Le ciblage pharmacologique des canaux ioniques est une approche prometteuse pour le traitement des tumeurs solides. Des protocoles détaillés sont fournis pour caractériser la fonction des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses et tester les effets des modulateurs des canaux ioniques sur la viabilité du cancer.
Les canaux ioniques sont essentiels au développement cellulaire et au maintien de l’homéostasie cellulaire. La perturbation de la fonction des canaux ioniques contribue au développement d’un large éventail de troubles ou de canalopathies. Les cellules cancéreuses utilisent des canaux ioniques pour conduire leur propre développement, ainsi que pour s’améliorer en tant que tumeur et pour s’assimiler dans un microenvironnement qui comprend diverses cellules non cancéreuses. En outre, l’augmentation des niveaux de facteurs de croissance et d’hormones dans le microenvironnement tumoral peut entraîner une expression améliorée des canaux ioniques, ce qui contribue à la prolifération et à la survie des cellules cancéreuses. Ainsi, le ciblage pharmacologique des canaux ioniques est potentiellement une approche prometteuse pour traiter les tumeurs malignes solides, y compris les cancers primitifs et métastatiques du cerveau. Ici, des protocoles pour caractériser la fonction des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses et des approches pour analyser les modulateurs des canaux ioniques afin de déterminer leur impact sur la viabilité du cancer sont décrits. Il s’agit notamment de colorer une cellule (s) pour un canal ionique, de tester l’état polarisé des mitochondries, d’établir la fonction du canal ionique à l’aide de l’électrophysiologie et d’effectuer des tests de viabilité pour évaluer la puissance du médicament.
Les protéines de transport membranaire sont essentielles à la communication entre les cellules, ainsi qu’au maintien de l’homéostasie cellulaire. Parmi les protéines de transport membranaire, les canaux ioniques servent à stimuler la croissance et le développement des cellules et à maintenir l’état des cellules dans des environnements difficiles et changeants. Il a également été rapporté que les canaux ioniques conduisent et soutiennent le développement de tumeurs solides, à la fois systémiques et dans le système nerveux central (SNC)1,2. Par exemple, les canaux KCa3.1 sont responsables de la régulation du potentiel membranaire et du contrôle du volume cellulaire, ce qui est important dans la régulation du cycle cellulaire. Des canaux KCa3.1 défectueux ont été signalés pour contribuer à la prolifération anormale des cellules tumorales3. De plus, les canaux ioniques peuvent contribuer à la dissémination métastatique des cancers. Les canaux du potentiel récepteur transitoire (TRP), par exemple, sont impliqués dans l’afflux de Ca 2+ et de Mg2+; Cet afflux active plusieurs kinases et protéines de choc thermique qui fonctionnent pour réguler la matrice extracellulaire entourant une tumeur, ce qui est, à son tour, important pour initier les métastases cancéreuses4.
Étant donné que les canaux ioniques peuvent contribuer au développement de cancers, ils peuvent également être des cibles pour le traitement du cancer lié aux médicaments. Par exemple, la résistance aux modalités de traitement, y compris la chimiothérapie et la nouvelle immunothérapie, est liée à la dysrégulation de la fonction des canaux ioniques 5,6,7. En outre, les canaux ioniques deviennent des cibles médicamenteuses importantes pour entraver la croissance et le développement des cancers, avec des médicaments à petites molécules réutilisés (approuvés par la FDA) à l’étude, ainsi que des biopolymères, y compris des anticorps monoclonaux 1,2,8,9. Bien qu’il y ait eu beaucoup de progrès sur ce front, la découverte de médicaments contre le cancer des canaux ioniques reste sous-développée. Cela est dû en partie aux défis uniques de l’étude des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses. Par exemple, il existe des limites techniques dans la mise en place de tests électrophysiologiques pour les composés à action lente et des différences temporelles dans l’activation des canaux et l’action du médicament. En outre, la solubilité des composés peut également entraver les progrès, car la plupart des systèmes électrophysiologiques automatisés couramment utilisés aujourd’hui utilisent des substrats hydrophobes, ce qui peut contribuer aux artefacts résultant de l’adsorption des composés. En outre, les grands traitements moléculaires bioorganiques tels que les produits naturels, les peptides et les anticorps monoclonaux sont techniquement difficiles à dépister à l’aide de tests électrophysiologiques conventionnels10. Enfin, les propriétés bioélectriques des cellules cancéreuses restent mal comprises11.
Pendant ce temps, la coloration par immunofluorescence des canaux ioniques est souvent difficile. Cela est dû, en partie, à la complexité de leurs structures et de leur contexte dans la membrane, qui ont un impact sur la capacité de générer et d’utiliser des anticorps pour les études de microscopie. Il est particulièrement important que la spécificité, l’affinité et la reproductibilité des anticorps utilisés pour colorer les canaux ioniques soient validées. Les anticorps commerciaux pour les canaux ioniques doivent être envisagés en fonction de leur stratégie de validation et de leur dossier de publication. Les expériences doivent inclure des témoins négatifs pour démontrer l’absence de liaison non spécifique par knockdown ou knockout de la protéine cible. Alternativement, les lignées cellulaires dans lesquelles la protéine cible est absente ou en faible abondance basée sur les déterminations d’ARNm ou de protéines peuvent servir de témoins négatifs. Par exemple, cette étude montre la localisation de la sous-unité du récepteur (GABA) Gabra5 dans une lignée cellulaire de médulloblastome (D283). Les cellules D283 avec un siRNA knockdown et les cellules Daoy, une autre lignée cellulaire de médulloblastome cérébelleux, ont été colorées pour Gabra5 et n’ont montré aucune coloration appréciable (données non présentées).
Ici, des méthodes sont présentées pour analyser et tester la fonction des canaux ioniques, ainsi que l’effet des modulateurs des canaux ioniques sur les cellules cancéreuses. Des protocoles sont fournis pour (1) colorer les cellules d’un canal ionique, (2) tester l’état polarisé des mitochondries, (3) établir la fonction du canal ionique à l’aide de l’électrophysiologie et (4) valider des médicaments in vitro. Ces protocoles mettent l’accent sur les études du récepteur 2,12,13,14,15,16 de l’acide gamma-aminobutyrique de type A (GABA A), un canal anionique chlorure et un récepteur neurotransmetteur inhibiteur majeur. Cependant, les méthodes présentées ici s’appliquent à l’étude de nombreuses autres cellules cancéreuses et canaux ioniques.
Les changements dans la fonction du canal ionique modifient les cascades de signalisation intracellulaires, ce qui peut avoir un impact sur le fonctionnement global d’une cellule. Au cours de la dernière décennie, il est devenu de plus en plus clair que les canaux ioniques sont importants pour la croissance des cellules cancéreuses et les métastases. Il est important de noter que de nombreux canaux ioniques sont des cibles principales pour les traitements approuvés ciblant un large éventail de troubles<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient la Fondation de la famille Thomas E. & Pamela M. Mischell à S.S. et le financement de la Fondation Harold C. Schott de la chaire dotée Harold C. Schott, UC College of Medicine, à S.S.
ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
FCCP | Abcam | AB120081 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
Heparin | STEMCELL | 7980 | |
HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
Nest-O-Patch | Heka | ||
Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
PATHCHMASTER | Heka | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
PFA | EMS | RT-15710 | |
Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
Prism | GraphPad | ||
Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |