of celovergroei. Gebruik de chemische celonthechtingsoplossing TrypLE of een handmatige celschraper om hechtende en geclusterde cellen te oogsten. Dissocieer cellen die groeien in klonten of bollen, die vooral veel voorkomen bij CZS-kankercellen.
      OPMERKING: Zachte dissociatie van de cellen helpt de integriteit van de membraaneiwitten te behouden die essentieel zijn voor ionengeleiding.
    2. Centrifugeer de cellen op 561 x g gedurende 10 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet in DMEM (zonder fenolrood), HEPES en penicilline/streptomycine met 20% FBS en 4 mM L-glutamine (zie de tabel met materialen) op 37 °C.
      OPMERKING: DMEM-medium zonder fenolrood wordt gebruikt omdat blootstelling aan fenolrood de membraanpermeabiliteit remt.
    3. Plaats de cellen op een poly-L-lysine-gecoate coverslip met lage dichtheid, zodat er scheiding is tussen de afzonderlijke cellen.
      OPMERKING: Poly-L-lysine wordt hier gebruikt, en niet poly-D-lysine, omdat poly-L-lysine betere coatingeigenschappen heeft.
    4. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde kamer gedurende 12 uur tot 24 uur (een optimale tijd moet worden vastgesteld) voordat een opname wordt gemaakt.
  2. Elektrofysiologie opname
    1. Verwijder het medium van de coverslips. Was de cellen twee keer voorzichtig met 1x PBS. Voeg ~300 μL TrypLE oplossing toe. Gebruik de pipet om vier tot vijf keer voorzichtig vier tot vijf keer omhoog/omlaag te pipetten totdat de cellen zijn losgemaakt.
    2. Voeg serumvrij medium (DMEM) (fenolroodvrij) toe en handhaaf een eindceltelling per volume van ten minste 1 miljoen cellen / ml. Gebruik een pipet van 1 ml om de cellen op te ruimen om een celsuspensie zonder celclusters te verkrijgen.
    3. Breng de celsuspensie over in een buis van 1 ml. Incubeer de cellen bij 4 °C gedurende 10 minuten om het celmembraan te stabiliseren. Houd de cellen draaiend op een shaker (zachte cyclus) om de vorming van celklonten te voorkomen.
    4. Bereid de Port-a-Patch-installatie voor (zie de materiaaltabel). Schakel de computer, de versterker en het perfusiesysteem in. Open de Patch-Master-software en maak een nieuw bestand.
    5. Breng de buffers (extracellulair en intern) naar RT en laad de buffers vervolgens in de respectievelijke perfusiebuizen.
      OPMERKING: Opnames van de GABAA-receptor vereisen zowel een "extracellulaire (bad)oplossing" met 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES en 6 mM D-glucose (pH aangepast aan 7,4 met NaOH) als een "interne oplossing" met 120 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, en 10 mM HEPES (pH aangepast aan 7,2 met behulp van NaOH).
    6. Vul de onderkant van een elektrodechip (door de fabrikant geleverd) met 5 μL interne oplossing en plaats de elektrodechip op de Faraday-bovenkant van de Port-a-Patch. Voeg 10 μL externe oplossing toe aan de chip en observeer de rechthoekige puls op de oscilloscoop met behulp van de Patch-Master-software (zie de Tabel met materialen).
      OPMERKING: De weerstand kan in het bereik van 2-3 MΩ liggen, maar dit is cellijnafhankelijk.
    7. Begin met opnemen zodra de rechthoekige puls zichtbaar is, na de eerste elektronische aanpassingen en nadat de software de gebruiker vraagt om cellen toe te voegen.
    8. Voeg voorzichtig 20 μL eencellige suspensie toe aan het centrale deel van de elektrode en wacht op een celpleister gevolgd door een Giga-Ohm-afdichting door de weerstandswaarden in de software te observeren.
    9. De live voortgang van celpatching kan worden waargenomen in de linkerkolom van de software. Zodra de cel "in de hele celmodus wordt gehouden", begint u met de opnames door een protocol in de software te openen.
    10. Stel de houdpotentiaal in op −80 mV. Voer een gap-free continu opnameprotocol uit met behulp van de Patch-Master-software om de stroom uit de cel op te nemen.
    11. Verkrijg een stabiele basislijn en schakel over naar een ligand en de respectieve samengestelde toepassing voor een bepaalde duur met behulp van het geautomatiseerde perfusietabblad in het linkerdeelvenster van de software.
    12. Verkrijg gegevens met behulp van de Patch-Master-software.
      OPMERKING: De gegevens worden low-pass gefilterd op 1 kHz en gedigitaliseerd op 100 kHz.
    13. Voer gegevensanalyse uit door de maximale amplitude van de huidige respons te berekenen met behulp van de Nest-o-Patch-software (zie de Materiaaltabel).

4. In vitro potentie

OPMERKING: Deze procedure beschrijft een MTS-test om de potentie van het geneesmiddel te bepalen. De One Solution Cell Proliferation Assay combineert alle vereiste testreagentia tot een bereide oplossing die in één stap kan worden toegevoegd aan celkweekputten om de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen na behandeling met experimentele verbindingen te beoordelen. Het reagens wordt gereconstitueerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant (zie de materiaaltabel), gealiquoteerd en opgeslagen bij −20 °C. In de paragraaf wordt het gebruik van de test beschreven om het IC50 van teststoffen in een bepaalde cellijn te bepalen (figuur 4). Dit MTS-reagens kan ook worden gebruikt voor de high-throughput screening van grote aantallen verbindingen in bekende concentraties.

  1. De cellen voorbereiden
    OPMERKING: Het celnummer is afhankelijk van de groei en het metabolisme van elke individuele cellijn. Bepaal het optimale celnummer experimenteel voordat u de test gebruikt om eventuele onderzoeksbehandelingen te evalueren.
    1. Oogst aanhangende cellen uit de cultuur door trypsinisatie en gebruik Accutase (zie de tabel met materialen) om de cellen die in klonten of bollen groeien te dissociëren.
      OPMERKING: Glioblastoom en primaire medulloblastoom cellijnen vereisen vaak Accutase omdat ze de neiging hebben om in klonten of bollen te groeien.
    2. Tel de cellen en maak een celoplossing met 10.000 cellen per put in een volume van 75 μL. Maak verdunningen van de stam voor de te testen celnummers. Bereid ten minste 1 ml per verdunning.
    3. Plaat 75 μL van elke verdunning in sets van vijf opeenvolgende putten in een plaat met 96 putten. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 's nachts in een bevochtigde omgeving (d.w.z. een incubator).
      OPMERKING: Cellijnen met langzame groei of metabolisme (die hun groeimedium in meer dan 3 dagen verzuren) kunnen meer dan 10.000 cellen nodig hebben als het bovenste celnummerbereik, terwijl cellijnen die snel groeien (over het algemeen sneller dan 20 uur verdubbelingstijd) minder cellen nodig hebben. Cellijnen met een hoog metabolisme kunnen minder dan 1.000 cellen per put nodig hebben. Het celbereik kan worden aangepast om de optimale platingdichtheid voor de MTS-test voor deze cellijnen te bepalen.
  2. Controle van schijnbehandelingen
    1. Voeg 25 μL medium per put toe om de toevoeging van de teststof in de MTS-test te simuleren.
      OPMERKING: In de eigenlijke MTS-test wordt 25 μL van een 4x voorraad van de gekozen behandelingsconcentratie voor de teststof (hier een GABA A-receptormodulator, QH-II-066) aan de cellen toegevoegd om de 1x uiteindelijke behandelingsconcentratie te geven in een totaal volume van 100 μL per put.
    2. Incubeer bij 37 °C en 5 % CO2 in een bevochtigde omgeving gedurende 48 uur. Dit simuleert standaard incubatie in de aanwezigheid van een medicijn.
  3. MTS-test
    1. Ontdooi de vereiste aliquots van het MTS-reagens. Voeg 20 μL MTS-reagens per put toe. Incubeer bij 37 °C en 5 % CO2 in een bevochtigde omgeving gedurende 1 uur.
    2. Centrifugeer de plaat (1.350 x g gedurende 5 minuten) bij kamertemperatuur om bellen te verwijderen, die de absorptiemeting kunnen verstoren.
      OPMERKING: Verwijder eventuele bubbels met een fijne naald.
    3. Lees de absorptie af bij 490 nm. Sla de gegevens op als een Excel-bestand.
    4. Breng de platen terug naar 37 °C in 5% CO2 en lees herhaaldelijk af binnen de lineaire bereikperiode van 4 uur van de test.
      OPMERKING: Het is niet nodig om opnieuw te centrifugeren voordat u de absorptie afleest. Gegevens van latere metingen, met name de 2-uursmeting, kunnen belangrijk zijn om te onderzoeken hoe snel een cellijn het MTS-reagens metaboliseert en zijn nuttig bij het selecteren van het aantal cellen op de plaat voor de test.
    5. Plot de absorptie optische dichtheid (OD) bij 490 nm (OD490) versus het vergulde celnummer met behulp van Excel of Prism.
    6. Selecteer het celnummer voor de test. Het optimale aantal cellen bevindt zich in het lineaire bereik en onder de verzadiging (OD490 = 1).
      OPMERKING: Voor cellen met langzame groei kan het hoogste celnummer worden aangepast tot 20.000 cellen per put en kunnen 500 cellen per put buiten de test worden gelaten.
  4. Het bepalen van het IC50
    1. Dag 1: Plaat de cellen voor de MTS-test
      1. Noteer de cellijnnaam en het doorgangsnummer van elke regel in het onderzoek. Om verdamping tijdens de test tegen te gaan, vult u ten minste de bovenste en onderste rijen van de buitenste omtrek en de linker- en rechteromtrekkolommen van de 96-putplaat met 1x PBS, 100 μL per put, om verdamping tijdens de test tegen te gaan.
      2. Plaats het optimale aantal cellen voor elke cellijn zoals bepaald vóór het begin van de test. Plaats de cellen in 75 μL per putje fenolroodvrij, antibioticavrij medium dat geen HEPES-buffer bevat. De FBS kan worden verhoogd tot 20% om de groei van de cellijnen te ondersteunen.
        OPMERKING: Medium zonder fenolrood wordt gebruikt omdat blootstelling aan fenolrood de membraandoorlaatbaarheid remt.
      3. Plaats het monster in ten minste vijfvoudig voor behandelingsconcentratie. Tel de cellen met behulp van een handmatige of geautomatiseerde hemocytometer.
        OPMERKING: Om een handmatige hemocytometer te gebruiken, (1) bereid een 1:1 verdunning van cellen geresuspendeerd in medium in trypan blauw; (2) incubeer 5-15 min, afhankelijk van de cellijn; (3) laad 10 μL van de cellen in trypan blauw in de telkamer van de hemocytometer; (4) tel de levensvatbare cellen in de vier hoeken en middelste vierkanten en bepaal het gemiddelde aantal cellen per vierkant; (5) bereken de levensvatbare cellen per milliliter als volgt:
        Levensvatbare cellen per ml = Gemiddelde levensvatbare cellen × 2 (verdunningsfactor) × 104
      4. Gebruik een voldoende volume om de gewenste concentratie cellen te bereiden in fenolroodvrij, antibioticavrij medium dat geen HEPES-buffer bevat (d.w.z. 75 μL per put x 60 putjes per plaat = 4,5 ml cellen per plaat).
        OPMERKING: Elke plaat moet een medium-only besturingselement hebben voor de achtergrondaftrekking. De medium controle kan de PBS-putten indien nodig vervangen.
    2. Dag 2: Het toevoegen van het behandelingsmiddel
      1. Bereid de experimentele behandelingen voor bij 4x de gewenste eindconcentratie om de gewenste eindconcentratie te geven wanneer 25 μL behandelingsoplossingen worden toegevoegd aan cellen die zijn verguld met 75 μL medium (= 100 μL totaal volume per put).
      2. Bereid de testoplossingen (in dit geval de GABA A-receptormodulator QH-II-066) door seriële verdunning van de voorraden met de hoogste concentratie. Als de uiteindelijke geneesmiddelconcentraties bijvoorbeeld 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM en 0,3125 μM moeten zijn, bereid dan 1:1 seriële verdunningen voor, beginnend met 20 μM om respectievelijk 10 μM, 5 μM, 2,5 μM en 1,25 μM concentraties te verkrijgen.
        OPMERKING: Elke plaat vereist twee celgebaseerde controles naast de medium-only controle: onbehandelde cellen (alleen medium) en cellen met oplosmiddel behandeld (vaak DMSO) in een bekende concentratie. Het is een goede praktijk om ervoor te zorgen dat het medium de celproliferatie in het actieve bereik van de verbinding niet beïnvloedt.
      3. Zodra de teststof is toegevoegd, incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde omgeving gedurende 48 uur.
    3. Dag 3: Het uitvoeren van de celproliferatietest (MTS)
      1. Bereken het benodigde volume MTS-reagens (20 μL per 100 μL testcultuur) en ontdooi het vereiste volume gealiquoted MTS-reagens (zie de Materiaaltabel).
      2. Vortex, en zorg ervoor dat het reagens volledig in oplossing is voor gebruik. Pipetteer het ontdooide reagens in een steriel reagensreservoir van 25 ml.
      3. Pipetteer 20 μL MTS-reagens (met behulp van een meerkanaalspipet) in elk putje van de 96-putplaat met monsters in 100 μL kweekmedium.
      4. Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde omgeving gedurende 1 uur tot 4 uur. Platen kunnen op meerdere tijdstippen worden gelezen. Over het algemeen worden de platen gelezen op 1 uur en op 2 uur of 3 uur.
      5. Bubbels in het medium kunnen leiden tot foutieve resultaten. Voordat u in de plaatlezer leest, draait u de plaat gedurende 5 minuten op 1.350 x g bij kamertemperatuur. Een naald of een pipetpunt kan worden gebruikt om eventuele bubbels te verwijderen die overblijven na centrifugeren.
      6. Meet de absorptie bij 490 nm met behulp van een geschikte microplaatlezer of spectrofotometer (zie de materiaaltabel).
      7. Sla de gegevens op als een Excel-bestand.
        OPMERKING: De incubatietijd in aanwezigheid van de teststof zal variëren afhankelijk van de snelheid van het metabolisme en de groei van de bestudeerde cellijn, naast de verbinding die wordt getest. Een incubatietijd van 48 uur is een goed uitgangspunt voor de meeste cellijnen en testsamenstellingen.
  5. Data-analyse
    1. Breng de gegevens over in een Excel-bestand en organiseer de gegevens voor elke replicatie door de concentratie van de teststof te verhogen. Het gemiddelde van de besturingselementwaarde voor alleen medium en trek deze waarde af van de experimentele gegevens.
    2. Bepaal het percentage celproliferatie in de behandelingsputten in vergelijking met de voertuigputten (of met oplosmiddelen behandelde controleputten) door de controle in te stellen op 100% proliferatie voor elke replicatie.
    3. Breng de in Excel gegenereerde gegevens over naar een programma naar keuze. De auteurs gebruiken over het algemeen Prism-software (zie de tabel met materialen) om de medicijnconcentratie te bepalen die de celproliferatie met 50% remt (IC50).
    4. Maak in Prism-software een gegevenstabel met X-kolom als celnummers en Y-kolom als de gemiddelde OD voor vijf replicatiewaarden in naast elkaar geplaatste subkolommen.
    5. Voer de waarden van de behandelingsconcentratie in de kolom X in bij het analyseren van een medicamenteuze behandeling. Label de x-as met de naam van de behandelingsstof en de concentratie-eenheden.
    6. Voer de berekende levensvatbaarheidswaarden voor replicatiecellen uit de Excel-analyse in de Y-subkolommen in. Label de y-as als celproliferatie (%).
    7. Selecteer met behulp van de analysetool Niet-lineaire regressie (curve fit) onder XY-analyses.
    8. Selecteer dosis-respons [remming] versus genormaliseerde respons- variabele helling.
    9. Voer de analysefunctie uit. Bekijk de resultatentabel om de berekende best-fit waarden voor IC50 en de curve fit grafiek te zien. De x-as van de grafiek kan desgewenst worden gewijzigd in een logschaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hierboven staan geselecteerde procedures die kunnen worden gebruikt om ionkanalen in kankercellen te karakteriseren. Het eerste protocol benadrukt de kleuring van een ionkanaal. Zoals gedetailleerd, zijn er veel uitdagingen bij het kleuren van een ionkanaal of, wat dat betreft, elk eiwit dat aanwezig is in het extracellulaire membraan. Weergegeven in figuur 1 is de kleuring voor een subeenheid van de pentamere GABAA-receptor. Het tweede protocol benadrukt de resultaten van het testen van de gepolariseerde toestand van mitochondriën in kankercellen. Mitochondriën spelen rollen die essentieel zijn voor de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen, evenals celdood. In zoogdiercellen activeren mitochondriën apoptose als reactie op cellulaire stress door de afgifte van de Bcl-2-familie-eiwitten tussen de mitochondriale binnen- en buitenmembranen. In het cytosol activeren de Bcl-2-familie-eiwitten caspase-proteasen, die geprogrammeerde celdood bemiddelen. Veranderingen in de functie van het plasmamembraanionkanaal kunnen leiden tot een verstoring van de intracellulaire ionhomeostase, ook in termen van de ionenniveaus in de mitochondriën, wat kan leiden tot een verlies van membraanpotentiaal, waardoor apoptose14 wordt veroorzaakt. Niveaus van Ca2 +, K +, Na + en H + zijn belangrijke determinanten bij het signaleren van gebeurtenissen die mitochondriaal geïnitieerde celdood kunnen veroorzaken. Figuur 2 toont kleuring met de celdoorlatende, positief geladen kleurstof TMRE om het membraanpotentiaal in actieve mitochondriën te labelen en in beeld te brengen, die een negatieve lading21,22 behouden. TMRE is een roodoranje kleurstof die bindt met actieve mitochondriën vanwege hun relatieve negatieve lading. Gedepolariseerde of inactieve mitochondriën hebben een verminderd membraanpotentiaal en slagen er dus niet in om TMRE vast te leggen. In dit experiment is de ionofoorontkoppelaar FCCP een belangrijke controle, omdat het mitochondriale membranen depolariseert, waardoor de accumulatie van TMRE23 wordt voorkomen. Het derde protocol benadrukt de elektrofysiologie van de eencellige patchklem. In figuur 3 zijn representatieve opnamen te zien van een spoor dat is opgenomen uit de van de patiënt afgeleide medulloblastoomcellijn D283. Ten slotte belicht het vierde protocol een test om de staat van proliferatie van kankercellen te bepalen. In figuur 4 worden details getoond over hoe de MTS-test werkt en een illustratie van de plaat en uitlezing wanneer geïncubeerd met een middel dat de levensvatbaarheid van de onderzochte kankercellen (in dit geval DAOY) schaadt.

Figure 1
Figuur 1: Kleurcellen voor ionkanalen. (A) Kleuring van het eiwit Gabra5, een subeenheid van de GABAA-receptor, in D283 medulloblastoom kankercellen. (B) Vaste cellen behandeld met de fluorescerende kleuring 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), die aan DNA bindt. (C) Samenvoeging van medulloblastoom kankercellen gekleurd voor zowel Gabra5 als DAPI. Schaalstaven = 10 μm. De figuur is overgenomen uit Kallay et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Testen van de gepolariseerde toestand van mitochondriën . (A) Levende D283 medulloblastoom kankercellen worden behandeld met toenemende concentraties van het geneesmiddel QH-II-066. De cellen worden vervolgens behandeld met positief geladen, celdoorlatend TMRE (tetramethylrhodamine, ethylester), dat zich ophoopt in actieve (negatief geladen) mitochondriën. Gedepolariseerde of inactieve mitochondriën hebben een verminderd membraanpotentiaal en behouden daarom de TMRE-kleurstof niet; Als gevolg hiervan vertonen ze een laag fluorescentiesignaal. Beeld gemaakt door fluorescentiemicroscopie; FCCP (carbonylcyanide 4-[trifluoromethoxy] fenylhydrazon). Piek: λex, 549 nm; λ em, 575 nm. Schaalbalken = 10 μm. (B) Kwantificering van TMRE-kleuring (afbeeldingen weergegeven in paneel A) met behulp van het softwareplatform. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde. De figuur is overgenomen uit Kallay et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Vaststellen van de ionkanaalfunctie met behulp van elektrofysiologie. (A) Afgebeeld is een Port-a-Patch opstelling of rig, bestaande uit een kooi van Faraday (a), opnamekamer (b) en zuigeenheid (c, rechts). (B) Bovenaanzicht van de Port-a-Patch-installatie met de opnamekamer die is uitgerust met een perfusie-inlaat (a), uitlaat (b) en referentie-elektrode (c). (C) De Port-a-Patch is aangesloten op een perfusiesysteem voor snelle oplossingsuitwisseling met geautomatiseerde en handmatige werkingsmodi en oplossingsreservoirs. (D) Representatief stroomspoor van een elektrofysiologie van een patchklem met hele cellen met behulp van een Port-a-Patch rig (Nanion) en D283 medulloblastoom kankercellen. GABA (10 μM) werd toegepast voor 5 s met een holdingpotentiaal van −80 mV. (E) Representatief stroomspoor van een elektrofysiologische registratie van een pleisterklem met hele cellen met behulp van een Port-a-Patch rig (Nanion) en D283 medulloblastoom kankercellen met de gelijktijdige toepassing van GABA (1 μM) en de GABA A-receptoragonist (algemene anesthetica) propofol (50 μM), die de stroom versterkt die alleen door GABA wordt geïnduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: MTS-test om de potentie van het geneesmiddel te beoordelen. (A) Chemische reacties die ten grondslag liggen aan de "MTS-test" die wordt gebruikt om de potentie van een agens te beoordelen, zoals weerspiegeld in een vermindering van de celproliferatie. Reductie van MTS tetrazolium door cellen die levensvatbaar zijn, het genereren van de kleurstof formazan. (B) Een plaat met 96 putten die de colorimetrische resultaten van een MTS-test met toenemende geneesmiddelconcentraties weergeeft. In dit experiment worden de DAOY-medulloblastoomkankercellen behandeld met toenemende concentraties van een preklinisch geneesmiddel, KRM-II-08, een positieve allosterische modulator van de GABAA-receptor. (C) Een dosis-responscurve gegenereerd met de MTS-test (uit de kwantificering van 96-putplaat). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Handmatig Semi/volledig geautomatiseerd
Door-zet Laag Hoog
Snelle uitwisseling van oplossingen Mogelijk Ja
Kosten Hoog Laag
Bediener Ervaren Beginner/Gevorderd
Celtype Alle cellen; Weefsels Primaire enkele cellen; cellijnen
Vereiste celnummers Minimum* Hoog*
Volume geneesmiddel/oplossing Hoog Laag
Bronnen/Hulpprogramma's Hoog Laag
Onderhoud Hoog Laag
Controle van experimenten Heel goed Goed
Live cell imaging Ja Nee
*Port-a-Patch vereist bijvoorbeeld minstens een miljoen cellen/ml voor opnames, terwijl een handmatige set-up meestal een paar honderd cellen op een coverslip nodig heeft.

Tabel 1: Vergelijking van handmatige versus semi- en/of volledig geautomatiseerde elektrofysiologische opstellingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Veranderingen in de ionkanaalfunctie veranderen intracellulaire signaalcascades, die de algehele werking van een cel kunnen beïnvloeden. In het afgelopen decennium is het steeds duidelijker geworden dat ionkanalen belangrijk zijn voor de groei en uitzaaiingen van kankercellen. Belangrijk is dat veel ionkanalen primaire doelwitten zijn voor goedgekeurde therapieën die zich richten op een breed scala aan aandoeningen24. Onderzoekers hebben onderzocht of ionkanalen anti-kankerdoelen kunnen zijn, en de eerste resultaten zijn veelbelovend 2,16,25. Het veld is net begonnen met het onderzoeken van de rol van ionkanalen in de ontwikkeling van kanker en als therapeutische doelen, en de toekomst ziet er op beide fronten rooskleurig uit.

In dit werk worden gedetailleerde procedures gegeven voor het analyseren van ionkanalen in kankercellen en het bepalen of een kanaal een therapeutische kwetsbaarheid is. Deze testen dienen als een gids om te helpen bij het bestuderen van ionkanalen in kankercellen. Er zijn methoden beschreven die zich richten op de visualisatie van ionkanalen in kankercellen, de bepaling van hoe de modulatie van ionkanalen de gepolariseerde toestand van kankercellen verandert, verschillende benaderingen om de ionkanaalfunctie te analyseren met behulp van elektrofysiologie en de meting van de levensvatbaarheid van kankercellen.

Immunofluorescentiekleuring kan worden gebruikt om de aanwezigheid en cellulaire lokalisatie van ionkanalen te detecteren. De experimentele omstandigheden moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd om nauwkeurig weer te geven waar een kanaal zich in de cel bevindt. Intuïtief zou je verwachten dat de kleuring van ionkanalen relatief eenvoudig is, omdat ze hoogstwaarschijnlijk toegankelijk zijn voor oplosmiddelen. Het is echter belangrijk om te onthouden dat het immunofluorescentie-epitoop mogelijk niet gemakkelijk toegankelijk is, afhankelijk van of het deel uitmaakt van een extracellulair of intracellulair domein. Bovendien zijn ionkanalen vaak dicht geclusterd op celmembranen, dus hun detectie door immunostaining kan een uitgebreidere optimalisatie van de fixatie- en permeabilisatieprocedures vereisen in vergelijking met andere klassen van eiwitten14,26.

Het mitochondriale membraanpotentiaal is essentieel voor veel mitochondriën-geassocieerde processen, waaronder ATP-synthese, het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS), calciumsekwestratie, de import van mitochondriale eiwitten, membraandynamica en het veroorzaken van apoptose. Dit protocol maakt gebruik van de TMRE-test om membraanpotentiaal in actieve mitochondriën in afzonderlijke cellen te labelen. Voor schermen met een hoge doorvoer kunnen de TMRE-niveaus worden gemeten met een fluorescentieplaat in microplaatformaat.

Patch-clamp elektrofysiologie is de "gouden standaard" methode voor de studie van ionkanaalkinetiek. Whole-cell en single-channel methoden zijn ook de methoden met de hoogste resolutie voor het nauwkeurig bepalen van de structuur-functierelaties en farmacologie van ionkanaalmodulatoren. Deze methode maakt gebruik van de studie van kleine elektrische veranderingen over een membraan veroorzaakt door de beweging van ionen door ionkanalen27. Elektrofysiologische experimenten worden traditioneel uitgevoerd met behulp van handmatige patch-clamp elektrofysiologische opnames van een enkele cel tegelijk, wat resulteert in een low-throughput benadering die vereist dat de gebruiker een reeks gespecialiseerde vaardigheden bezit. Geautomatiseerde patch-clamp elektrofysiologische technieken, zoals Port-a-Patch, IonFlux Mercury, Patchliner en / of Synchropatch-technologieën, bieden meerdere opnames tegelijk, en deze technieken zijn uitgerust met een geavanceerde perfusie-opstelling voor samengestelde toepassing, wat resulteert in semi-hoge doorvoer of hoge doorvoer zonder speciale vaardigheden te vereisen. Voor sommige experimenten is handmatige patchklemming onvervangbaar (tabel 1). Toch heeft geautomatiseerde patch-clamp-technologie het biofysisch onderzoek naar ionkanalen en gerelateerde programma's voor het ontdekken van geneesmiddelen versneld. Een van de beperkingen van registratie van primaire/niet-getransfecteerde cellen is de bijdrage van lekkende, niet-specifieke endogene stromen. In onze opnames zagen we kleine variaties in de basislijn, wat een mogelijke bijdrage van endogene stromen van D283-cellen suggereert.

Celproliferatietests meten de verstoring van celgroeiactiviteit als reactie op een chemisch agens. Dergelijke assays zijn cruciale hulpmiddelen om de werking van een medicijn op celproliferatie te beoordelen. Om celproliferatie te evalueren, gebruiken onderzoekers meestal MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide), MTS (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-5-[3-carboxymethoxyfenyl]-2-[4-sulfofenyl]-2H-tetrazolium) en / of clonogene assays. MTT- en MTS-testen meten de omzetting (reductie) van een in water oplosbaar tetrazoliumzout (geel) in een kwantificeerbaar formazanproduct (paars in de MTT-test), dat wordt gekatalyseerd door het dehydrogenase-enzymsysteem van metabolisch actieve cellen. De intensiteit van het gekleurde product geeft een schatting van het aantal "levensvatbare" (bijv. metabolisch actieve) cellen. Daarentegen analyseert de clonogene test het vermogen van afzonderlijke cellen in cultuur om een kolonie te vormen (ten minste 50 cellen of zes opeenvolgende delingen) na behandeling met een medicijn28,29. MTT, MTS en clonogene assays hebben elk voor- en nadelen, en men moet de geschiktheid van deze assays zorgvuldig beoordelen om de potentie van een geneesmiddel (en) met een bepaalde cellijn (en) te bepalen. Optimaal wordt het gebruik van meer dan één van deze testen (bijv. Clanogene en MTT- of MTS-testen) aanbevolen om de potentie van een geneesmiddel (en) te bepalen.

De MTT- en MTS-assays beoordelen de metabole activiteit van levende cellen, die kan variëren per celtype en testconditie. De MTT- of MTS-assays zijn voordelig, omdat deze assays gemakkelijk uit te voeren zijn, in replicatie kunnen worden uitgevoerd en vatbaar zijn voor high-throughput screening30. De MTT- of MTS-assays kunnen in 3-4 dagen worden voltooid, terwijl de clonogene assay 10-21 dagen kan duren, afhankelijk van de kenmerken van de gebruikte cellijn28. De nadelen van zowel de MTS- als de MTT-tests zijn daarentegen mogelijke interferentie van de reagentia die nodig zijn voor het uitvoeren van de test met kweekmedium, de moeilijkheid om de test te gebruiken en de potentiële variabiliteit tussen replicaties als gevolg van de celstofwisselingsstatus en kweekomstandigheden31. Met betrekking tot de keuze tussen de MTT- en MTS-assays, moet men overwegen dat de MTT-test een oplosbaarheidsstap vereist om de cellen te lyseren en de formazankristallen in het medium te laten oplossen en absorptie vertoont bij 570 nm, terwijl de MTS-test een "one-step assay" is, waarbij de formazan direct in het medium wordt opgelost zonder de intermitterende stappen (bijv. de cellysisstap). Het formazan-product in de MTS-test is donkerder van kleur en bezit een gevoeliger absorptiewaardebereik (490-500 nm), waardoor het gemakkelijker is om een positieve respons vast te stellen. De MTS-test is sneller dan de MTT-test, omdat 2-3 uur nodig is voor de reactie versus 4 uur voor de reactie plus 1-2 uur oplosbaarheid in de MTT-test. Bovendien blijft de MTS-test formazan-product in suspensie en is de test geschikter voor suspensiecellen dan de MTT-test, omdat er geen mediumverandering vereist is tijdens de MTS-test32. Er is echter een gemodificeerde MTT-test ontwikkeld waarin de oplosbaarheidsstap is verbeterd met behulp van een combinatie van DMSO- en SDS-lysisoplossing. Deze gemodificeerde MTT-test kan worden gebruikt voor zowel adherente als suspensiecellen. Als men ervoor kiest om de MTT-test te gebruiken, moet men voorzichtig zijn bij het selecteren van de celcultuur en de voorwaarden / reagentia die worden gebruikt voor celgroei. De resultaten zullen bijvoorbeeld variëren als de cellen worden gekweekt als een monolaag, gedifferentieerd, als een confluente monolaag of senescent. Bovendien kunnen bepaalde niet-mitochondriale dehydrogenasen, zoals sommige intracellulaire reductasen en flavineoxidasen, het MTT-reagens verminderen, mogelijk vals-positieve metingen uitlokken33. Verder heeft het MTT-reagens een zekere mate van toxiciteit, dus de incubatietijd moet worden beperkt. De snelheid van MTT-reductie kan ook veranderen met de kweekomstandigheden, zoals de pH en het glucosegehalte van het medium en de fysiologische toestand van de cellen32,34. De aanwezigheid van ascorbinezuur vermindert bijvoorbeeld naar verluidt MTT tot formazan en dit effect wordt versterkt in de aanwezigheid van retinol35. Met betrekking tot mogelijke problemen met de clonogene test, is het belangrijk om te weten dat na toevoeging van het geneesmiddel de cellen voortijdig senescent en "clonogenisch inactief" kunnen worden (d.w.z. ze vormen geen kolonies) maar metabolisch actief blijven en activiteit vertonen in de MTT- of MTS-assays. Een ander punt om te onthouden is dat de clonogene test beperkt is tot de studie van aanhangende cellen, en niet alle aanhangende cellen kunnen kolonies vormen wanneer ze bij lage celdichtheden worden geplaatst, omdat cel-celcommunicatie verloren gaat36. Vanwege ontoereikende cel-celcommunicatie en de beperkingen van zelfgeproduceerde groeifactoren, reageert de clonogene test op lagere medicijndoses dan de MTT- en MTS-assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.A.P.K. is mede-oprichter, president en CEO van Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. is mede-oprichter van Amlal Pharmaceuticals Inc. en zit in de Drug Safety Monitoring Board van Bexion Pharmaceuticals, Inc.

Acknowledgments

De auteurs erkennen de steun van de Thomas E. &; Pamela M. Mischell Family Foundation aan S.S. en de Harold C. Schott Foundation financiering van de Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, aan S.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABS SpectraMax Plate Reader Molecular Devices ABS
Accutase Invitrogen 00-4555-56
Alexa Flor 488 Invitrogen A32723 Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 100x
B27 Supplement Gibco 12587-010 Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet LABCONCO 302381101 Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1606-100
CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-211 Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride Fisher Scientific C7902 Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm Fisher Scientific 12-600-004 Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2 Fisher Scientific 430641U Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well Fisher Scientific 353046 Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well Fisher Scientific 353072 Cell culture treated
Centrifuge Eppendorf EP-5804R Refrigerated
Corning CoolCell Fisher Scientific 07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-553-450 Corning brand
D283 Med ATCC HTB-185
DABCO Mounting Media EMS 17989-97
D-Glucose Sigma Life Sciences D9434
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650 Cell culture grade
DMEM/F12, base media Fisher Scientific 11330-032 With phenol red
DMEM/F12, phenol red free Fisher Scientific 21041-025
EGTA Sigma Aldrich E4378
Epidermal Growth Factor STEMCELL 78006.1
FCCP Abcam AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic Millipore GF003
GARBA5 Antibody Aviva ARP30687_P050 Rabbit Polyclonal
Glutamax Gibco 35050-061
Glycerol Mounting Medium EMS 17989-60 With DAPI+DABCO
Hemocytometer Millipore Sigma
Heparin STEMCELL 7980
HEPES HyClone SH3023701 Solution
HEPES Fisher Scientific BP310-500 Solid
ImageJ Open platform With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI EMS 17989-97
KRM-II-08 experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor Novus N276314100U
L-Glutamine Gibco 25030-081
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M9272 Hexahydrate
Microscope, Confocal Leica SP8
Microscope, Light VWR 76382-982 DMiL Inverted
MTS - Promega One Step Promega G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL Eppendorf Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL Eppendorf Z683957
Nest-O-Patch Heka
Neurobasal-A Medium Gibco 10888022 Without vitamin A
Neurobasal-A Medium Gibco 12348-017 Phenol red free
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
NOR-QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm Fisher Scientific 50-998-944 4 inch width
Paraformaldehyde EMS RT-15710
PATHCHMASTER Heka
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Perfusion System Nanion 4000120
PFA EMS RT-15710
Phosphate Bufered Saline Fisher Scientific AAJ75889K2 Reagent grade
Poly-D-Lysine Fisher Scientific A3890401
Poly-L-Lysine Sigma Life Sciences P4707
Port-a-Patch Nanion 21000072
Potassium Chloride Sigma Life Sciences P5405
Primary Antibody Invitrogen MA5-34653 Rabbit Monoclonal
Prism GraphPad
Propofol Fisher Scientific NC0758676 1 mL ampule
QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs VWR 89094-664 Sterile
Slides, 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-544-7 Frosted one side
Sodium Bicarbonate Corning 25-035-Cl
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070
Synth-a-Freeze Medium Gibco R00550 Cryopreservation
TMRE Fisher Scientific 50-196-4741 Reagent
TMRE Kit Abcam AB113852 Kit
Triton X-100 Sigma Aldrich NC0704309
Trypan Blue Gibco 15-250-061 Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Solution, 0.25%
Vortex Mixer VWR 97043-562
Whatman Filter Paper Fisher Scientific 09-927-841

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
  3. Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
  4. Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
  5. Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
  6. Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen'kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
  7. Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
  8. Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
  9. Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
  10. Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
  11. Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
  12. Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
  13. Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
  14. Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
  15. Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
  16. Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
  17. Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
  18. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
  19. Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
  20. Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
  21. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  22. Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
  23. Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
  24. IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology. , Available from: www.guidetopharmacology.org/GRAC/ReceptorFamiliesForward?type=IC (2022).
  25. Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
  26. Konno, K., Watanabe, M. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. Luján, R., Ciruela, F. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  27. Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
  28. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  29. Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
  30. Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
  31. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
  32. Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
  33. Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
  34. Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
  35. Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
  36. Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).

Tags

Cancer Research Membraantransport ionkanalen levensvatbaarheid van cellen kankercellen medulloblastoom GABAA-receptoren
Screening van ionkanalen in kankercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam,… More

Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam, D. K., Bhattacharya, D., Jenkins, A., Sengupta, S., Pomeranz Krummel, D. A. Screening Ion Channels in Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65427, doi:10.3791/65427 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter