Summary

Criblage des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses

Published: June 16, 2023
doi:

Summary

Le ciblage pharmacologique des canaux ioniques est une approche prometteuse pour le traitement des tumeurs solides. Des protocoles détaillés sont fournis pour caractériser la fonction des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses et tester les effets des modulateurs des canaux ioniques sur la viabilité du cancer.

Abstract

Les canaux ioniques sont essentiels au développement cellulaire et au maintien de l’homéostasie cellulaire. La perturbation de la fonction des canaux ioniques contribue au développement d’un large éventail de troubles ou de canalopathies. Les cellules cancéreuses utilisent des canaux ioniques pour conduire leur propre développement, ainsi que pour s’améliorer en tant que tumeur et pour s’assimiler dans un microenvironnement qui comprend diverses cellules non cancéreuses. En outre, l’augmentation des niveaux de facteurs de croissance et d’hormones dans le microenvironnement tumoral peut entraîner une expression améliorée des canaux ioniques, ce qui contribue à la prolifération et à la survie des cellules cancéreuses. Ainsi, le ciblage pharmacologique des canaux ioniques est potentiellement une approche prometteuse pour traiter les tumeurs malignes solides, y compris les cancers primitifs et métastatiques du cerveau. Ici, des protocoles pour caractériser la fonction des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses et des approches pour analyser les modulateurs des canaux ioniques afin de déterminer leur impact sur la viabilité du cancer sont décrits. Il s’agit notamment de colorer une cellule (s) pour un canal ionique, de tester l’état polarisé des mitochondries, d’établir la fonction du canal ionique à l’aide de l’électrophysiologie et d’effectuer des tests de viabilité pour évaluer la puissance du médicament.

Introduction

Les protéines de transport membranaire sont essentielles à la communication entre les cellules, ainsi qu’au maintien de l’homéostasie cellulaire. Parmi les protéines de transport membranaire, les canaux ioniques servent à stimuler la croissance et le développement des cellules et à maintenir l’état des cellules dans des environnements difficiles et changeants. Il a également été rapporté que les canaux ioniques conduisent et soutiennent le développement de tumeurs solides, à la fois systémiques et dans le système nerveux central (SNC)1,2. Par exemple, les canaux KCa3.1 sont responsables de la régulation du potentiel membranaire et du contrôle du volume cellulaire, ce qui est important dans la régulation du cycle cellulaire. Des canaux KCa3.1 défectueux ont été signalés pour contribuer à la prolifération anormale des cellules tumorales3. De plus, les canaux ioniques peuvent contribuer à la dissémination métastatique des cancers. Les canaux du potentiel récepteur transitoire (TRP), par exemple, sont impliqués dans l’afflux de Ca 2+ et de Mg2+; Cet afflux active plusieurs kinases et protéines de choc thermique qui fonctionnent pour réguler la matrice extracellulaire entourant une tumeur, ce qui est, à son tour, important pour initier les métastases cancéreuses4.

Étant donné que les canaux ioniques peuvent contribuer au développement de cancers, ils peuvent également être des cibles pour le traitement du cancer lié aux médicaments. Par exemple, la résistance aux modalités de traitement, y compris la chimiothérapie et la nouvelle immunothérapie, est liée à la dysrégulation de la fonction des canaux ioniques 5,6,7. En outre, les canaux ioniques deviennent des cibles médicamenteuses importantes pour entraver la croissance et le développement des cancers, avec des médicaments à petites molécules réutilisés (approuvés par la FDA) à l’étude, ainsi que des biopolymères, y compris des anticorps monoclonaux 1,2,8,9. Bien qu’il y ait eu beaucoup de progrès sur ce front, la découverte de médicaments contre le cancer des canaux ioniques reste sous-développée. Cela est dû en partie aux défis uniques de l’étude des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses. Par exemple, il existe des limites techniques dans la mise en place de tests électrophysiologiques pour les composés à action lente et des différences temporelles dans l’activation des canaux et l’action du médicament. En outre, la solubilité des composés peut également entraver les progrès, car la plupart des systèmes électrophysiologiques automatisés couramment utilisés aujourd’hui utilisent des substrats hydrophobes, ce qui peut contribuer aux artefacts résultant de l’adsorption des composés. En outre, les grands traitements moléculaires bioorganiques tels que les produits naturels, les peptides et les anticorps monoclonaux sont techniquement difficiles à dépister à l’aide de tests électrophysiologiques conventionnels10. Enfin, les propriétés bioélectriques des cellules cancéreuses restent mal comprises11.

Pendant ce temps, la coloration par immunofluorescence des canaux ioniques est souvent difficile. Cela est dû, en partie, à la complexité de leurs structures et de leur contexte dans la membrane, qui ont un impact sur la capacité de générer et d’utiliser des anticorps pour les études de microscopie. Il est particulièrement important que la spécificité, l’affinité et la reproductibilité des anticorps utilisés pour colorer les canaux ioniques soient validées. Les anticorps commerciaux pour les canaux ioniques doivent être envisagés en fonction de leur stratégie de validation et de leur dossier de publication. Les expériences doivent inclure des témoins négatifs pour démontrer l’absence de liaison non spécifique par knockdown ou knockout de la protéine cible. Alternativement, les lignées cellulaires dans lesquelles la protéine cible est absente ou en faible abondance basée sur les déterminations d’ARNm ou de protéines peuvent servir de témoins négatifs. Par exemple, cette étude montre la localisation de la sous-unité du récepteur (GABA) Gabra5 dans une lignée cellulaire de médulloblastome (D283). Les cellules D283 avec un siRNA knockdown et les cellules Daoy, une autre lignée cellulaire de médulloblastome cérébelleux, ont été colorées pour Gabra5 et n’ont montré aucune coloration appréciable (données non présentées).

Ici, des méthodes sont présentées pour analyser et tester la fonction des canaux ioniques, ainsi que l’effet des modulateurs des canaux ioniques sur les cellules cancéreuses. Des protocoles sont fournis pour (1) colorer les cellules d’un canal ionique, (2) tester l’état polarisé des mitochondries, (3) établir la fonction du canal ionique à l’aide de l’électrophysiologie et (4) valider des médicaments in vitro. Ces protocoles mettent l’accent sur les études du récepteur 2,12,13,14,15,16 de l’acide gamma-aminobutyrique de type A (GABA A), un canal anionique chlorure et un récepteur neurotransmetteur inhibiteur majeur. Cependant, les méthodes présentées ici s’appliquent à l’étude de nombreuses autres cellules cancéreuses et canaux ioniques.

Protocol

1. Canaux ioniques immunomarqueurs dans les cellules en culture Préparation des cellules et mise en place expérimentaleMaintenir les cellules en culture en croissance active dans des flacons de culture de 75 cm2 . Passez les cellules une fois jusqu’à ce qu’elles deviennent confluentes à 50%-90%, en fonction du temps de doublement de la lignée cellulaire utilisée.REMARQUE : Pour la présente étude, des cellules D283, une lignée cellulaire de médulloblastome du groupe 3, ont é…

Representative Results

Ci-dessus sont des procédures sélectionnées qui peuvent être utilisées pour caractériser les canaux ioniques dans les cellules cancéreuses. Le premier protocole met en évidence la coloration d’un canal ionique. Comme détaillé, il existe de nombreux défis lors de la coloration d’un canal ionique ou, d’ailleurs, de toute protéine présente dans la membrane extracellulaire. La figure 1 montre la coloration d’une sous-unité du récepteur pentamère GABAA. Le deuxi…

Discussion

Les changements dans la fonction du canal ionique modifient les cascades de signalisation intracellulaires, ce qui peut avoir un impact sur le fonctionnement global d’une cellule. Au cours de la dernière décennie, il est devenu de plus en plus clair que les canaux ioniques sont importants pour la croissance des cellules cancéreuses et les métastases. Il est important de noter que de nombreux canaux ioniques sont des cibles principales pour les traitements approuvés ciblant un large éventail de troubles<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient la Fondation de la famille Thomas E. & Pamela M. Mischell à S.S. et le financement de la Fondation Harold C. Schott de la chaire dotée Harold C. Schott, UC College of Medicine, à S.S.

Materials

ABS SpectraMax Plate Reader Molecular Devices ABS
Accutase Invitrogen 00-4555-56
Alexa Flor 488 Invitrogen A32723 Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 100x
B27 Supplement Gibco 12587-010 Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet LABCONCO 302381101 Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1606-100
CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-211 Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride Fisher Scientific C7902 Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm Fisher Scientific 12-600-004 Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2 Fisher Scientific 430641U Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well Fisher Scientific 353046 Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well Fisher Scientific 353072 Cell culture treated
Centrifuge Eppendorf EP-5804R Refrigerated
Corning CoolCell Fisher Scientific 07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-553-450 Corning brand
D283 Med ATCC HTB-185
DABCO Mounting Media EMS 17989-97
D-Glucose Sigma Life Sciences D9434
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650 Cell culture grade
DMEM/F12, base media Fisher Scientific 11330-032 With phenol red
DMEM/F12, phenol red free Fisher Scientific 21041-025
EGTA Sigma Aldrich E4378
Epidermal Growth Factor STEMCELL 78006.1
FCCP Abcam AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic Millipore GF003
GARBA5 Antibody Aviva ARP30687_P050 Rabbit Polyclonal
Glutamax Gibco 35050-061
Glycerol Mounting Medium EMS 17989-60 With DAPI+DABCO
Hemocytometer Millipore Sigma
Heparin STEMCELL 7980
HEPES HyClone SH3023701 Solution
HEPES Fisher Scientific BP310-500 Solid
ImageJ Open platform With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI EMS 17989-97
KRM-II-08 experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor Novus N276314100U
L-Glutamine Gibco 25030-081
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M9272 Hexahydrate
Microscope, Confocal Leica SP8
Microscope, Light VWR 76382-982 DMiL Inverted
MTS – Promega One Step Promega G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL Eppendorf Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL Eppendorf Z683957
Nest-O-Patch Heka
Neurobasal-A Medium Gibco 10888022 Without vitamin A
Neurobasal-A Medium Gibco 12348-017 Phenol red free
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
NOR-QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm Fisher Scientific 50-998-944 4 inch width
Paraformaldehyde EMS RT-15710
PATHCHMASTER Heka
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Perfusion System Nanion 4000120
PFA EMS RT-15710
Phosphate Bufered Saline Fisher Scientific AAJ75889K2 Reagent grade
Poly-D-Lysine Fisher Scientific A3890401
Poly-L-Lysine Sigma Life Sciences P4707
Port-a-Patch Nanion 21000072
Potassium Chloride Sigma Life Sciences P5405
Primary Antibody Invitrogen MA5-34653 Rabbit Monoclonal
Prism GraphPad
Propofol Fisher Scientific NC0758676 1 mL ampule
QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs VWR 89094-664 Sterile
Slides, 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-544-7 Frosted one side
Sodium Bicarbonate Corning 25-035-Cl
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070
Synth-a-Freeze Medium Gibco R00550 Cryopreservation
TMRE Fisher Scientific 50-196-4741 Reagent
TMRE Kit Abcam AB113852 Kit
Triton X-100 Sigma Aldrich NC0704309
Trypan Blue Gibco 15-250-061 Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Solution, 0.25%
Vortex Mixer VWR 97043-562
Whatman Filter Paper Fisher Scientific 09-927-841

References

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Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam, D. K., Bhattacharya, D., Jenkins, A., Sengupta, S., Pomeranz Krummel, D. A. Screening Ion Channels in Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65427, doi:10.3791/65427 (2023).

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