Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Screening jonkanaler i cancerceller

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65427
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Department of Neurology and Rehabilitation Medicine, Division of Neuro-Oncology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Saint Joseph, 3The Vontz Center for Molecular Studies, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

Den farmakologiska inriktningen av jonkanaler är ett lovande tillvägagångssätt för behandling av solida tumörer. Detaljerade protokoll tillhandahålls för att karakterisera jonkanalfunktionen i cancerceller och analysera effekterna av jonkanalmodulatorer på cancerlivskraft.

Abstract

Jonkanaler är avgörande för cellutveckling och upprätthållande av cellhomeostas. Störningen av jonkanalfunktionen bidrar till utvecklingen av ett brett spektrum av störningar eller kanalopatier. Cancerceller använder jonkanaler för att driva sin egen utveckling, samt att förbättra sig som tumör och att assimilera i en mikromiljö som inkluderar olika icke-cancerceller. Dessutom kan ökningar av nivåer av tillväxtfaktorer och hormoner inom tumörmikromiljön resultera i förbättrat jonkanaluttryck, vilket bidrar till cancercellsproliferation och överlevnad. Således är farmakologisk inriktning av jonkanaler potentiellt ett lovande tillvägagångssätt för behandling av solida maligniteter, inklusive primär och metastaserad hjärncancer. Här beskrivs protokoll för att karakterisera funktionen av jonkanaler i cancerceller och metoder för att analysera modulatorer av jonkanaler för att bestämma deras inverkan på cancerlivskraft. Dessa inkluderar färgning av en cell (er) för en jonkanal (er), testning av det polariserade tillståndet hos mitokondrier, etablering av jonkanalfunktion med hjälp av elektrofysiologi och utförande av livskraftsanalyser för att bedöma läkemedelsstyrka.

Introduction

Membrantransportproteiner är avgörande för kommunikation mellan celler, liksom för att upprätthålla cellulär homeostas. Bland membrantransportproteinerna tjänar jonkanaler till att driva tillväxt och utveckling av celler och för att upprätthålla cellernas tillstånd i utmanande och föränderliga miljöer. Jonkanaler har också rapporterats driva och stödja utvecklingen av solida tumörer, både systemiskt och i centrala nervsystemet (CNS)1,2. Till exempel är KCa3.1-kanaler ansvariga för att reglera membranpotentialen och kontrollera cellvolymen, vilket är viktigt vid cellcykelreglering. Defekta KCa3.1-kanaler har rapporterats bidra till onormal spridning av tumörceller3. Vidare kan jonkanaler bidra till metastaserad spridning av cancer. Övergående receptorpotential (TRP) kanaler är till exempel involverade i Ca 2+ och Mg2+ tillströmning; Denna tillströmning aktiverar flera kinaser och värmechockproteiner som fungerar för att reglera den extracellulära matrisen som omger en tumör, vilket i sin tur är viktigt för att initiera cancermetastaser4.

Eftersom jonkanaler kan bidra till utvecklingen av cancer kan de också vara måltavlor för läkemedelsrelaterad cancerbehandling. Till exempel är resistens mot behandlingsmodaliteter, inklusive kemoterapi och ny immunterapi, relaterad till jonkanalfunktionsdysregulering 5,6,7. Dessutom framträder jonkanaler som viktiga läkemedelsmål för att hindra tillväxt och utveckling av cancer, med återanvända småmolekylära (FDA-godkända) läkemedel som undersöks, liksom biopolymerer, inklusive monoklonala antikroppar 1,2,8,9. Även om det har skett stora framsteg på denna front, är jonkanalcancerläkemedelsupptäckten fortfarande underutvecklad. Detta beror delvis på de unika utmaningarna med att studera jonkanaler i cancerceller. Till exempel finns det tekniska begränsningar vid upprättandet av elektrofysiologiska analyser för långsamt verkande föreningar och tidsmässiga skillnader i kanalaktivering och läkemedelsverkan. Vidare kan lösligheten hos föreningar också hindra framsteg, eftersom de flesta av de automatiserade elektrofysiologiska system som vanligtvis används idag använder hydrofoba substrat, vilket kan bidra till artefakter som ett resultat av sammansatt adsorption. Dessutom är stora bioorganiska molekylära terapier som naturprodukter, peptider och monoklonala antikroppar tekniskt utmanande att screena med konventionella elektrofysiologiska analyser10. Slutligen förblir cancercellernas bioelektriska egenskaper dåligt förstådda11.

Samtidigt är immunofluorescensfärgning av jonkanaler ofta utmanande. Detta beror delvis på komplexiteten i deras strukturer och deras sammanhang i membranet, vilket påverkar förmågan att både generera och använda antikroppar för mikroskopistudier. Det är särskilt viktigt att antikropparna som används för att färga jonkanaler valideras för specificitet, affinitet och reproducerbarhet. Kommersiella antikroppar för jonkanaler bör övervägas baserat på deras valideringsstrategi och publikationsrekord. Experiment bör innehålla negativa kontroller för att visa bristen på ospecifik bindning genom antingen knockdown eller knockout av målproteinet. Alternativt kan cellinjer i vilka målproteinet saknas eller är i låg förekomst baserat på mRNA- eller proteinbestämningar fungera som negativa kontroller. Till exempel visar denna studie lokaliseringen av (GABA) receptorunderenheten Gabra5 i en medulloblastomcellinje (D283). D283-celler med en siRNA-knockdown och Daoy-celler, en annan cerebellär medulloblastomcellinje, färgades för Gabra5 och visade ingen märkbar färgning (data visas inte).

Här presenteras metoder för att analysera och analysera jonkanalfunktion, samt effekten av jonkanalmodulatorer på cancerceller. Protokoll tillhandahålls för (1) färgning av celler för en jonkanal, (2) testning av mitokondriernas polariserade tillstånd, (3) upprättande av jonkanalfunktion med hjälp av elektrofysiologi och (4) in vitro-läkemedelsvalidering. Dessa protokoll betonar studier av typ A gamma-aminosmörsyra (GABAA) receptor 2,12,13,14,15,16, en kloridanjonkanal och större hämmande neurotransmittorreceptor. De metoder som presenteras här gäller dock för att studera många andra cancerceller och jonkanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Immunolabeling jonkanaler i odlade celler

  1. Förbereda cellerna och experimentell uppställning
    1. Behåll cellerna som en aktivt växande kultur i 75 cm2 odlingskolvar. Passera cellerna en gång tills de blir 50% -90% sammanflytande, beroende på fördubblingstiden för cellinjen som används.
      OBS: För den aktuella studien användes D283-celler, en grupp 3 medulloblastomcellinje.
    2. Samla cellerna från odlingskolven i ett centrifugrör (15 ml eller 50 ml) och tillsätt 2 ml 0,25% trypsin-EDTA för att avlägsna vidhäftande celler. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Efter 5 minuter, knacka på kolven tre till fem gånger för att hjälpa till att lossa cellerna. Samla cellerna i 10 ml medium med 10% FBS för att stoppa trypsinets verkan.
    3. Centrifugera vid 480 x g i 5 min vid rumstemperatur. Aspirera försiktigt mediet. Stör inte cellpelleten.
    4. Resuspendera cellerna i 5 ml till 10 ml medium, beroende på kulturens densitet.
      Anmärkning: Densiteten måste överensstämma med aktivt växande celler och är beroende av sammanflödet av celler i kolven. Visuell bedömning bör användas för att approximera den optimala celldensiteten; Specifikt bör cellerna vara mellan 40% -90% sammanflytande och jämnt fördelade.
    5. Ta bort 100 μL celler och tillsätt till ett 1,5 ml rör innehållande 100 μL 0,4% trypanblått för att markera icke-livskraftiga celler. Inkubera 5-15 min vid rumstemperatur, beroende på cellinjen.
    6. Räkna cellerna manuellt med en hemocytometer (se materialtabellen) i 10 μL lösning. Räkna de levande, ofärgade cellerna i vart och ett av de fyra hörnen av hemocytometerns 16 kvadrater. Multiplicera det genomsnittliga cellantalet med utspädningsfaktorn och med 10 000 för att ge cellerna per milliliter (celler / ml). Alternativt kan en automatiserad cellräknare användas.
    7. Späd cellerna till 1 x 105 celler/ml i det odlingsmedium som anges för varje cellinje. Utsäde 1. 8 ml celler i varje brunn i en 6-brunnsplatta innehållande ett 22 mm x 22 mm täckglas förbelagt med 0,1 mg / ml poly-D-lysin enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckningen).
      OBS: Man kanske vill testa användningen av både poly-D-lysin och poly-L-lysin, eftersom det finns rapporter om cellinjespecifika preferenser17,18. Vissa cellinjer har proteaser som kan bryta ner poly-L-lysin, medan det finns rapporter om att poly-D-lysin är giftigt för vissa cellinjer. Däremot har neuronala celler, såsom PC12, rapporterats vara friskare på poly-D-lysinytor.
    8. Odla cellerna i en inkubator med en fuktad 5% CO2-miljö vid 37 ° C över natten så att cellerna kan fästa vid täckglaset. Undersök fästningen av cellerna under ett inverterat mikroskop med ett 20x mål.
      OBS: Cellerna måste vara helt fästa vid täckglaset före behandling eller direkt immunfärgning. Vid denna tidpunkt kan cellerna behandlas med läkemedel (eller fordonskontroll) genom antingen tillsats av ett koncentrerat lager (till exempel 600 μL av en 4x stamlösning) eller ersättning av mediet med färskt medium innehållande läkemedlet vid önskad 1x koncentration; Cellerna kan sedan återföras till inkubatorn i upp till ytterligare 48 timmar. Lösningsmedelsbehandlade celler ingår för att bedöma läkemedlets effekter på målmolekylens nivå och lokalisering. I den aktuella studien behandlades D283-celler med 600 μL av en 3,2 μM-lösning av en GABAA-receptorpositiv allosterisk modulator, QH-II-06614 (se materialtabellen), under 48 timmar. Kontrollcellerna behandlades med en motsvarande volym DMSO.
  2. Förberedelse för immunmärkning: Fixering, permeabilisering och blockering
    1. Skölj cellerna med 2,5 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mMNa2HPO4, 2 mM KH2PO4, se materialtabellen) och aspirera omedelbart lösningen.
    2. Fixera cellerna med 1 ml 4% PFA i 1x PBS i 1 h vid RT.
      OBS: Medan 4% PFA är standardfixeringsmedlet för immunfärgning, kan glutaraldehyd eller glyoxal också användas för att fixera membranproteiner för immunofluorescens. Alkoholbaserade fixeringsmetoder, såsom behandlingar med iskall metanol, kan leda till mindre välbevarad morfologi och förlust av membranproteiner19,20.
    3. Tvätta sex gånger med 2,0 ml 1x PBS (5 min per tvätt) genom omrörning på en shaker. Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur i en blockerande buffert bestående av 1x PBS med 0,8% Triton X-100 och 10% normalt serum som matchar värdarten för den primära antikroppen (alternativt kan 3% BSA eller bovint serumfraktion V-albumin användas i stället för normalt serum).
      Det här steget används för att blockera icke-specifik bindning.
  3. Immunmärkning
    OBS: Efter tillsats av antikroppar konjugerade till fluoroforer måste mätningar göras snart för att förhindra fotoblekning. Inkubationer med konjugerade antikroppar måste skyddas mot ljus. Användningen av ett monteringsmedium som innehåller medel som rensar fria radikaler kommer att minska fotoblekning. Förvara glasen i en ljustät, ogenomskinlig behållare (vid 4 °C) efter försegling av täckglasen. Vid avbildning kan fotoblekning minimeras genom att begränsa intensiteten hos excitationsbelysningen och exponeringstiderna.
    1. Förbered en fuktad kammare genom att klä botten av en 150 mm odlingsskål med filterpapper. Fukta filterpapperet med sterilt destillerat vatten. Rita ett 3 x 2 rutnät på en bit laboratoriefilm som skärs så att den passar ovanpå filterpapperet och märk det för att bevara täckglasens orientering i 6-brunnsplattan. Placera laboratoriefilmen ovanpå filterpapperet och exponera de övre och nedre kanterna för att befukta kammaren.
    2. Bered 100 μl per täckglas av önskad spädning av primär antikropp i 1x PBS med 3% BSA. För att detektera GABRA-genproteinprodukten , använd kanin rekombinant monoklonal primär antikropp vid en utspädning av 1:200 (Gabra5-antikropp, mellersta regionen; se materialtabellen).
      OBS: För att empiriskt bestämma den primära antikroppskoncentrationen som ger den optimala signalen över bakgrunden, använd en utspädningsserie av den primära antikroppen medan den sekundära koncentrationen hålls konstant. Utspädningar på 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 och 1:1 000 rekommenderas för att fastställa optimala primära antikroppskoncentrationer.
    3. Överför täckglaset från blocklösningen i 6-brunnsplattan till rätt plats på gallret ritat på laboratoriefilmen. Kassera blocklösningen från 6-brunnsplattan och behåll plattan för tvättstegen.
    4. Tillsätt försiktigt 100 μl utspädd primär antikropp i mitten av varje täckglas. Undvik att placera lösningen över täckglasets kant. Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
    5. Tillsätt 2,5 ml 1x PBS till varje brunn på 6-brunnsplattan. Överför täckglaset tillbaka till lämplig plats i 6-brunnsplattan.
    6. Utför sex tvättar i 5 minuter vardera med 2,5 ml 1x PBS.
      OBS: Låt inte täckglasen torka under sköljstegen, eftersom detta kan bidra till en bakgrundsfluorescenssignal.
    7. Sätt tillbaka täckglasen på rätt plats på laboratoriefilmen. För varje täckglas, tillsätt 100 μL sekundär antikropp utspädd i 1x PBS + 1% -5% BSA.
      OBS: Initialt används sekundära antikroppar konjugerade till Alexa Fluor 488 (se materialtabellen) vid en 1: 1,000 utspädning i 1x PBS + 3% BSA. Den sekundära antikroppskoncentrationen kan optimeras genom att öka koncentrationen för att detektera målproteiner med låg förekomst eller minska koncentrationen för att minska bakgrunden, om det behövs.
    8. För de återstående stegen, minimera ljusexponeringen för att förhindra fotoblekning av den konjugerade sekundära antikroppen. Täck odlingsskålen med aluminiumfolie och inkubera i 1 timme vid RT.
    9. Överför täckglasen tillbaka till 6-brunnsplattan. Använd en shaker och utför sex tvättar i 5 minuter vardera med 2,5 ml 1x PBS. Ta bort PBS genom att vända plattan över diskbänken eller en avfallsbehållare. Efter den sista tvätten, lämna PBS i brunnen för att underlätta avlägsnandet av täckglaset.
    10. Märk ett mikroskopglas för varje täckglas. Tillsätt en droppe glycerolinnehållande monteringsmedium med DAPI (för att fläcka kärnorna) (se materialtabellen) i mitten av bilden.
    11. Ta bort täckglaset från brunnen med pincett och placera det försiktigt på droppen av monteringsmediet på mitten av bilden.
      Undvik att luftbubblor bildas i monteringsmediet.
    12. Använd små bitar filterpapper för att ta bort överflödigt monteringsmedium. Försegla kanterna på täckglaset med nagellack och låt lacket torka helt innan du avbildar det. Förvara glasskivorna vid 4 °C i en ogenomskinlig plastlåda.
  4. Bildbehandling och analys
    1. Ta bilder med ett fluorescensmikroskop under ett 40x mål med nedsänkningsolja (se materialtabellen).
    2. Visualisera fluorescensbilderna med lämpliga filter.
    3. OBS: För Alexa Fluor 488, använd en excitation / emission på 496 nm / 519 nm; För DAPI, använd en excitation/emission på 358 nm/461 nm.
    4. Fånga och spara de digitala bildfilerna. Ett binning-värde på 4 x 4 används för att underlätta bildinsamlingshastigheterna och minska bakgrunden.
    5. Förbered de slutliga bilderna. Bilderna kan bearbetas med ImageJ eller kommersiellt tillgänglig programvara. Resultaten illustreras i figur 1.

2. Testa det polariserade tillståndet hos mitokondrier

OBS: Detta protokoll använder TMRE-analysen (tetrametylrodamin, etylester) för att märka membranpotentialen i aktiva mitokondrier och upprätthålla en negativ laddning21,22. TMRE är ett cellgenomsläppligt, rödorange, positivt laddat färgämne som ackumuleras i aktiva mitokondrier på grund av deras relativa negativa laddning. Inaktiva eller depolariserade mitokondrier har minskad membranpotential och misslyckas med att proportionellt sekvestrera TMRE. FCCP (karbonylcyanid 4-[trifluormetoxi] fenylhydrazon), en jonofor som inte är kopplad till oxidativ fosforylering (OXPHOS), depolariserar mitokondriella membran, vilket förhindrar ackumulering och sekvestrering av TMRE23. Detta illustreras i figur 2.

  1. Förbereda cellerna och experimentell uppställning
    1. Håll cellerna i 75 cm2 odlingskolvar. Aspirera odlingsmediet och skölj cellerna med 1x PBS utan kalcium och magnesium.
    2. Tillsätt 2 ml 0,25% trypsin-EDTA för att lossa de vidhäftande cellerna. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur och suspendera cellerna igen i 10 ml medium.
    3. Samla upp cellerna från odlingskolven i ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 480 x g i 5 min vid rumstemperatur. Aspirera mediet.
    4. Resuspendera cellerna i 5 ml till 10 ml medium, beroende på kulturens ursprungliga sammanflöde, så att cellkoncentrationen är 50-100 celler per kvadrat på hemocytometern. Justera volymen, om det behövs, för att ge den celldensitet som behövs för korrekt räkning.
    5. Ta bort 100 μL celler och tillsätt till ett 1,5 ml rör innehållande 100 μL 0,4% trypanblått. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Späd cellerna till 3 x 104 celler/ml i odlingsmedium utan fenolrött.
      OBS: DMEM-medium som saknar fenolrött används eftersom fenolröd exponering hämmar membranpermeabiliteten och kan bidra till bakgrundsautofluorescens.
    6. Frö 2,5 ml av cellsuspensionen (75 000 celler) per brunn i en 6-brunnsplatta innehållande en 22 x 22 mm täckglas, förbelagd med poly-D-lysin enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckningen).
    7. Odla cellerna i en inkubator med fuktad 5% CO2 vid 37 ° C över natten så att cellerna kan fästa på täckglaset.
    8. Undersök bindningen av celler under ett inverterat mikroskop med ett 20x mål. Cellerna måste vara helt fästa vid täckglaset innan du fortsätter vidare.
  2. Förbereda stamlösningar
    1. För att bereda en 1 mM stamlösning (1 000x) TMRE (MW = 514,96 g/mol) (se materialtabellen), lös 1 mg TMRE i 1,94 ml DMSO. Alikvot och förvara vid -20 °C skyddad från ljus. Undvik upprepade frys-/töcykler.
    2. För beredning av en 50 mM (2 500x) stamlösning av FCCP (MW = 254,17 g/mol) (mitokondriell oxidativ fosforyleringsfrånkopplare), lös 10 mg FCCP i 786,9 μl DMSO. Alikvot och förvara vid -20 °C skyddad från ljus. Undvik upprepade frys-/töcykler.
    3. OBS: Beredda stamlösningar ingår i TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (se materialtabellen).
  3. Fastställande av TMRE-koncentrationen för cellinjerna
    1. Bered en 500 nM fungerande TMRE-lösning i cellodlingsmedium. Skydda arbetslösningen från ljus.
    2. Tillsätt TMRE till celler som odlas på täckglasen i medium till ett slutligt koncentrationsintervall mellan 50-200 nM. Gör detta genom att först aspirera odlingsmediet och ersätta det med odlingsmediet som innehåller TMRE.
    3. Inkubera i 20 minuter vid 37 °C. Se till att sprida behandlingstiderna för att möjliggöra avbildning, eftersom cellerna ses live.
    4. Tvätta cellerna två gånger med 1x PBS och vänd täckglaset på ett mikroskopglas märkt med den slutliga TMRE-koncentrationen.
    5. Avbilda omedelbart de levande cellerna (topp Ex / Em = 549 nm / 575 nm).
      OBS: Avbilda omedelbart proverna när de har tagits bort från odlingsförhållandena, eftersom mitokondriell hälsa äventyras när cellerna avlägsnas från mediet och placeras på ett mikroskopglas. Som ett alternativ till täckglas kan cellerna avbildas i glasbottenskålar.
    6. Ta bilderna med hjälp av tillgängligt mikroskop och programvara.
      OBS: Etablera experimentella mikroskopiavbildningsparametrar under TMRE-koncentrationsoptimeringsprocessen och upprätthålla samma förhållanden i efterföljande experiment för att säkerställa korrekt datajämförelse. Protokollet använde detaljerat ett konfokalmikroskop och kompatibel programvara (se materialförteckningen).
    7. Välj den optimala TMRE-koncentrationen, som är cellinjeberoende.
      Anmärkning: Den TMRE-koncentration som ger den bästa signalen för att lösa förändringar i mitokondriella TMRE-nivåer är i allmänhet den lägsta TMRE-koncentrationen, vilket ger en jämn och lätt detekterbar fluorescenssignal.
  4. Testa det polariserade tillståndet hos en cell
    1. Förberedelse av analys
      1. Bered behandlingsstamlösningarna i önskade koncentrationer och bereds media med den slutliga koncentration av föreningar som skall analyseras. För FCCP ska stamlösningen vara 20 mM (beredd med DMSO från en 50 mM stamlösning).
      2. Arbeta på ett enda täckglas i taget, tillsätt 1,8 ml medium plus testföreningen till cellerna.
      3. Inkubera cellerna med testföreningen vid 37 °C och 5 %CO2 i en fuktad miljö under önskad tidsperiod.
        OBS: Behandlingstiderna varierar beroende på mekanismen genom vilken testföreningen kan förändra mitokondriens membranpotential. Potenta protonoforer som FCCP som snabbt och direkt depolariserar mitokondriella membranpotentialer kräver analys strax efter behandlingen (inom några minuter). Däremot kan behandlingseffekter med föreningar som indirekt påverkar den mitokondriella elektrontransportkedjans funktion, såsom de som förändrar proteinaktivering eller proteinomsättning eller kräver proteinsyntes, ta längre tid att visa en effekt.
      4. Under inkubation, slå på mikroskopet och ställ in det på de förutbestämda optimala bildparametrarna, inklusive när det gäller förstärkning, laserintensitet, bildtagningshastighet, medelvärde och exponeringstid.
      5. Efter läkemedelsbehandlingsperioden, tillsätt 200 μL 10x TMRE (optimal koncentration bestämd ovan) till kontrollcellerna och läkemedelsbehandlade celler.
      6. Inkubera i 15-30 min vid 37 °C i 5%CO2 i en fuktad miljö. Aspirera försiktigt mediet och skölj cellerna en gång med 1x PBS.
      7. Upprepa 1x PBS-sköljsteget för att undvika bakgrund orsakad av cellodlingsmediet eller behandlingsföreningarna och invertera täckglaset på ett mikroskopglas märkt med behandlingsförhållandena.
      8. Bild cellerna lever vid Ex / Em = 549 nm / 575 nm. Använd ett konfokalmikroskop och samla in flera z-stackfält med höghastighetsbildtagning (512 pixlar x 512 pixlar, medelvärde = 4) före förlusten av cellintegritet.
      9. Spara och lagra bildfilen för analys. Förfarandet upprepas för nästa experimentella tillstånd.
    2. Experimentella kontroller
      1. Använd en (negativ) kontroll utan behandling som utförts enligt beskrivningen ovan (steg 3.1.1–3.1.8) och som saknar testsubstansen i mediet.
      2. Använd en mitokondriell membranpotentialstörning (positiv) kontroll bestående av protonoforföreningen FCCP. Tillsätt 1,8 ml 20 μM FCCP (se materialförteckningen) i medium till cellerna. Som beskrivits ovan (steg 3.1.1–3.1.2 och cellavbildning, enligt beskrivningen i steg 3.1.3–3.1.8), inkubera i 10 minuter vid 37 °C i 5 % CO2 i en fuktad miljö före färgning med TMRE.
        OBS: Både positiva och negativa kontroller krävs för dessa experiment.
    3. Kvantifiering
      1. Mät de fångade pixelintensiteterna för enskilda celler från en enda representativ bild från den centrala regionen i varje z-stack. I detta arbete valdes ett enda fokusplan för att underlätta analysen.
      2. Analysera pixelintensiteterna från minst 30 celler (i sin helhet) per behandling. Använd Excel eller Prism för att beräkna medelvärdet av pixelintensiteterna för varje behandling och presentera i stapeldiagramformat med medelvärdets standardfel.
        OBS: ImageJ kan också användas för fluorescenskvantifiering. Alternativt kan TMRE-färgningsfluorescens kvantifieras med kommersiella mjukvaruplattformar.

3. Etablering av jonkanalfunktion med hjälp av elektrofysiologi

OBS: Proceduren i detta avsnitt beskriver användningen av en automatiserad elektrofysiologisk analys för att screena testföreningar i en cancercellinje (figur 3).

  1. Förbereda cellerna
    1. Skörda celler från en hälsosam kultur som saknar döda celler och / eller cellöverväxt. Använd antingen den kemiska cellavskiljningslösningen TrypLE eller en manuell cellskrapa för att skörda vidhäftande och klustrade celler. Dissociera celler som växer i klumpar eller sfärer, vilket är särskilt vanligt bland CNS-cancerceller.
      OBS: Mild dissociation av cellerna hjälper till att upprätthålla integriteten hos membranproteinerna som är väsentliga för jonkonduktans.
    2. Centrifugera cellerna vid 561 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och suspendera pelleten i DMEM (utan fenolrött), HEPES och penicillin/streptomycin med 20 % FBS och 4 mM L-glutamin (se materialtabellen) som hålls vid 37 °C.
      OBS: DMEM-medium som saknar fenolrött används eftersom fenolröd exponering hämmar membranpermeabiliteten.
    3. Platta cellerna på ett poly-L-lysinbelagt täckglas med låg densitet, så att det finns separation mellan de enskilda cellerna.
      OBS: Poly-L-lysin används här, och inte poly-D-lysin, eftersom poly-L-lysin har bättre beläggningsegenskaper.
    4. Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 i en fuktad kammare i12 –24 timmar (optimal tid måste fastställas) innan registrering görs.
  2. Elektrofysiologisk registrering
    1. Ta bort mediet från täckglasen. Tvätta försiktigt cellerna två gånger med 1x PBS. Tillsätt ~ 300 μL TrypLE-lösning. Använd pipetten och pipettera försiktigt upp / ner fyra till fem gånger tills cellerna lossnar.
    2. Tillsätt serumfritt medium (DMEM) (fenolrött) och upprätthåll ett slutligt cellantal per volym på minst 1 miljon celler/ml. Använd en 1 ml pipett, rensa cellerna för att erhålla en cellsuspension som saknar cellkluster.
    3. Överför cellsuspensionen till ett 1 ml rör. Inkubera cellerna vid 4 °C i 10 minuter för att stabilisera cellmembranet. Håll cellerna roterande på en shaker (mild cykel) för att undvika bildandet av cellklumpar.
    4. Förbered Port-a-Patch-installationen (se materialtabellen). Slå på datorn, förstärkaren och perfusionssystemet. Öppna Patch-Master-programvaran och skapa en ny fil.
    5. Ta buffertarna (extracellulära och interna) till RT och ladda sedan buffertarna i respektive perfusionsrör.
      OBS: Inspelningar av GABAA-receptorn kräver både en "extracellulär (bad) lösning" innehållande 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES och 6 mM D-glukos (pH justerat till 7,4 med NaOH) och en "intern lösning" innehållande 120 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM EGTA, och 10 mM HEPES (pH justerat till 7,2 med NaOH).
    6. Fyll botten av ett elektrodchip (tillhandahålls av tillverkaren) med 5 μL intern lösning och placera elektrodchipet på Faraday-toppen av Port-a-Patch. Tillsätt 10 μL extern lösning till chipet och observera den rektangulära pulsen på oscilloskopet med hjälp av Patch-Master-programvaran (se materialtabellen).
      OBS: Motståndet kan ligga i intervallet 2-3 MΩ, men detta är cellinjeberoende.
    7. Börja spela in när den rektangulära pulsen är synlig, efter de första elektroniska justeringarna och efter att programvaran uppmanar användaren att lägga till celler.
    8. Tillsätt försiktigt 20 μL encellssuspension på den centrala delen av elektroden och vänta på cellplåstret följt av en Giga-Ohm-tätning genom att observera motståndsvärdena i programvaran.
    9. Den levande utvecklingen av cellpatchning kan observeras i programvarans vänstra kolumn. När cellen har "underhållits i helcellsläge", börja inspelningarna genom att öppna ett protokoll i programvaran.
    10. Ställ in hållpotentialen på -80 mV. Kör ett gapfritt kontinuerligt inspelningsprotokoll med Patch-Master-programvaran för att spela in strömmen från cellen.
    11. Skaffa en stabil baslinje och växla till en ligand och respektive sammansatt applikation under en viss tid genom att använda den automatiska perfusionsfliken på programvarans vänstra panel.
    12. Hämta data med hjälp av Patch-Master-programvaran.
      OBS: Data lågpassfiltreras vid 1 kHz och digitaliseras vid 100 kHz.
    13. Utför dataanalys genom att beräkna den maximala amplituden för det aktuella svaret med hjälp av Nest-o-Patch-programvaran (se materialtabellen).

4. In vitro potens

OBS: Denna procedur beskriver en MTS-analys för att bestämma läkemedelsstyrka. One Solution Cell Proliferation Assay kombinerar alla nödvändiga analysreagens till en beredd lösning som kan tillsättas i ett steg till cellodlingsbrunnar för att bedöma cellviabiliteten och proliferationen efter behandling med experimentella föreningar. Reagenset rekonstitueras enligt tillverkarens rekommendationer (se materialtabellen), alikvoteras och förvaras vid −20 °C. I avsnittet beskrivs användningen av testet för att bestämma IC50 för testföreningarna i en viss cellinje (figur 4). Detta MTS-reagens kan också användas för screening med hög genomströmning av ett stort antal föreningar vid kända koncentrationer.

  1. Förbereda cellerna
    OBS: Cellantalet beror på tillväxten och metabolismen av varje enskild cellinje. Bestäm det optimala cellantalet experimentellt innan du använder analysen för att utvärdera eventuella prövningsbehandlingar.
    1. Skörda vidhäftande celler från kulturen genom trypsinisering och använd Accutase (se materialtabellen) för att dissociera cellerna som växer i klumpar eller sfärer.
      OBS: Glioblastom och primära medulloblastom cellinjer kräver ofta Accutase eftersom de tenderar att växa i klumpar eller sfärer.
    2. Räkna cellerna och gör en celllösning med 10 000 celler per brunn i en volym på 75 μl. Gör utspädningar av stammen för de cellnummer som ska testas. Bered minst 1 ml per spädning.
    3. Platta 75 μl av varje utspädning i uppsättningar om fem på varandra följande brunnar i en platta med 96 brunnar. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 över natten i en fuktad miljö (dvs. en inkubator).
      OBS: Cellinjer med långsam tillväxt eller metabolism (som surgör deras tillväxtmedium på mer än 3 dagar) kan kräva mer än 10 000 celler som det övre cellnummerområdet, medan cellinjer som växer snabbt (i allmänhet snabbare än 20 timmars fördubblingstid) kräver färre celler. Cellinjer med hög metabolism kan kräva färre än 1000 celler per brunn. Cellområdet kan justeras för att bestämma den optimala pläteringsdensiteten för MTS-analysen för dessa cellinjer.
  2. Mock behandlingskontroll
    1. Tillsätt 25 μl medium per brunn för att simulera tillsatsen av testföreningen i MTS-testet.
      OBS: I den faktiska MTS-analysen kommer 25 μL av ett 4x lager av den valda behandlingskoncentrationen för testföreningen (här en GABA A-receptormodulator, QH-II-066) att tillsättas cellerna för att ge 1x slutlig behandlingskoncentration i en total volym av 100 μL per brunn.
    2. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i en fuktad miljö i 48 timmar. Detta simulerar standardinkubation i närvaro av ett läkemedel.
  3. MTS-analys
    1. Tina de alikvoter av MTS-reagenset som krävs. Tillsätt 20 μL MTS-reagens per brunn. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i fuktad miljö i 1 timme.
    2. Centrifugera plattan (1 350 x g i 5 minuter) vid rumstemperatur för att avlägsna bubblor som kan störa absorbansavläsningen.
      OBS: Ta bort eventuella bubblor med en finnål.
    3. Avläs absorbansen vid 490 nm. Spara data som en Excel-fil.
    4. Sätt tillbaka plattorna till 37 °C i 5 %CO2 och läs upprepade gånger inom analysens linjära intervall på 4 timmar.
      OBS: Det finns inget behov av att centrifugera om innan absorbansen avläses. Data från senare avläsningar, särskilt 2-timmarsavläsningen, kan vara viktiga för att undersöka hur snabbt en cellinje metaboliserar MTS-reagenset och är användbara vid val av antal celler till plattan för analysen.
    5. Plotta absorbansens optiska densitet (OD) vid 490 nm (OD490) jämfört med det pläterade cellnumret med Excel eller Prisma.
    6. Välj cellnumret för analysen. Det optimala antalet celler kommer att ligga i det linjära området och under mättnad (OD490 = 1).
      OBS: För celler med långsam tillväxt kan det högsta cellantalet pläteras justeras till 20 000 celler per brunn och 500 celler per brunn kan lämnas utanför analysen.
  4. Fastställande av IC50
    1. Dag 1: Platta cellerna för MTS-analysen
      1. Anteckna cellinjenamn och passagenummer för varje rad i studien. För att motverka avdunstning under analysen fyller du åtminstone de övre och nedre raderna i den yttre omkretsen och de övre vänstra och högra kantkolumnerna på 96-brunnsplattan med 1x PBS, 100 μL per brunn, för att motverka avdunstning under analysen.
      2. Platta det optimala antalet celler för varje cellinje som bestämts innan testet påbörjas. Platta cellerna i 75 μL per brunn av fenolrött, antibiotikafritt medium som inte innehåller HEPES-buffert. FBS kan ökas till 20% för att stödja tillväxten av cellinjerna.
        OBS: Medium som saknar fenolrött används eftersom fenolröd exponering hämmar membranpermeabiliteten.
      3. Platta provet i minst fem exemplar för behandlingskoncentration. Räkna cellerna med hjälp av en manuell eller automatiserad hemocytometer.
        OBS: För att använda en manuell hemocytometer, (1) förbered en 1: 1 utspädning av celler resuspenderade i medium i trypanblått; (2) inkubera 5-15 min, beroende på cellinjen; (3) ladda 10 μL av cellerna i trypanblått i hemocytometerräkningskammaren; (4) räkna de livskraftiga cellerna i de fyra hörnen och mellersta rutorna och bestämma det genomsnittliga antalet celler per kvadrat; (5) Beräkna de viabla cellerna per milliliter enligt följande:
        Viabla celler per ml = Medelvärdet av viabla celler × 2 (utspädningsfaktor) × 104
      4. Använd en tillräcklig volym för att bereda den önskade koncentrationen av celler i fenolrött, antibiotikafritt medium som inte innehåller HEPES-buffert (dvs. 75 μL per brunn x 60 brunnar per platta = 4,5 ml celler per platta).
        OBS: Varje platta måste ha en medelstor kontroll för bakgrundssubtraktionen. Mediumkontrollen kan ersätta PBS-brunnarna vid behov.
    2. Dag 2: Tillsats av behandlingsföreningen
      1. Bered experimentbehandlingarna vid 4x den önskade slutliga koncentrationen för att ge önskad slutkoncentration när 25 μL behandlingslösningar tillsätts till celler pläterade i 75 μL medium (= 100 μL total volym per brunn).
      2. Bered testlösningarna (i detta fall GABA A-receptormodulatorn QH-II-066) genom serieutspädning av bestånden med högst koncentration. Om till exempel de slutliga läkemedelskoncentrationerna ska vara 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM och 0,3125 μM, förbered sedan 1:1 seriella utspädningar som börjar med 20 μM för att erhålla 10 μM, 5 μM, 2,5 μM respektive 1,25 μM koncentrationer.
        OBS: Varje platta kräver två cellbaserade kontroller utöver den enda mediekontrollen: obehandlade celler (medium ensamma) och celler lösningsmedelsbehandlade (ofta DMSO) vid en känd koncentration. Det är god praxis att se till att vehikeln inte påverkar cellproliferationen inom föreningens aktiva område.
      3. När testföreningen har tillsatts inkuberas cellerna vid 37 °C och 5 %CO2 i en fuktad miljö i 48 timmar.
    3. Dag 3: Utföra cellproliferationsanalysen (MTS)
      1. Beräkna den volym MTS-reagens som behövs (20 μL per 100 μL testkultur) och tina den erforderliga volymen alikvoterat MTS-reagens (se materialtabellen).
      2. Vortex, och se till att reagenset är helt i lösning före användning. Pipettera det tinade reagenset till en steril 25 ml reagensbehållare.
      3. Pipettera 20 μL MTS-reagens (med hjälp av en flerkanalig pipett) i varje brunn på 96-brunnsplattan innehållande prover i 100 μL odlingsmedium.
      4. Inkubera plattan vid 37 °C och 5 %CO2 i en fuktad miljö i 1–4 timmar. Plattor kan läsas vid flera tidpunkter. I allmänhet läses plattorna vid 1 h och vid 2 h eller 3 h.
      5. Bubblor i mediet kan leda till felaktiga resultat. Innan du läser i plattläsaren, snurra plattan vid 1 350 x g i 5 min vid rumstemperatur. En nål eller en pipettspets kan användas för att avlägsna eventuella bubblor som finns kvar efter centrifugering.
      6. Mät absorbansen vid 490 nm med lämplig mikroplattläsare eller spektrofotometer (se materialtabellen).
      7. Spara data som en Excel-fil.
        OBS: Inkubationstiden i närvaro av testföreningen varierar beroende på metabolismhastigheten och tillväxten av cellinjen som studeras, förutom den förening som testas. En inkubationstid på 48 timmar är en bra utgångspunkt för de flesta cellinjer och testföreningar.
  5. Analys av data
    1. Överför data i en Excel-fil och ordna data för varje replikat genom att öka koncentrationen av testsubstansen. Medelvärde av det medellånga kontrollvärdet och subtrahera detta värde från experimentella data.
    2. Bestäm procentandelen cellproliferation i behandlingsbrunnarna jämfört med vehikelbrunnarna (eller lösningsmedelsbehandlade kontrollbrunnar) genom att ställa in kontrollen på 100% proliferation för varje replikat.
    3. Överför data som genereras i Excel till ett valfritt program. Författarna använder i allmänhet Prisma-programvara (se materialtabellen) för att bestämma läkemedelskoncentrationen som hämmar cellproliferationen med 50% (IC50).
    4. I Prism-programvara skapar du en datatabell med X-kolumn som cellnummer och Y-kolumn som genomsnittlig OD för fem replikatvärden i sida-vid-sida-underkolumner.
    5. Ange behandlingskoncentrationsvärdena i kolumnen X när du analyserar en läkemedelsbehandling. Märk x-axeln med behandlingsföreningens namn och koncentrationsenheter.
    6. Ange de beräknade replikerade cellviabilitetsvärdena från Excel-analysen i Y-underkolumnerna. Märk y-axeln som cellproliferation (%).
    7. Använd analysverktyget och välj Icke-linjär regression (kurvanpassning) under XY-analyser.
    8. Välj dos-respons [hämning] kontra normaliserat svar - variabel lutning.
    9. Utför analysfunktionen. Visa resultattabellen för att se de beräknade bäst anpassade värdena för IC50 och kurvpassningsdiagrammet. Diagrammets x-axel kan ändras till en loggskala om så önskas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ovan är utvalda procedurer som kan användas för att karakterisera jonkanaler i cancerceller. Det första protokollet belyser färgningen av en jonkanal. Som detaljerat finns det många utmaningar vid färgning av en jonkanal eller, för den delen, något protein som finns i det extracellulära membranet. I figur 1 visas färgningen för en underenhet av den pentamera GABAA-receptorn. Det andra protokollet belyser resultaten av att testa det polariserade tillståndet av mitokondrier i cancerceller. Mitokondrier spelar roller som är väsentliga för cellviabilitet och proliferation, liksom celldöd. I däggdjursceller aktiverar mitokondrier apoptos som svar på cellulär stress genom frisättning av Bcl-2-familjens proteiner som finns mellan mitokondriella inre och yttre membran. I cytosolen aktiverar Bcl-2-familjens proteiner kaspasproteaser, som förmedlar programmerad celldöd. Förändringar i plasmamembranets jonkanalfunktion kan resultera i en störning av intracellulär jonhomeostas, inklusive när det gäller jonnivåerna inom mitokondrierna, vilket kan leda till förlust av membranpotential, vilket utlöser apoptos14. Nivåer av Ca2+, K +, Na + och H + är viktiga determinanter i signalhändelser som kan utlösa mitokondriell initierad celldöd. Visas i figur 2 är färgning med det cellgenomsläppliga, positivt laddade färgämnet TMRE för att märka och avbilda membranpotentialen i aktiva mitokondrier, som upprätthåller en negativ laddning21,22. TMRE är ett rödorange färgämne som binder med aktiva mitokondrier på grund av deras relativa negativa laddning. Depolariserade eller inaktiva mitokondrier har minskad membranpotential och misslyckas därmed med att binda TMRE. I detta experiment är jonoforen FCCP en viktig kontroll, eftersom den depolariserar mitokondriella membran och därigenom förhindrar ackumulering av TMRE23. Det tredje protokollet belyser encells patch-clamp-elektrofysiologi. I figur 3 visas representativa registreringar av ett spår som registrerats från den patienthärledda medulloblastomcellinjen D283. Slutligen belyser det fjärde protokollet en analys för att bestämma tillståndet för spridning av cancerceller. I figur 4 visas detaljer om hur MTS-analysen fungerar och en illustration av plattan och avläsningen när den inkuberas med ett medel som försämrar livskraften hos de cancerceller som studeras (i detta fall DAOY).

Figure 1
Figur 1: Färgning av celler för jonkanaler. (A) Färgning av proteinet Gabra5, en underenhet av GABA A-receptorn, i D283 medulloblastomcancerceller. (B) Fasta celler behandlade med den fluorescerande fläcken 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), som binder till DNA. (C) Sammanslagning av cancerceller med medulloblastom färgade för både Gabra5 och DAPI. Skalstänger = 10 μm. Figuren är anpassad från Kallay et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Testa det polariserade tillståndet hos mitokondrier . (A) Levande D283 medulloblastomcancerceller behandlas med ökande koncentrationer av läkemedlet QH-II-066. Cellerna behandlas sedan med positivt laddad, cellgenomsläpplig TMRE (tetrametylrodamin, etylester), som ackumuleras i aktiva (negativt laddade) mitokondrier. Depolariserade eller inaktiva mitokondrier har minskad membranpotential och kan därför inte behålla TMRE-färgämnet; Som ett resultat visar de en låg fluorescenssignal. Avbildad med fluorescensmikroskopi; FCCP (karbonylcyanid 4-[trifluormetoxi] fenylhydrazon). Topp: λex, 549 nm; λEM, 575 nm. Skalstreck = 10 μm. (B) Kvantifiering av TMRE-färgning (bilder som visas i panel A) med hjälp av programvaruplattformen. Data presenteras som medelvärdet och standardfelet för medelvärdet. Figuren är anpassad från Kallay et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Upprättande av jonkanalfunktion med hjälp av elektrofysiologi. (A) Visas är en Port-a-Patch-installation eller rigg, bestående av en Faraday-bur (a), inspelningskammare (b) och sugenhet (c, höger). (B) Ovanifrån av Port-a-Patch-riggen som markerar registreringskammaren utrustad med ett perfusionsinlopp (a), utlopp (b) och referenselektrod (c). (C) Port-a-Patch är ansluten till ett perfusionssystem för snabbt lösningsutbyte med automatiserade och manuella driftsätt och lösningsreservoarer. (D) Representativa strömspår från en helcellspatchklämma elektrofysiologisk registrering med hjälp av en Port-a-Patch-rigg (Nanion) och D283 medulloblastomcancerceller. GABA (10 μM) applicerades för 5 s med en hållpotential på −80 mV. (E) Representativa strömspår från en helcellspatch-clamp-elektrofysiologisk registrering med användning av en Port-a-Patch-rigg (Nanion) och D283 medulloblastomcancerceller med samtidig applicering av GABA (1 μM) och GABA A-receptoragonisten (allmänbedövning) propofol (50 μM), som förstärker strömmen inducerad av GABA ensam. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: MTS-analys för att bedöma läkemedelspotens. a) Kemiska reaktioner som ligger till grund för "MTS-testet" och som används för att bedöma ett agens potens, vilket återspeglas i minskad cellproliferation. Reduktion av MTS-tetrazolium av celler som är livskraftiga, vilket genererar färgämnet formazan. (B) En platta med 96 brunnar som visar kolorimetriska resultat av en MTS-analys med ökande läkemedelskoncentrationer. I detta experiment behandlas DAOY-medulloblastomcancercellerna med ökande koncentrationer av ett prekliniskt läkemedel, KRM-II-08, en positiv allosterisk modulator av GABAA-receptorn . c) En dos-responskurva genererad med MTS-testet (från kvantifieringen av 96-brunnsplattan). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Handbok Halv/helautomatisk
Genomströmning Låg Hög
Snabbt utbyte av lösningar Möjlig Ja
Kostnad Hög Låg
Operatör Rutinerad Nybörjare/Medel
Typ av cell Alla celler; Vävnader Primära enskilda celler; cellinjer
Cellnummer krävs Minimum* Hög*
Läkemedels-/lösningsvolym Hög Låg
Resurser/verktyg Hög Låg
Underhåll Hög Låg
Kontroll av experiment Väldigt bra Bra
Avbildning av levande celler Ja Nej
*Port-a-Patch, till exempel, kräver minst en miljon celler / ml för inspelningar, medan en manuell inställning vanligtvis behöver några hundra celler på ett täckglas.

Tabell 1: Jämförelse av manuella kontra halv- och/eller helautomatiska elektrofysiologiska inställningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förändringar i jonkanalfunktionen förändrar intracellulära signalkaskader, vilket kan påverka cellens övergripande funktion. Under det senaste decenniet har det blivit allt tydligare att jonkanaler är viktiga för cancercellstillväxt och metastasering. Viktigt är att många jonkanaler är primära mål för godkända terapier som riktar sig mot ett brett spektrum av störningar24. Utredare har undersökt om jonkanaler kan vara anti-cancermål, och de första resultaten lovar 2,16,25. Fältet har precis börjat undersöka jonkanalernas roll i cancerutveckling och som terapeutiska mål, och framtiden ser ljus ut på båda fronterna.

I detta arbete tillhandahålls detaljerade procedurer för att analysera jonkanaler i cancerceller och bestämma om en kanal är en terapeutisk sårbarhet. Dessa analyser fungerar som en guide för att hjälpa till att studera jonkanaler i cancerceller. Metoder har beskrivits som fokuserar på visualisering av jonkanaler i cancerceller, bestämning av hur modulering av jonkanaler förändrar cancercellernas polariserade tillstånd, olika metoder för att analysera jonkanalfunktion med hjälp av elektrofysiologi och mätning av cancercellernas livskraft.

Immunofluorescensfärgning kan användas för att detektera närvaro och cellulär lokalisering av jonkanaler. De experimentella förhållandena måste optimeras noggrant för att exakt representera var en kanal finns i cellen. Intuitivt kan man förvänta sig att färgningen av jonkanaler är relativt enkel, eftersom de sannolikt är lösningsmedelstillgängliga. Det är dock viktigt att komma ihåg att immunofluorescensepitopen kanske inte är lättillgänglig, beroende på om den ingår i en extracellulär eller intracellulär domän. Dessutom är jonkanaler ofta tätt grupperade på cellmembran, så deras detektion genom immunfärgning kan kräva mer omfattande optimering av fixerings- och permeabiliseringsprocedurerna jämfört med andra klasser av proteiner14,26.

Mitokondriell membranpotential är avgörande för många mitokondrierassocierade processer, inklusive ATP-syntes, generering av reaktiva syreradikaler (ROS), kalciumbindning, import av mitokondriella proteiner, membrandynamik och utlösande apoptos. Detta protokoll använder TMRE-analysen för att märka membranpotential i aktiva mitokondrier i enskilda celler. För skärmar med hög genomströmning kan TMRE-nivåerna mätas med en fluorescensplatta i mikroplattformat.

Patch-clamp elektrofysiologi är "guldstandard" -metoden för studier av jonkanalkinetik. Helcells- och enkanalsmetoder är också de metoder med högst upplösning för att exakt bestämma struktur-funktionsförhållandena och farmakologin hos jonkanalmodulatorer. Denna metod utnyttjar studien av små elektriska förändringar över ett membran som orsakas av joners rörelse genom jonkanaler27. Elektrofysiologiska experiment utförs traditionellt med hjälp av manuella patch-clamp-elektrofysiologiska inspelningar av en enda cell åt gången, vilket resulterar i en metod med låg genomströmning som kräver att användaren har en serie specialiserade färdigheter. Automatiserade patch-clamp-elektrofysiologitekniker, såsom Port-a-Patch, IonFlux Mercury, Patchliner och/eller Synchropatch-teknik, erbjuder flera inspelningar åt gången, och dessa tekniker är utrustade med en sofistikerad perfusionsinställning för sammansatt applikation, vilket resulterar i halvhög genomströmning eller hög genomströmning utan att kräva speciella färdigheter. För vissa experiment är manuell fastspänning oersättlig (tabell 1). Ändå har automatiserad patch-clamp-teknik påskyndat jonkanalbiofysikforskning och relaterade läkemedelsupptäcktsprogram. En av begränsningarna för inspelning från primära/icke-transfekterade celler är bidraget från läckande, icke-specifika endogena strömmar. I våra inspelningar observerade vi små baslinjevariationer, vilket tyder på ett potentiellt bidrag från endogena strömmar från D283-celler.

Cellproliferationsanalyser mäter störningen av celltillväxtaktivitet som svar på ett kemiskt medel. Sådana analyser är kritiska verktyg för att bedöma verkan av ett läkemedel på cellproliferation. För att utvärdera cellproliferation använder utredare oftast MTT (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid), MTS (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-5-[3-karboximetoxifenyl]-2-[4-sulfofenyl]-2H-tetrazolium) och / eller klonogena analyser. MTT- och MTS-analyser mäter omvandlingen (reduktionen) av ett vattenlösligt tetrazoliumsalt (gult) till en kvantifierbar formazanprodukt (lila i MTT-testet), som katalyseras av dehydrogenasenzymsystemet i metaboliskt aktiva celler. Intensiteten hos den färgade produkten ger en uppskattning av antalet "livskraftiga" (t.ex. metaboliskt aktiva) celler. Däremot analyserar den klonogena analysen förmågan hos enskilda celler i odling att bilda en koloni (minst 50 celler eller sex på varandra följande divisioner) efter behandling med ett läkemedel28,29. MTT, MTS och klonogena analyser har var och en fördelar och nackdelar, och man bör noggrant bedöma lämpligheten av dessa analyser för att bestämma styrkan hos ett läkemedel med en given cellinje. Optimalt rekommenderas användning av mer än en av dessa analyser (t.ex. klonogena och MTT- eller MTS-analyser) för att bestämma styrkan hos ett läkemedel.

MTT- och MTS-analyserna bedömer den metaboliska aktiviteten hos levande celler, som kan variera beroende på celltyp och analystillstånd. MTT- eller MTS-analyserna är fördelaktiga, eftersom dessa analyser är lätta att utföra, kan utföras i replikat och är mottagliga för screening med hög genomströmning30. MTT- eller MTS-analyserna kan slutföras på 3-4 dagar, medan den klonogena analysen kan ta 10-21 dagar, beroende på egenskaperna hos den använda cellinjen28. Däremot är nackdelarna med både MTS- och MTT-analyserna möjlig interferens av de reagens som krävs för att utföra analysen med odlingsmedium, svårigheten att använda analysen och den potentiella variationen mellan replikat på grund av cellens metaboliska status och odlingsförhållanden31. När det gäller valet mellan MTT- och MTS-analyserna bör man tänka på att MTT-analysen kräver ett solubiliseringssteg för att lysera cellerna och låta formazankristallerna lösas upp i mediet och visar absorbans vid 570 nm, medan MTS-analysen är en "enstegsanalys", där formazan direkt solubiliseras i mediet utan intermittenta steg (t.ex. celllyssteget). Formazanprodukten i MTS-analysen är mörkare i färg och har ett känsligare absorbansvärdeintervall (490-500 nm), vilket gör det lättare att fastställa ett positivt svar. MTS-analysen är snabbare än MTT-analysen, eftersom 2-3 timmar behövs för reaktionen jämfört med 4 timmar för reaktionen plus 1-2 timmars löslighet i MTT-analysen. Dessutom förblir MTS-analysformazanprodukten suspenderad och analysen är mer lämplig för suspensionsceller än MTT-analysen, eftersom ingen medieförändring krävs under MTS-analysen32. En modifierad MTT-analys har dock utvecklats där löslighetssteget har förbättrats med en kombination av DMSO- och SDS-lyslösning. Denna modifierade MTT-analys kan användas för både vidhäftande celler och suspensionsceller. Om man väljer att använda MTT-analysen bör man vara försiktig vid valet av cellodling och de förhållanden/reagens som används för celltillväxt. Till exempel kommer resultaten att variera om cellerna odlas som ett monolager, differentierat, som ett sammanflytande monolager eller senescent. Dessutom kan vissa icke-mitokondriella dehydrogenaser, som vissa intracellulära reduktaser och flavinoxidaser, minska MTT-reagenset, vilket möjligen framkallar falskt positiva avläsningar33. Vidare har MTT-reagenset en grad av toxicitet, så inkubationstiden bör begränsas. Hastigheten för MTT-reduktion kan också förändras med odlingsförhållandena, såsom mediets pH- och glukosinnehåll och cellernas fysiologiska tillstånd32,34. Till exempel minskar närvaron av askorbinsyra enligt uppgift MTT till formazan, och denna effekt förstärks i närvaro av retinol35. När det gäller potentiella problem med den klonogena analysen är det viktigt att vara medveten om att cellerna efter läkemedelstillsats kan bli för tidigt senescenta och "klonogeniskt inaktiva" (dvs. de bildar inte kolonier) men förblir metaboliskt aktiva och uppvisar aktivitet i MTT- eller MTS-analyserna. En annan punkt att komma ihåg är att den klonogena analysen är begränsad till studier av vidhäftande celler, och inte alla vidhäftande celler kan bilda kolonier när de pläteras vid låga celldensiteter, eftersom cell-cellkommunikation förloras36. På grund av otillräcklig cell-cellkommunikation och begränsningarna av egenproducerade tillväxtfaktorer svarar den klonogena analysen på lägre läkemedelsdoser än MTT- och MTS-analyserna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.A.P.K. är en av grundarna, presidenten och VD för Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. är en av grundarna av Amlal Pharmaceuticals Inc. och sitter i Drug Safety Monitoring Board för Bexion Pharmaceuticals, Inc.

Acknowledgments

Författarna erkänner stöd från Thomas E. &; Pamela M. Mischell Family Foundation till SS och Harold C. Schott Foundation-finansiering av Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, till SS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABS SpectraMax Plate Reader Molecular Devices ABS
Accutase Invitrogen 00-4555-56
Alexa Flor 488 Invitrogen A32723 Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 100x
B27 Supplement Gibco 12587-010 Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet LABCONCO 302381101 Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1606-100
CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-211 Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride Fisher Scientific C7902 Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm Fisher Scientific 12-600-004 Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2 Fisher Scientific 430641U Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well Fisher Scientific 353046 Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well Fisher Scientific 353072 Cell culture treated
Centrifuge Eppendorf EP-5804R Refrigerated
Corning CoolCell Fisher Scientific 07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-553-450 Corning brand
D283 Med ATCC HTB-185
DABCO Mounting Media EMS 17989-97
D-Glucose Sigma Life Sciences D9434
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650 Cell culture grade
DMEM/F12, base media Fisher Scientific 11330-032 With phenol red
DMEM/F12, phenol red free Fisher Scientific 21041-025
EGTA Sigma Aldrich E4378
Epidermal Growth Factor STEMCELL 78006.1
FCCP Abcam AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic Millipore GF003
GARBA5 Antibody Aviva ARP30687_P050 Rabbit Polyclonal
Glutamax Gibco 35050-061
Glycerol Mounting Medium EMS 17989-60 With DAPI+DABCO
Hemocytometer Millipore Sigma
Heparin STEMCELL 7980
HEPES HyClone SH3023701 Solution
HEPES Fisher Scientific BP310-500 Solid
ImageJ Open platform With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI EMS 17989-97
KRM-II-08 experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor Novus N276314100U
L-Glutamine Gibco 25030-081
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M9272 Hexahydrate
Microscope, Confocal Leica SP8
Microscope, Light VWR 76382-982 DMiL Inverted
MTS - Promega One Step Promega G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL Eppendorf Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL Eppendorf Z683957
Nest-O-Patch Heka
Neurobasal-A Medium Gibco 10888022 Without vitamin A
Neurobasal-A Medium Gibco 12348-017 Phenol red free
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
NOR-QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm Fisher Scientific 50-998-944 4 inch width
Paraformaldehyde EMS RT-15710
PATHCHMASTER Heka
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Perfusion System Nanion 4000120
PFA EMS RT-15710
Phosphate Bufered Saline Fisher Scientific AAJ75889K2 Reagent grade
Poly-D-Lysine Fisher Scientific A3890401
Poly-L-Lysine Sigma Life Sciences P4707
Port-a-Patch Nanion 21000072
Potassium Chloride Sigma Life Sciences P5405
Primary Antibody Invitrogen MA5-34653 Rabbit Monoclonal
Prism GraphPad
Propofol Fisher Scientific NC0758676 1 mL ampule
QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs VWR 89094-664 Sterile
Slides, 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-544-7 Frosted one side
Sodium Bicarbonate Corning 25-035-Cl
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070
Synth-a-Freeze Medium Gibco R00550 Cryopreservation
TMRE Fisher Scientific 50-196-4741 Reagent
TMRE Kit Abcam AB113852 Kit
Triton X-100 Sigma Aldrich NC0704309
Trypan Blue Gibco 15-250-061 Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Solution, 0.25%
Vortex Mixer VWR 97043-562
Whatman Filter Paper Fisher Scientific 09-927-841

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
  3. Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
  4. Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
  5. Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
  6. Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen'kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
  7. Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
  8. Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
  9. Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
  10. Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
  11. Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
  12. Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
  13. Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
  14. Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
  15. Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
  16. Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
  17. Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
  18. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
  19. Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
  20. Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
  21. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  22. Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
  23. Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
  24. IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology. , Available from: www.guidetopharmacology.org/GRAC/ReceptorFamiliesForward?type=IC (2022).
  25. Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
  26. Konno, K., Watanabe, M. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. Luján, R., Ciruela, F. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  27. Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
  28. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  29. Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
  30. Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
  31. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
  32. Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
  33. Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
  34. Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
  35. Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
  36. Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).

Tags

Cancerforskning Utgåva 196 Membrantransport jonkanaler cellviabilitet cancerceller medulloblastom GABAA-receptorer
Screening jonkanaler i cancerceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam,… More

Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam, D. K., Bhattacharya, D., Jenkins, A., Sengupta, S., Pomeranz Krummel, D. A. Screening Ion Channels in Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65427, doi:10.3791/65427 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter