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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

कैंसर कोशिकाओं में स्क्रीनिंग आयन चैनल

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65427
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Department of Neurology and Rehabilitation Medicine, Division of Neuro-Oncology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Saint Joseph, 3The Vontz Center for Molecular Studies, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

आयन चैनलों का औषधीय लक्ष्यीकरण ठोस ट्यूमर के इलाज के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। कैंसर कोशिकाओं में आयन चैनल फ़ंक्शन को चिह्नित करने और कैंसर व्यवहार्यता पर आयन चैनल मॉड्यूलेटर के प्रभावों का आकलन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं।

Abstract

आयन चैनल सेल विकास और सेल होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। आयन चैनल फ़ंक्शन का क्षोभ विकारों या चैनलोपैथी की एक विस्तृत श्रृंखला के विकास में योगदान देता है। कैंसर कोशिकाएं अपने स्वयं के विकास को चलाने के लिए आयन चैनलों का उपयोग करती हैं, साथ ही एक ट्यूमर के रूप में सुधार करने और एक माइक्रोएन्वायरमेंट में आत्मसात करने के लिए जिसमें विभिन्न गैर-कैंसर कोशिकाएं शामिल हैं। इसके अलावा, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर विकास कारकों और हार्मोन के स्तर में वृद्धि के परिणामस्वरूप आयन चैनल अभिव्यक्ति में वृद्धि हो सकती है, जो कैंसर सेल प्रसार और अस्तित्व में योगदान देती है। इस प्रकार, आयन चैनलों का औषधीय लक्ष्यीकरण प्राथमिक और मेटास्टैटिक मस्तिष्क कैंसर सहित ठोस विकृतियों के इलाज के लिए संभावित रूप से एक आशाजनक दृष्टिकोण है। यहां, कैंसर कोशिकाओं में आयन चैनलों के कार्य को चिह्नित करने के लिए प्रोटोकॉल और कैंसर व्यवहार्यता पर उनके प्रभाव को निर्धारित करने के लिए आयन चैनलों के मॉड्यूलेटर का विश्लेषण करने के दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। इनमें एक आयन चैनल (ओं) के लिए एक सेल (ओं) को धुंधला करना, माइटोकॉन्ड्रिया की ध्रुवीकृत स्थिति का परीक्षण करना, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करके आयन चैनल फ़ंक्शन स्थापित करना और दवा शक्ति का आकलन करने के लिए व्यवहार्यता परख करना शामिल है।

Introduction

झिल्ली परिवहन प्रोटीन कोशिकाओं के बीच संचार के साथ-साथ सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। झिल्ली परिवहन प्रोटीन के बीच, आयन चैनल कोशिकाओं के विकास और विकास को चलाने और चुनौतीपूर्ण और बदलते वातावरण में कोशिकाओं की स्थिति को बनाए रखने के लिए काम करते हैं। आयन चैनलों को ठोस ट्यूमर के विकास को चलाने और समर्थन करने के लिए भी सूचित किया गया है, दोनों व्यवस्थित रूप से और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 1,2 में। उदाहरण के लिए, केसीए 3.1 चैनल झिल्ली क्षमता को विनियमित करने और सेल वॉल्यूम को नियंत्रित करने के लिए जिम्मेदार हैं, जो सेल-चक्र विनियमन में महत्वपूर्ण है। दोषपूर्ण केसीए 3.1 चैनलों कोट्यूमर कोशिकाओं के असामान्य प्रसार में योगदान करने के लिए सूचित किया गया है। इसके अलावा, आयन चैनल कैंसर के मेटास्टैटिक प्रसार में योगदान कर सकते हैं। क्षणिक रिसेप्टर क्षमता (टीआरपी) चैनल, उदाहरण के लिए, सीए 2 + और एमजी2 + प्रवाह में शामिल हैं; यह प्रवाह कई किनेसेस और हीट शॉक प्रोटीन को सक्रिय करता है जो एक ट्यूमर के आसपास के बाह्य मैट्रिक्स को विनियमित करने के लिए कार्य करते हैं, जो बदले में, कैंसर मेटास्टेसिस4 शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है।

चूंकि आयन चैनल कैंसर के विकास में योगदान कर सकते हैं, इसलिए वे दवा से संबंधित कैंसर उपचार के लिए भी लक्ष्य हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, कीमोथेरेपी और नोवेल इम्यूनोथेरेपी सहित उपचार के तौर-तरीकों का प्रतिरोध, आयन चैनल फ़ंक्शन डिसरेग्यूलेशन 5,6,7 से संबंधित है। इसके अलावा, आयन चैनल कैंसर के विकास और विकास को बाधित करने के लिए महत्वपूर्ण दवा लक्ष्य के रूप में उभर रहे हैं, जिसमें पुनर्निर्मित छोटे अणु (एफडीए-अनुमोदित) दवाओं की जांच की जा रही है, साथ ही मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1,2,8,9 सहित बायोपॉलिमर भी शामिल हैं। जबकि इस मोर्चे पर बहुत प्रगति हुई है, आयन चैनल कैंसर की दवा की खोज अविकसित बनी हुई है। यह आंशिक रूप से कैंसर कोशिकाओं में आयन चैनलों का अध्ययन करने की अनूठी चुनौतियों के कारण है। उदाहरण के लिए, धीमी गति से काम करने वाले यौगिकों के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी परख स्थापित करने में तकनीकी सीमाएं हैं और चैनल सक्रियण और दवा कार्रवाई में अस्थायी अंतर हैं। इसके अलावा, यौगिकों की घुलनशीलता भी प्रगति में बाधा डाल सकती है, क्योंकि आज आमतौर पर उपयोग में आने वाले अधिकांश स्वचालित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सिस्टम हाइड्रोफोबिक सब्सट्रेट्स का उपयोग करते हैं, जो यौगिक सोखना के परिणामस्वरूप कलाकृतियों में योगदान कर सकते हैं। इसके अलावा, प्राकृतिक उत्पादों, पेप्टाइड्स, और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जैसे बड़े जैवकार्बनिक आणविक चिकित्सीय पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी परख10 का उपयोग करके स्क्रीन करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं। अंत में, कैंसर कोशिकाओं के बायोइलेक्ट्रिकल गुणों को खराब तरीके से समझा जाताहै।

इस बीच, आयन चैनलों का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है। यह आंशिक रूप से, उनकी संरचनाओं की जटिलता और झिल्ली में उनके संदर्भ के कारण है, जो माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए एंटीबॉडी उत्पन्न करने और नियोजित करने की क्षमता को प्रभावित करते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि आयन चैनलों को दागने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी विशिष्टता, आत्मीयता और प्रजनन क्षमता के लिए मान्य हैं। आयन चैनलों के लिए वाणिज्यिक एंटीबॉडी को उनकी सत्यापन रणनीति और प्रकाशन रिकॉर्ड के आधार पर माना जाना चाहिए। प्रयोगों में लक्ष्य प्रोटीन के वध या नॉकआउट द्वारा निरर्थक बंधन की कमी को प्रदर्शित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण शामिल होना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, सेल लाइनें जिनमें लक्ष्य प्रोटीन अनुपस्थित है या एमआरएनए या प्रोटीन निर्धारण के आधार पर कम बहुतायत में है, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है। उदाहरण के लिए, यह अध्ययन मेडुलोब्लास्टोमा सेल लाइन (डी 283) में (जीएबीए) रिसेप्टर सबयूनिट गैबरा 5 के स्थानीयकरण को दर्शाता है। डी 283 कोशिकाओं के साथ एक सीआरएनए वध और डाओय कोशिकाओं, एक अन्य अनुमस्तिष्क मेडुलोब्लास्टोमा सेल लाइन, को गैबरा 5 के लिए दाग दिया गया था और कोई सराहनीय धुंधलापन नहीं दिखाया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया था)।

यहां, आयन चैनल फ़ंक्शन का विश्लेषण और परख करने के लिए विधियां प्रस्तुत की जाती हैं, साथ ही कैंसर कोशिकाओं पर आयन चैनल मॉड्यूलेटर का प्रभाव भी। प्रोटोकॉल (1) एक आयन चैनल के लिए कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए प्रदान किए जाते हैं, (2) माइटोकॉन्ड्रिया की ध्रुवीकृत स्थिति का परीक्षण करते हैं, (3) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करके आयन चैनल फ़ंक्शन स्थापित करते हैं, और (4) इन विट्रो ड्रग सत्यापन। ये प्रोटोकॉल टाइप ए गामा-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीएए) रिसेप्टर 2,12,13,14,15,16, एक क्लोराइड आयन चैनल और प्रमुख निरोधात्मक न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर के अध्ययन पर जोर देते हैं। हालांकि, यहां प्रस्तुत विधियां कई अन्य कैंसर कोशिकाओं और आयन चैनलों का अध्ययन करने के लिए लागू होती हैं।

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Protocol

1. सुसंस्कृत कोशिकाओं में इम्यूनोलेबलिंग आयन चैनल

  1. कोशिकाओं और प्रयोगात्मक सेट-अप तैयार करना।
    1. 75 सेमी2 कल्चर फ्लास्क में सक्रिय रूप से बढ़ती संस्कृति के रूप में कोशिकाओं को बनाए रखें। सेल लाइन के दोगुने होने के समय के आधार पर, कोशिकाओं को एक बार तब तक पारित करें जब तक कि वे 50% -90% कंफ्लुएंट न हो जाएं।
      नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, डी 283 कोशिकाओं, एक समूह 3 मेडुलोब्लास्टोमा सेल लाइन, का उपयोग किया गया था।
    2. कल्चर फ्लास्क से कोशिकाओं को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (15 एमएल या 50 एमएल) में इकट्ठा करें, और अनुयायी कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के बाद, कोशिकाओं को अलग करने में मदद करने के लिए फ्लास्क को तीन से पांच बार टैप करें। ट्रिप्सिन की कार्रवाई को रोकने के लिए 10% एफबीएस के साथ 10 एमएल माध्यम में कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    3. आरटी पर 5 मिनट के लिए 480 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सेल गोली को परेशान न करें।
    4. संस्कृति के घनत्व के आधार पर 5 एमएल से 10 एमएल माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: घनत्व सक्रिय रूप से बढ़ती कोशिकाओं के अनुरूप होना चाहिए और फ्लास्क में कोशिकाओं के प्रवाह पर निर्भर है। इष्टतम सेल घनत्व का अनुमान लगाने के लिए दृश्य मूल्यांकन का उपयोग किया जाना चाहिए; विशेष रूप से, कोशिकाओं को 40% -90% कंफ्लुएंट और समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए।
    5. 100 μL कोशिकाओं को निकालें, और गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए 0.4% ट्राइपैन ब्लू के 100 μL युक्त 1.5 mL ट्यूब में जोड़ें। सेल लाइन के आधार पर आरटी पर 5-15 मिनट इनक्यूबेट करें।
    6. समाधान के 10 μL में हेमोसाइटोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके मैन्युअल रूप से कोशिकाओं की गणना करें। हेमोसाइटोमीटर के 16 वर्गों के चार कोनों में से प्रत्येक में जीवित, बिना दाग वाली कोशिकाओं की गणना करें। कोशिकाओं को प्रति मिलीलीटर (कोशिकाएँ/एमएल) देने के लिए औसत सेल संख्या को कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करें और 10,000 से गुणा करें। वैकल्पिक रूप से, एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग किया जा सकता है।
    7. प्रत्येक सेल लाइन के लिए निर्दिष्ट कल्चर माध्यम में कोशिकाओं को 1 x 105 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें। बीज 1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 0.1 मिलीग्राम / एमएल पॉली-डी-लाइसिन के साथ 22 मिमी x 22 मिमी कवरस्लिप वाले 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 8 एमएल कोशिकाएं होती हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: कोई पॉली-डी-लाइसिन और पॉली-एल-लाइसिन दोनों के उपयोग का परीक्षण करना चाह सकता है, क्योंकि सेल लाइन-विशिष्ट वरीयताओं17,18 की रिपोर्ट ें हैं। कुछ सेल लाइनों में प्रोटीज होते हैं जो पॉली-एल-लाइसिन को तोड़ सकते हैं, जबकि ऐसी रिपोर्टें हैं कि पॉली-डी-लाइसिन कुछ सेल लाइनों के लिए विषाक्त है। इसके विपरीत, पीसी 12 जैसे न्यूरोनल कोशिकाओं को पॉली-डी-लाइसिन सतहों पर स्वस्थ बताया गया है।
    8. कोशिकाओं को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर 5% सीओ2 वातावरण के साथ एक इनक्यूबेटर में विकसित करें ताकि कोशिकाओं को कवरस्लिप से जुड़ने की अनुमति मिल सके। 20x उद्देश्य के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं के लगाव की जांच करें।
      नोट: उपचार या प्रत्यक्ष इम्यूनोस्टेनिंग से पहले कोशिकाओं को पूरी तरह से कवरस्लिप से जोड़ा जाना चाहिए। इस समय, कोशिकाओं को दवाओं (या वाहन नियंत्रण) के साथ इलाज किया जा सकता है या तो एक केंद्रित स्टॉक (उदाहरण के लिए, 4x स्टॉक समाधान के 600 μL) को जोड़कर या वांछित 1x एकाग्रता पर दवा युक्त ताजा माध्यम के साथ माध्यम का प्रतिस्थापन; कोशिकाओं को तब अतिरिक्त 48 घंटे तक इनक्यूबेटर में वापस किया जा सकता है। लक्ष्य अणु के स्तर और स्थानीयकरण पर दवा के प्रभावों का आकलन करने के लिए विलायक-उपचारित कोशिकाओं को शामिल किया जाता है। वर्तमान अध्ययन में, डी 283 कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए जीएबीएए रिसेप्टर-पॉजिटिव एलोस्टेरिक मॉड्यूलेटर, क्यूएच -II-06614 ( सामग्री की तालिका देखें) के 3.2 μM समाधान के 600 μL के साथ इलाज किया गया था। नियंत्रण कोशिकाओं को डीएमएसओ की बराबर मात्रा के साथ इलाज किया गया था।
  2. इम्यूनोलेबलिंग के लिए तैयारी: निर्धारण, परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग।
    1. कोशिकाओं को 2.5 मिलीलीटर 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH2PO4, सामग्री की तालिका देखें) के साथ कुल्ला करें, और तुरंत घोल को हटा दें।
    2. आरटी पर 1 घंटे के लिए 1x पीबीएस में 4% पीएफए के 1 एमएल का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें।
      नोट: जबकि 4% पीएफए इम्यूनोस्टेनिंग के लिए मानक फिक्सेटिव है, ग्लूटार्ल्डिहाइड या ग्लाइक्सल का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए झिल्ली प्रोटीन को ठीक करने के लिए भी किया जा सकता है। अल्कोहल-आधारित निर्धारण विधियां, जैसे बर्फ-ठंडे मेथनॉल के साथ उपचार, कम अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान और झिल्ली प्रोटीन19,20 के नुकसान का कारण बन सकती हैं।
    3. शेकर पर आंदोलन करके 1x पीबीएस (5 मिनट प्रति धोने) के 2.0 मिलीलीटर के साथ छह बार धोएं। 0.8% ट्राइटन एक्स -100 और प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों से मेल खाने वाले 10% सामान्य सीरम के साथ 1 x पीबीएस से बने ब्लॉकिंग बफर में आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें (वैकल्पिक रूप से, सामान्य सीरम के स्थान पर 3% बीएसए या गोजातीय सीरम अंश वी एल्बुमिन का उपयोग किया जा सकता है)।
      नोट: यह चरण गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को ब्लॉक करने के लिए नियोजित किया गया है।
  3. इम्यूनोलेबलिंग
    नोट: फ्लोरोफोरेस में संयुग्मित एंटीबॉडी को जोड़ने के बाद, फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए जल्द ही माप लिया जाना चाहिए। संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन को प्रकाश से बचाने की आवश्यकता होती है। एक बढ़ते माध्यम का उपयोग जिसमें मुक्त कणों को साफ करने वाले एजेंट होते हैं, फोटोब्लीचिंग को कम कर देगा। कवरलिप्स को सील करने के बाद स्लाइड्स को हल्के-तंग, अपारदर्शी कंटेनर (4 डिग्री सेल्सियस पर) में स्टोर करें। इमेजिंग करते समय, उत्तेजना रोशनी की तीव्रता और एक्सपोजर समय को सीमित करके फोटोब्लीचिंग को कम किया जा सकता है।
    1. फिल्टर पेपर के साथ 150 मिमी कल्चर डिश के तल को अस्तर करके एक ह्यूमिडिफायर कक्ष तैयार करें। फिल्टर पेपर को बाँझ आसुत जल से गीला करें। फिल्टर पेपर के शीर्ष पर फिट होने के लिए प्रयोगशाला फिल्म के एक टुकड़े पर 3 x 2 ग्रिड खींचें, और इसे 6-वेल प्लेट में कवरलिप्स के अभिविन्यास को संरक्षित करने के लिए लेबल करें। प्रयोगशाला फिल्म को फिल्टर पेपर के शीर्ष पर रखें, कक्ष को नम करने के लिए ऊपरी और निचले किनारों को उजागर करें।
    2. 3% बीएसए के साथ 1x PBS में प्राथमिक एंटीबॉडी के वांछित कमजोर पड़ने के प्रति कवरस्लिप 100 μL तैयार करें। गैबरा जीन प्रोटीन उत्पाद का पता लगाने के लिए, 1: 200 (गैबरा 5 एंटीबॉडी, मध्य क्षेत्र; सामग्री की तालिका देखें) के कमजोर पड़ने पर खरगोश पुनः संयोजक मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी एकाग्रता को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने के लिए जो पृष्ठभूमि पर इष्टतम संकेत पैदा करता है, द्वितीयक एकाग्रता स्थिर रखते हुए प्राथमिक एंटीबॉडी की कमजोर पड़ने की श्रृंखला का उपयोग करें। इष्टतम प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता स्थापित करने के लिए 1: 100, 1: 250, 1: 500, 1: 750 और 1: 1,000 के कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है।
    3. 6-वेल प्लेट में ब्लॉक समाधान से कवरस्लिप को प्रयोगशाला फिल्म पर खींचे गए ग्रिड पर उचित स्थान पर स्थानांतरित करें। 6-वेल प्लेट से ब्लॉक समाधान को छोड़ दें, और धोने के चरणों के लिए प्लेट को बनाए रखें।
    4. ध्यान से प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें। समाधान को कवरस्लिप के किनारे पर रखने से बचें। आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1x PBS के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें। कवरस्लिप को 6-वेल प्लेट में उपयुक्त स्थान पर वापस स्थानांतरित करें।
    6. 1x PBS के 2.5 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए छह वॉश करें।
      नोट: कुल्ला चरणों के दौरान कवरलिप्स को सूखने की अनुमति न दें, क्योंकि यह पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत में योगदान कर सकता है।
    7. प्रयोगशाला फिल्म पर उचित स्थान पर कवरलिप वापस करें। प्रत्येक कवरस्लिप के लिए, 1x PBS + 1% -5% बीएसए में पतला 100 μL द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें।
      नोट: प्रारंभ में, एलेक्सा फ्लुर 488 ( सामग्री की तालिका देखें) के लिए संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग 1x PBS + 3% बीएसए में 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर किया जाता है। यदि आवश्यक हो, तो कम-बहुतायत लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए एकाग्रता बढ़ाकर या पृष्ठभूमि को कम करने के लिए एकाग्रता को कम करके द्वितीयक एंटीबॉडी एकाग्रता को अनुकूलित किया जा सकता है।
    8. शेष चरणों के लिए, संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए प्रकाश जोखिम को कम करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ संस्कृति पकवान को कवर करें, और आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. कवरलिप्स को वापस 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। एक शेकर का उपयोग करके, 1x PBS के 2.5 mL के साथ 5 मिनट के लिए छह वॉश करें। प्लेट को सिंक या अपशिष्ट रिसेप्टेक के ऊपर से हटाकर पीबीएस को हटा दें। अंतिम धोने के बाद, कवरस्लिप को हटाने की सुविधा के लिए पीबीएस को कुएं में छोड़ दें।
    10. प्रत्येक कवरस्लिप के लिए एक माइक्रोस्कोप स्लाइड लेबल करें। स्लाइड के केंद्र में डीएपीआई (नाभिक को दागने के लिए) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ ग्लिसरॉल युक्त माउंटिंग माध्यम की एक बूंद जोड़ें।
    11. बल का उपयोग करके, कुएं से कवरस्लिप को हटा दें, और धीरे से इसे स्लाइड के केंद्र पर बढ़ते माध्यम की बूंद पर रखें।
      नोट: बढ़ते माध्यम में हवा के बुलबुले के गठन से बचें।
    12. अतिरिक्त माउंटिंग माध्यम को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर के छोटे टुकड़ों का उपयोग करें। नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें, और इमेजिंग से पहले पॉलिश को पूरी तरह से सूखने दें। ग्लास स्लाइड को एक अपारदर्शी प्लास्टिक बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. इमेजिंग और विश्लेषण
    1. विसर्जन तेल के साथ 40x उद्देश्य के तहत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ चित्र प्राप्त करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    2. उचित फिल्टर के साथ प्रतिदीप्ति छवियों की कल्पना करें।
    3. नोट: एलेक्सा फ्लुर 488 के लिए, 496 एनएम / 519 एनएम के उत्तेजना / उत्सर्जन का उपयोग करें; DAPI के लिए, 358 nm / 461 nm के उत्तेजना / उत्सर्जन का उपयोग करें।
    4. डिजिटल छवि फ़ाइलों को कैप्चर करें और सहेजें। छवि संग्रह दरों को सुविधाजनक बनाने और पृष्ठभूमि को कम करने के लिए 4 x 4 के बिनिंग मान का उपयोग किया जाता है।
    5. अंतिम चित्र तैयार करें। छवियों को ImageJ या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर के साथ संसाधित किया जा सकता है। परिणाम चित्र 1 में चित्रित किए गए हैं।

2. माइटोकॉन्ड्रिया की ध्रुवीकृत स्थिति का परीक्षण

नोट: यह प्रोटोकॉल सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया में झिल्ली क्षमता को लेबल करने के लिए टीएमआरई (टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर) परख का उपयोग करता है, जो नकारात्मक चार्ज21,22 बनाए रखता है। टीएमआरई एक सेल-पारगम्य, लाल-नारंगी, सकारात्मक रूप से चार्ज डाई है जो उनके सापेक्ष नकारात्मक चार्ज के कारण सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होती है। निष्क्रिय या विध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया ने झिल्ली क्षमता को कम कर दिया है और आनुपातिक रूप से टीएमआरई को अनुक्रमित करने में विफल रहता है। एफसीसीपी (कार्बोनिल साइनाइड 4-[ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी] फेनिलहाइड्राज़ोन), ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ओएक्सपीओएस) का एक आयोनोफोर अनकपलर, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को विध्रुवित करता है, इस प्रकार टीएमआरई23 के संचय और अनुक्रम को रोकता है। यह चित्र 2 में दर्शाया गया है।

  1. कोशिकाओं और प्रयोगात्मक सेट-अप तैयार करना।
    1. 75 सेमी2 कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं को बनाए रखें। कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें, और कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    2. अनुयायी कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और 10 एमएल मध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. कल्चर फ्लास्क से कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 480 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    4. संस्कृति के मूल संयोजन के आधार पर 5 एमएल से 10 एमएल माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, ताकि सेल एकाग्रता हेमोसाइटोमीटर पर प्रति वर्ग 50-100 कोशिकाएं हों। सटीक गिनती के लिए आवश्यक सेल घनत्व प्रदान करने के लिए, यदि आवश्यक हो, तो वॉल्यूम को समायोजित करें।
    5. कोशिकाओं के 100 μL निकालें, और 0.4% ट्राइपैन नीले रंग के 100 μL युक्त 1.5 mL ट्यूब में जोड़ें। हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। फिनोल लाल के बिना कल्चर माध्यम में कोशिकाओं को 3 x 104 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें।
      नोट: फिनोल लाल की कमी वाले डीएमईएम माध्यम का उपयोग किया जाता है क्योंकि फिनोल लाल एक्सपोजर झिल्ली पारगम्यता को रोकता है और पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस में योगदान कर सकता है।
    6. सेल सस्पेंशन (75,000 कोशिकाओं) के बीज 2.5 एमएल को 6-वेल प्लेट में डालें, जिसमें निर्माता के निर्देशों के अनुसार पॉली-डी-लाइसिन के साथ 22 x 22 मिमी कवरस्लिप पूर्व-लेपित हो ( सामग्री की तालिका देखें)।
    7. कोशिकाओं को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफायर 5% सीओ2 के साथ इनक्यूबेटर में विकसित करें ताकि कोशिकाओं को कवरस्लिप से जुड़ने की अनुमति मिल सके।
    8. 20x उद्देश्य के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं के लगाव की जांच करें। आगे बढ़ने से पहले कोशिकाओं को पूरी तरह से कवरस्लिप से जोड़ा जाना चाहिए।
  2. स्टॉक समाधान तैयार करना
    1. TMRE (MW = 514.96 g/mol) का 1 mM स्टॉक समाधान (1,000x) तैयार करने के लिए ( सामग्री की तालिका देखें), DMSO के 1.94 mL में 1 mg TMRE घोलें। प्रकाश से संरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट और स्टोर। बार-बार फ्रीज / पिघलने चक्र से बचें।
    2. एफसीसीपी (एमडब्ल्यू = 254.17 ग्राम / मोल) (माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन अनकपलर) के 50 एमएम (2,500 एक्स) स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, डीएमएसओ के 786.9 μL में 10 मिलीग्राम एफसीसीपी को घोलें। प्रकाश से संरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट और स्टोर। बार-बार फ्रीज / पिघलने चक्र से बचें।
    3. नोट: तैयार स्टॉक समाधान टीएमआरई माइटोकॉन्ड्रियल मेम्ब्रेन पोटेंशियल परख किट का हिस्सा हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. सेल लाइनों के लिए टीएमआरई एकाग्रता स्थापित करना
    1. सेल कल्चर माध्यम में 500 एनएम काम करने वाला टीएमआरई समाधान तैयार करें। काम करने वाले समाधान को प्रकाश से बचाएं।
    2. मध्यम से 50-200 एनएम के बीच अंतिम एकाग्रता सीमा में कवरलिप्स पर उगाई गई कोशिकाओं में टीएमआरई जोड़ें। ऐसा पहले संस्कृति माध्यम को हटाकर और इसे टीएमआरई युक्त संस्कृति माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करके करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इमेजिंग की अनुमति देने के लिए उपचार के समय को स्थिर करना सुनिश्चित करें, क्योंकि कोशिकाओं को लाइव देखा जाता है।
    4. कोशिकाओं को 1x PBS के साथ दो बार धोएं, और अंतिम TMRE एकाग्रता के साथ लेबल किए गए माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कवरस्लिप को उल्टा करें।
    5. तुरंत जीवित कोशिकाओं की छवि बनाएं (पीक ईएक्स / ईएम = 549 एनएम / 575 एनएम)।
      नोट: संस्कृति की स्थिति से हटाए जाने के बाद तुरंत नमूने की छवि बनाएं, क्योंकि कोशिकाओं को माध्यम से हटाने और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखने के बाद माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य से समझौता किया जाता है। कवरलिप्स के विकल्प के रूप में, कोशिकाओं को ग्लास-बॉटम व्यंजनों में चित्रित किया जा सकता है।
    6. उपलब्ध माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करें।
      नोट: टीएमआरई एकाग्रता अनुकूलन प्रक्रिया के दौरान प्रयोगात्मक माइक्रोस्कोपी इमेजिंग पैरामीटर स्थापित करें, और सटीक डेटा तुलना सुनिश्चित करने के लिए बाद के प्रयोगों में समान स्थितियों को बनाए रखें। प्रोटोकॉल ने एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और संगत सॉफ्टवेयर को नियोजित किया ( सामग्री की तालिका देखें)।
    7. इष्टतम टीएमआरई एकाग्रता का चयन करें, जो सेल लाइन-निर्भर है।
      नोट: टीएमआरई एकाग्रता जो माइटोकॉन्ड्रियल टीएमआरई स्तरों में परिवर्तन को हल करने के लिए सबसे अच्छा संकेत प्रदान करती है, आमतौर पर सबसे कम टीएमआरई एकाग्रता होती है, जो एक समान और आसानी से पता लगाने योग्य प्रतिदीप्ति संकेत देती है।
  4. एक सेल की ध्रुवीकृत स्थिति का परीक्षण
    1. परख की तैयारी
      1. वांछित सांद्रता पर उपचार स्टॉक समाधान तैयार करें, और परख के लिए अंतिम यौगिक एकाग्रता के साथ मीडिया तैयार करें। एफसीसीपी के लिए, स्टॉक समाधान 20 एमएम होना चाहिए (50 एमएम स्टॉक समाधान से डीएमएसओ के साथ तैयार)।
      2. एक समय में एकल कवरस्लिप पर काम करते हुए, कोशिकाओं में 1.8 एमएल मध्यम और परीक्षण यौगिक जोड़ें।
      3. वांछित अवधि के लिए एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर परीक्षण यौगिक के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
        नोट: उपचार का समय उस तंत्र के आधार पर भिन्न होगा जिसके द्वारा परीक्षण यौगिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को बदल सकता है। एफसीसीपी जैसे शक्तिशाली प्रोटोनोफोर जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को तेजी से और सीधे विध्रुवित करते हैं, उन्हें उपचार के तुरंत बाद (मिनटों के भीतर) विश्लेषण की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, यौगिकों के साथ उपचार प्रभाव जो अप्रत्यक्ष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला समारोह को प्रभावित करते हैं, जैसे कि जो प्रोटीन सक्रियण या प्रोटीन टर्नओवर को बदलते हैं या प्रोटीन संश्लेषण की आवश्यकता होती है, प्रभाव दिखाने में अधिक समय लग सकता है।
      4. इनक्यूबेशन दौरान, माइक्रोस्कोप चालू करें, और इसे पूर्व निर्धारित इष्टतम इमेजिंग मापदंडों पर सेट करें, जिसमें लाभ, लेजर तीव्रता, छवि कैप्चर दर, औसत और एक्सपोज़र समय शामिल हैं।
      5. दवा उपचार अवधि के बाद, नियंत्रण और दवा-उपचारित कोशिकाओं में 10x TMRE (ऊपर निर्धारित इष्टतम एकाग्रता) के 200 μL जोड़ें।
      6. एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। धीरे से माध्यम को एस्पिरेट करें, और 1x पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्ला करें।
      7. सेल कल्चर माध्यम या उपचार यौगिकों के कारण पृष्ठभूमि से बचने के लिए 1x पीबीएस कुल्ला चरण दोहराएं, और उपचार स्थितियों के साथ लेबल किए गए माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कवरस्लिप को उल्टा करें।
      8. छवि कोशिकाएं Ex/Em = 549 nm/575 nm पर रहती हैं। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सेल अखंडता के नुकसान से पहले उच्च गति छवि कैप्चर (512 पिक्सेल x 512 पिक्सेल, औसत = 4) के साथ कई जेड-स्टैक फ़ील्ड एकत्र करें।
      9. विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइल सहेजें और संग्रहीत करें। प्रक्रिया अगली प्रयोगात्मक स्थिति के लिए दोहराई जाती है।
    2. प्रायोगिक नियंत्रण
      1. ऊपर उल्लिखित (चरण 3.1.1-3.1.8) के रूप में किए गए नो-ट्रीटमेंट (नकारात्मक) नियंत्रण का उपयोग करें, जिसमें माध्यम में परीक्षण यौगिक की कमी है।
      2. प्रोटोनोफोर यौगिक एफसीसीपी से युक्त माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित व्यवधान (सकारात्मक) नियंत्रण का उपयोग करें। कोशिकाओं में माध्यम में 20 μM FCCP ( सामग्री की तालिका देखें) के 1.8 मिलीलीटर जोड़ें। जैसा कि ऊपर वर्णित है (चरण 3.1.1-3.1.2; और सेल इमेजिंग, जैसा कि चरण 3.1.3-3.1.8 में उल्लिखित है), टीएमआरई के साथ धुंधला होने से पहले एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
        नोट: इन प्रयोगों के लिए सकारात्मक और नकारात्मक दोनों नियंत्रण ों की आवश्यकता होती है।
    3. प्रमात्रीकरण
      1. प्रत्येक जेड-स्टैक के मध्य क्षेत्र से एकल प्रतिनिधि छवि से व्यक्तिगत कोशिकाओं की कैप्चर की गई पिक्सेल तीव्रता को मापें। इस काम में, विश्लेषण की सुविधा के लिए फोकस के एक एकल विमान का चयन किया गया था।
      2. प्रति उपचार कम से कम 30 कोशिकाओं (उनकी संपूर्णता में) से पिक्सेल तीव्रता का विश्लेषण करें। प्रत्येक उपचार के लिए पिक्सेल तीव्रता को औसत करने के लिए एक्सेल या प्रिज्म का उपयोग करें, और माध्य की मानक त्रुटि के साथ बार ग्राफ प्रारूप में मौजूद हों।
        नोट: प्रतिदीप्ति परिमाणीकरण के लिए इमेजजे का भी उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, टीएमआरई धुंधला प्रतिदीप्ति को वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों के साथ परिमाणित किया जा सकता है।

3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करआयन चैनल फ़ंक्शन की स्थापना

नोट: इस खंड में प्रक्रिया एक कैंसर सेल लाइन (चित्रा 3) में परीक्षण यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए एक स्वचालित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी परख के उपयोग का वर्णन करती है।

  1. कोशिकाओं को तैयार करना
    1. एक स्वस्थ संस्कृति से कोशिकाओं की कटाई करें जिसमें मृत कोशिकाओं और / या सेल अतिवृद्धि की कमी होती है। अनुगामी और क्लस्टर कोशिकाओं की कटाई के लिए या तो रासायनिक सेल डिटेचमेंट समाधान ट्राइप्ले या मैनुअल सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। कोशिकाओं को अलग करना जो झुरमुट या गोले में बढ़ते हैं, जो विशेष रूप से सीएनएस कैंसर कोशिकाओं के बीच आम हैं।
      नोट: कोशिकाओं का कोमल पृथक्करण आयन चालकता के लिए आवश्यक झिल्ली प्रोटीन की अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है।
    2. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और डीएमईएम (फिनोल लाल के बिना), एचईपीईएस और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन में 20% एफबीएस और 4 एमएम एल-ग्लूटामाइन (सामग्री की तालिका देखें) के साथ गोली को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
      नोट: फिनोल लाल की कमी वाले डीएमईएम माध्यम का उपयोग किया जाता है क्योंकि फिनोल लाल एक्सपोजर झिल्ली पारगम्यता को रोकता है।
    3. कोशिकाओं को कम घनत्व पर पॉली-एल-लाइसिन-लेपित कवरस्लिप पर प्लेट करें, इसलिए एकल कोशिकाओं के बीच अलगाव होता है।
      नोट: पॉली-एल-लाइसिन का उपयोग यहां किया जाता है, न कि पॉली-डी-लाइसिन का, क्योंकि पॉली-एल-लाइसिन में बेहतर कोटिंग गुण होते हैं।
    4. रिकॉर्डिंग लेने से पहले 12 घंटे से 24 घंटे (एक इष्टतम समय स्थापित करने की आवश्यकता होगी) के लिए एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग
    1. माध्यम को कवरलिप्स से हटा दें। धीरे से 1x PBS के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं। TrypLE समाधान के ~ 300 μL जोड़ें। पिपेट का उपयोग करके, कोशिकाओं को अलग होने तक धीरे-धीरे चार से पांच बार ऊपर/नीचे पिपेट करें।
    2. सीरम-मुक्त माध्यम (डीएमईएम) (फिनोल लाल-मुक्त) जोड़ें, और कम से कम 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल की प्रति मात्रा में अंतिम सेल गिनती बनाए रखें। 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, सेल क्लस्टर की कमी वाले सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को अव्यवस्थित करें।
    3. सेल निलंबन को 1 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिका झिल्ली को स्थिर करने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। सेल क्लंप के गठन से बचने के लिए कोशिकाओं को शेकर (कोमल चक्र) पर घुमाते रहें।
    4. पोर्ट-ए-पैच सेटअप तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। कंप्यूटर, एम्पलीफायर और छिड़काव प्रणाली चालू करें। पैच-मास्टर सॉफ़्टवेयर खोलें, और एक नई फ़ाइल बनाएँ।
    5. बफर (बाह्य और आंतरिक) को आरटी में लाएं, और फिर बफर को संबंधित छिड़काव ट्यूबों में लोड करें।
      नोट: जीएबीएए रिसेप्टर की रिकॉर्डिंग के लिए "बाह्य (स्नान) समाधान" दोनों की आवश्यकता होती है जिसमें 161 एमएम एनएसीएल, 3 एमएम केसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल 2, 1.5 एमएम सीएसीएल 2, 10 एमएम एचईपीईएस और 6 एमएम डी-ग्लूकोज (एनएओएच का उपयोग करके 7.4 में समायोजित पीएच) और 120 एमएम केसीएल, 2 एमएम एमजीसीएल 2, 10 एमएम ईजीटीए युक्त "आंतरिक समाधान" होता है। और 10 mM HEPES (NaOH का उपयोग करके पीएच को 7.2 में समायोजित किया गया)।
    6. 5 μL आंतरिक समाधान के साथ एक इलेक्ट्रोड चिप (निर्माता-प्रदान) के निचले भाग को भरें, और पोर्ट-ए-पैच के फैराडे शीर्ष पर इलेक्ट्रोड चिप रखें। चिप में बाहरी घोल के 10 μL जोड़ें, और पैच-मास्टर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ऑसिलोस्कोप पर आयताकार पल्स का निरीक्षण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: प्रतिरोध 2-3 मीटर की सीमा में हो सकता है, लेकिन यह सेल लाइन-निर्भर है।
    7. प्रारंभिक इलेक्ट्रॉनिक समायोजन के बाद, और सॉफ़्टवेयर द्वारा उपयोगकर्ता को कोशिकाओं को जोड़ने के लिए संकेत देने के बाद, आयताकार पल्स दिखाई देने के बाद रिकॉर्डिंग शुरू करें।
    8. धीरे से इलेक्ट्रोड के मध्य भाग पर एकल-सेल निलंबन के 20 μL जोड़ें, और सॉफ्टवेयर में प्रतिरोध मूल्यों को देखकर गिगा-ओम सील के बाद सेल पैच की प्रतीक्षा करें।
    9. सेल पैचिंग की लाइव प्रगति सॉफ्टवेयर के बाएं कॉलम पर देखी जा सकती है। एक बार जब सेल "पूरे सेल मोड में बनाए रखा जाता है", तो सॉफ्टवेयर के भीतर एक प्रोटोकॉल खोलकर रिकॉर्डिंग शुरू करें।
    10. होल्डिंग क्षमता को -80 एमवी पर सेट करें। सेल से वर्तमान रिकॉर्ड करने के लिए पैच-मास्टर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक अंतराल-मुक्त निरंतर रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल चलाएं।
    11. एक स्थिर आधार रेखा प्राप्त करें, और सॉफ़्टवेयर के बाएं पैनल पर स्वचालित छिड़काव टैब का उपयोग करके एक निर्दिष्ट अवधि के लिए एक लिगैंड और संबंधित यौगिक अनुप्रयोग पर स्विच करें।
    12. पैच-मास्टर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा प्राप्त करें।
      नोट: डेटा 1 kHz पर कम-पास फ़िल्टर किया जाता है और 100 kHz पर डिजिटलीकृत किया जाता है।
    13. नेस्ट-ओ-पैच सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वर्तमान प्रतिक्रिया के अधिकतम आयाम की गणना करके डेटा विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

4. इन विट्रो शक्ति

नोट: यह प्रक्रिया दवा शक्ति निर्धारित करने के लिए एक एमटीएस परख का विवरण देती है। वन सॉल्यूशन सेल प्रसार परख सभी आवश्यक परख अभिकर्मकों को एक तैयार समाधान में जोड़ती है जिसे प्रयोगात्मक यौगिकों के साथ उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता और प्रसार का आकलन करने के लिए सेल कल्चर कुओं में एक चरण में जोड़ा जा सकता है। अभिकर्मक को निर्माता की सिफारिशों के अनुसार पुनर्गठित किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें), अलीउद्धृत किया जाता है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। खंड एक विशेष सेल लाइन (चित्रा 4) में परीक्षण यौगिकों के आईसी50 को निर्धारित करने के लिए परख के उपयोग का वर्णन करता है। इस एमटीएस अभिकर्मक का उपयोग ज्ञात सांद्रता पर बड़ी संख्या में यौगिकों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए भी किया जा सकता है।

  1. कोशिकाओं को तैयार करना
    नोट: सेल संख्या प्रत्येक व्यक्तिगत सेल लाइन के विकास और चयापचय पर निर्भर करती है। किसी भी जांच उपचार का मूल्यांकन करने के लिए परख का उपयोग करने से पहले प्रयोगात्मक रूप से इष्टतम सेल संख्या निर्धारित करें।
    1. ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा संस्कृति से अनुयायी कोशिकाओं की कटाई करें, और झुरमुट या गोले में बढ़ने वाली कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक्यूटेस ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
      नोट: ग्लियोब्लास्टोमा और प्राथमिक मेडुलोब्लास्टोमा सेल लाइनों को अक्सर एक्यूटेस की आवश्यकता होती है क्योंकि वे झुरमुट या गोले में बढ़ते हैं।
    2. कोशिकाओं की गणना करें, और 75 μL मात्रा में प्रति अच्छी तरह से 10,000 कोशिकाओं के साथ एक सेल समाधान बनाएं। परीक्षण किए जाने वाले सेल नंबरों के लिए स्टॉक को कमजोर करें। प्रति तनुकरण कम से कम 1 एमएल तैयार करें।
    3. प्लेट 75 μL प्रत्येक तनुकरण को 96-वेल प्लेट में लगातार पांच कुओं के सेट में विभाजित करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रात भर एक ह्यूमिडिफायर वातावरण (यानी, एक इनक्यूबेटर) में इनक्यूबेट करें।
      नोट: धीमी वृद्धि या चयापचय वाली सेल लाइनें (जो 3 दिनों से अधिक समय में अपने विकास माध्यम को अम्लीय करती हैं) को ऊपरी सेल संख्या सीमा के रूप में 10,000 से अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता हो सकती है, जबकि सेल लाइनें जो तेजी से बढ़ती हैं (आमतौर पर 20 घंटे के दोगुने समय से तेज) को कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। उच्च चयापचय वाली सेल लाइनों को प्रति कुएं 1,000 से कम कोशिकाओं की आवश्यकता हो सकती है। इन सेल लाइनों के लिए एमटीएस परख के लिए इष्टतम प्लेटिंग घनत्व निर्धारित करने के लिए सेल रेंज को समायोजित किया जा सकता है।
  2. नकली उपचार नियंत्रण
    1. एमटीएस परख में परीक्षण यौगिक के अतिरिक्त अनुकरण करने के लिए प्रति कुएं 25 μL मध्यम जोड़ें।
      नोट: वास्तविक एमटीएस परख में, परीक्षण यौगिक के लिए चुने गए उपचार एकाग्रता के 4x स्टॉक के 25 μL (यहां एक GABAA रिसेप्टर मॉड्यूलेटर, QH-II-066) को कोशिकाओं में जोड़ा जाएगा ताकि प्रति कुएं 100 μL की कुल मात्रा में 1x अंतिम उपचार एकाग्रता दी जा सके।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 48 घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में इनक्यूबेट करें। यह एक दवा की उपस्थिति में मानक इनक्यूबेशन अनुकरण करता है।
  3. एमटीएस परख
    1. एमटीएस अभिकर्मक के आवश्यक एलिकोट को पिघलाएं। प्रति अच्छी तरह से एमटीएस अभिकर्मक के 20 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1 घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में इनक्यूबेट करें।
    2. बुलबुले को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट (5 मिनट के लिए 1,350 x g ) को सेंट्रीफ्यूज करें, जो अवशोषण रीडिंग में हस्तक्षेप कर सकता है।
      नोट: एक ठीक-गेज सुई के साथ किसी भी बुलबुले को हटा दें।
    3. 490 एनएम पर अवशोषण पढ़ें। डेटा को Excel फ़ाइल के रूप में सहेजें.
    4. प्लेटों को 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस करें, और परख के 4 घंटे रैखिक सीमा अवधि के भीतर बार-बार पढ़ें।
      नोट: अवशोषण को पढ़ने से पहले फिर से सेंट्रीफ्यूज करने की आवश्यकता नहीं है। बाद की रीडिंग से डेटा, विशेष रूप से 2 एच रीडिंग, यह जांचने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है कि सेल लाइन एमटीएस अभिकर्मक को कितनी तेजी से चयापचय करती है और परख के लिए प्लेट में कोशिकाओं की संख्या का चयन करने में उपयोगी होती है।
    5. एक्सेल या प्रिज्म का उपयोग करके प्लेटेड सेल नंबर के मुकाबले 490 एनएम (ओडी490) पर अवशोषण ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को प्लॉट करें।
    6. परख के लिए सेल नंबर का चयन करें। कोशिकाओं की इष्टतम संख्या रैखिक सीमा में और संतृप्ति से नीचे होगी (ओडी490 = 1)।
      नोट: धीमी वृद्धि वाली कोशिकाओं के लिए, उच्चतम सेल नंबर प्लेटेड को प्रति कुएं 20,000 कोशिकाओं में समायोजित किया जा सकता है, और प्रति कुएं 500 कोशिकाओं को परख से बाहर रखा जा सकता है।
  4. आईसी का निर्धारण50
    1. दिन 1: एमटीएस परख के लिए कोशिकाओं को प्लेट करें।
      1. अध्ययन में प्रत्येक पंक्ति के सेल लाइन नाम और मार्ग संख्या को रिकॉर्ड करें। परख के दौरान वाष्पीकरण का मुकाबला करने के लिए, कम से कम, परख के दौरान वाष्पीकरण का मुकाबला करने के लिए 96-वेल प्लेट के बाहरी परिधि शीर्ष और नीचे की पंक्तियों और अंत बाएं और दाएं परिधि कॉलम को 1x पीबीएस, 100 μL प्रति कुएं से भरें।
      2. परख की शुरुआत से पहले निर्धारित प्रत्येक सेल लाइन के लिए कोशिकाओं की इष्टतम संख्या को प्लेट करें। कोशिकाओं को फिनोल लाल-मुक्त, एंटीबायोटिक-मुक्त माध्यम के प्रति कुएं में 75 μL में प्लेट करें जिसमें एचईपीईएस बफर नहीं होता है। सेल लाइनों के विकास का समर्थन करने के लिए एफबीएस को 20% तक बढ़ाया जा सकता है।
        नोट: फिनोल लाल की कमी वाले माध्यम का उपयोग किया जाता है क्योंकि फिनोल लाल जोखिम झिल्ली पारगम्यता को रोकता है।
      3. उपचार एकाग्रता के लिए नमूने को कम से कम क्विंटुप्लिकेट में प्लेट करें। मैनुअल या स्वचालित हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
        नोट: मैनुअल हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करने के लिए, (1) ट्राइपैन ब्लू में माध्यम में पुन: निलंबित कोशिकाओं का 1: 1 कमजोर पड़ने की तैयारी करें; (2) सेल लाइन के आधार पर 5-15 मिनट इनक्यूबेट करें; (3) हेमोसाइटोमीटर गिनती कक्ष में ट्राइपैन ब्लू में कोशिकाओं के 10 μL लोड करें; (4) चार कोनों और मध्य वर्गों में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें, और प्रति वर्ग कोशिकाओं की औसत संख्या निर्धारित करें; (5) प्रति मिलीलीटर व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना निम्नानुसार करें:
        प्रति एमएल व्यवहार्य कोशिकाएं = औसत व्यवहार्य कोशिकाएं × 2 (कमजोर पड़ने का कारक) × 104
      4. फिनोल लाल-मुक्त, एंटीबायोटिक-मुक्त माध्यम में कोशिकाओं की वांछित एकाग्रता तैयार करने के लिए पर्याप्त मात्रा का उपयोग करें जिसमें एचईपीईएस बफर नहीं होता है (यानी, 75 μL प्रति कुएं x 60 कुएं प्रति प्लेट = 4.5 एमएल कोशिकाएं प्रति प्लेट)।
        नोट: प्रत्येक प्लेट को पृष्ठभूमि घटाव के लिए एक मध्यम-केवल नियंत्रण की आवश्यकता होती है। यदि आवश्यक हो तो मध्यम नियंत्रण पीबीएस कुओं को प्रतिस्थापित कर सकता है।
    2. दिन 2: उपचार यौगिक जोड़ना
      1. वांछित अंतिम एकाग्रता देने के लिए वांछित अंतिम एकाग्रता देने के लिए 4x पर प्रयोग उपचार तैयार करें जब 25 μL उपचार समाधान ों को 75 μL माध्यम (= 100 μL प्रति अच्छी तरह से कुल मात्रा) में चढ़ाई गई कोशिकाओं में जोड़ा जाता है।
      2. उच्चतम सांद्रता वाले शेयरों के क्रमिक कमजोर पड़ने से परीक्षण समाधान (इस मामले में, जीएबीएए रिसेप्टर मॉड्यूलेटर क्यूएच -2 -066) तैयार करें। उदाहरण के लिए, यदि अंतिम दवा सांद्रता 5.0 μM, 2.5 μM, 1.25 μM, 0.625 μM, और 0.3125 μM होनी है, तो क्रमशः 10 μM, 5 μM, 2.5 μM और 1.25 μM सांद्रता प्राप्त करने के लिए 20 μM से शुरू होने वाले 1: 1 सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
        नोट: प्रत्येक प्लेट को मध्यम-केवल नियंत्रण के अलावा दो सेल-आधारित नियंत्रणों की आवश्यकता होती है: अनुपचारित कोशिकाएं (अकेले माध्यम) और ज्ञात एकाग्रता पर सेल विलायक-उपचारित (अक्सर डीएमएसओ)। यह सुनिश्चित करना अच्छा अभ्यास है कि वाहन यौगिक की सक्रिय सीमा में सेल प्रसार को प्रभावित नहीं करता है।
      3. एक बार परीक्षण यौगिक जोड़ने के बाद, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 48 घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में इनक्यूबेट करें।
    3. दिन 3: सेल प्रसार परख (एमटीएस) का प्रदर्शन
      1. आवश्यक एमटीएस अभिकर्मक की मात्रा की गणना करें (परीक्षण संस्कृति के प्रति 100 μL 20 μL), और एलिकोट एमटीएस अभिकर्मक की आवश्यक मात्रा को पिघलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
      2. भंवर, और सुनिश्चित करें कि अभिकर्मक उपयोग से पहले पूरी तरह से समाधान में है। पिघले हुए अभिकर्मक को एक बाँझ 25 एमएल अभिकर्मक जलाशय में डालें।
      3. 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में एमटीएस अभिकर्मक के पिपेट 20 μL (एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके) जिसमें 100 μL कल्चर माध्यम में नमूने होते हैं।
      4. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1 घंटे से 4 घंटे के लिए ह्यूमिडिफायर वातावरण में इनक्यूबेट करें। प्लेटों को कई समय बिंदुओं पर पढ़ा जा सकता है। आम तौर पर, प्लेटों को 1 घंटे और 2 घंटे या 3 घंटे पर पढ़ा जाता है।
      5. माध्यम में बुलबुले गलत परिणाम पैदा कर सकते हैं। प्लेट रीडर में पढ़ने से पहले, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए प्लेट को 1,350 x g पर स्पिन करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद बने रहने वाले किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए एक सुई या एक पिपेट टिप का उपयोग किया जा सकता है।
      6. एक उपयुक्त माइक्रोप्लेट रीडर या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 490 एनएम पर अवशोषण को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      7. डेटा को Excel फ़ाइल के रूप में सहेजें.
        नोट: परीक्षण यौगिक की उपस्थिति में इनक्यूबेशन समय चयापचय की दर और अध्ययन के तहत सेल लाइन के विकास के आधार पर अलग-अलग होगा, इसके अलावा यौगिक का परीक्षण किया जा रहा है। 48 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि अधिकांश सेल लाइनों और परीक्षण यौगिकों के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है।
  5. डेटा विश्लेषण
    1. डेटा को एक्सेल फ़ाइल में स्थानांतरित करें, और परीक्षण यौगिक एकाग्रता बढ़ाकर प्रत्येक प्रतिकृति के लिए डेटा को व्यवस्थित करें। मध्यम-केवल नियंत्रण मान को औसत करें, और प्रयोगात्मक डेटा से इस मान को घटाएं।
    2. प्रत्येक प्रतिकृति के लिए 100% प्रसार पर नियंत्रण स्थापित करके वाहन कुओं (या विलायक-उपचारित नियंत्रण कुओं) की तुलना में उपचार कुओं में सेल प्रसार का प्रतिशत निर्धारित करें।
    3. Excel में उत्पन्न डेटा को अपनी पसंद के प्रोग्राम में स्थानांतरित करें. लेखक आम तौर पर दवा एकाग्रता निर्धारित करने के लिए प्रिज्म सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करते हैं जो सेल प्रसार को 50% (आईसी50) तक रोकता है।
    4. प्रिज्म सॉफ़्टवेयर में, सेल नंबर के रूप में एक्स-कॉलम और साइड-बाय-साइड सब-कॉलम में पांच प्रतिकृति मानों के लिए औसत ओडी के रूप में वाई-कॉलम के साथ एक डेटा टेबल बनाएं।
    5. दवा उपचार का विश्लेषण करते समय एक्स कॉलम में उपचार एकाग्रता मान दर्ज करें। उपचार यौगिक नाम और एकाग्रता इकाइयों के साथ एक्स-अक्ष लेबल करें।
    6. Excel विश्लेषण से परिकलित प्रतिकृति कक्ष व्यवहार्यता मान Y उप-स्तंभों में दर्ज करें. वाई-अक्ष को सेल प्रसार (%) के रूप में लेबल करें।
    7. विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके, XY विश्लेषण के तहत गैर-रैखिक प्रतिगमन (वक्र फिट) का चयन करें।
    8. खुराक-प्रतिक्रिया [निषेध] बनाम सामान्यीकृत प्रतिक्रिया-परिवर्तनीय ढलान का चयन करें।
    9. विश्लेषण फ़ंक्शन निष्पादित करें। IC50 के लिए परिकलित सर्वश्रेष्ठ-फिट मान और वक्र फिट ग्राफ़ देखने के लिए परिणाम तालिका देखें. यदि वांछित हो तो ग्राफ ़ के एक्स-अक्ष को लॉग स्केल में बदला जा सकता है।

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Representative Results

ऊपर चुनिंदा प्रक्रियाएं हैं जिन्हें कैंसर कोशिकाओं में आयन चैनलों को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। पहला प्रोटोकॉल एक आयन चैनल के धुंधला होने पर प्रकाश डालता है। जैसा कि विस्तृत है, आयन चैनल को धुंधला करते समय या उस मामले के लिए, कोई भी प्रोटीन जो बाह्य झिल्ली में मौजूद होता है, कई चुनौतियां होती हैं। चित्रा 1 में दिखाया गया पेंटामेरिक जीएबीएए रिसेप्टर के सबयूनिट के लिए धुंधलापन है। दूसरा प्रोटोकॉल कैंसर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया की ध्रुवीकृत स्थिति के परीक्षण के परिणामों पर प्रकाश डालता है। माइटोकॉन्ड्रिया सेल व्यवहार्यता और प्रसार, साथ ही कोशिका मृत्यु के लिए आवश्यक भूमिका निभाते हैं। स्तनधारी कोशिकाओं में, माइटोकॉन्ड्रिया माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक और बाहरी झिल्ली के बीच पाए जाने वाले बीसीएल -2 परिवार प्रोटीन की रिहाई के माध्यम से सेलुलर तनाव के जवाब में एपोप्टोसिस को सक्रिय करते हैं। साइटोसोल में, बीसीएल -2 परिवार प्रोटीन कैसपेस प्रोटीज को सक्रिय करते हैं, जो क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का मध्यस्थता करते हैं। प्लाज्मा झिल्ली आयन चैनल फ़ंक्शन में परिवर्तन के परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर आयन होमियोस्टैसिस का विघटन हो सकता है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर आयन स्तर शामिल हैं, जिससे झिल्ली क्षमता का नुकसान हो सकता है, इस प्रकार एपोप्टोसिस14 को ट्रिगर किया जा सकता है। सीए2 +, के +, एनए + और एच + के स्तर सिग्नलिंग घटनाओं में महत्वपूर्ण निर्धारक हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल-शुरू की गई कोशिका मृत्यु को ट्रिगर कर सकते हैं। चित्रा 2 में दिखाया गया है कि सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया में झिल्ली क्षमता को लेबल और छवि बनाने के लिए सेल-पारगम्य, सकारात्मक रूप से चार्ज डाई टीएमआरई के साथ धुंधला हो रहा है, जो नकारात्मक चार्ज21,22 बनाए रखता है। टीएमआरई एक लाल-नारंगी डाई है जो उनके सापेक्ष नकारात्मक चार्ज के कारण सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया के साथ बांधता है। विध्रुवीकृत या निष्क्रिय माइटोकॉन्ड्रिया ने झिल्ली क्षमता को कम कर दिया है और इस प्रकार, टीएमआरई को अनुक्रमित करने में विफल रहता है। इस प्रयोग में, आयोनोफोर अनकपलर एफसीसीपी एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है, क्योंकि यह माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को विध्रुवित करता है, जिससे टीएमआरई23 के संचय को रोका जा सकता है। तीसरा प्रोटोकॉल एकल-सेल पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर प्रकाश डालता है। चित्रा 3 में दिखाया गया रोगी-व्युत्पन्न मेडुलोब्लास्टोमा सेल लाइन डी 283 से रिकॉर्ड किए गए एक निशान की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग हैं। अंत में, चौथा प्रोटोकॉल कैंसर कोशिकाओं के प्रसार की स्थिति निर्धारित करने के लिए एक परख पर प्रकाश डालता है। चित्रा 4 में दिखाया गया है कि एमटीएस परख कैसे काम करती है और प्लेट और रीडआउट का एक चित्रण है जब एक एजेंट के साथ इनक्यूबेट किया जाता है जो अध्ययन के तहत कैंसर कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बाधित करता है (इस मामले में, डीएओवाई)।

Figure 1
चित्र 1: आयन चैनलों के लिए धुंधला कोशिकाएं। (ए) डी 283 मेडुलोब्लास्टोमा कैंसर कोशिकाओं में जीएबीए ए रिसेप्टर के एक सबयूनिट प्रोटीन गैबरा 5 का धुंधला होना। (बी) फ्लोरोसेंट स्टेन 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) के साथ इलाज की जाने वाली निश्चित कोशिकाएं, जो डीएनए को बांधती हैं। (सी) गैबरा 5 और डीएपीआई दोनों के लिए दागदार मेडुलोब्लास्टोमा कैंसर कोशिकाओं का विलय। स्केल सलाखों = 10 μm. यह आंकड़ा कल्ले एट अल.14 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माइटोकॉन्ड्रिया की ध्रुवीकृत स्थिति का परीक्षण। (ए) लाइव डी 283 मेडुलोब्लास्टोमा कैंसर कोशिकाओं को दवा क्यूएच -2-066 की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया जाता है। कोशिकाओं को तब सकारात्मक रूप से चार्ज, सेल-पारगम्य टीएमआरई (टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर) के साथ इलाज किया जाता है, जो सक्रिय (नकारात्मक रूप से चार्ज) माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होता है। विध्रुवीकृत या निष्क्रिय माइटोकॉन्ड्रिया ने झिल्ली क्षमता को कम कर दिया है और इसलिए, टीएमआरई डाई को बनाए रखने में विफल रहता है; नतीजतन, वे कम प्रतिदीप्ति संकेत दिखाते हैं। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित; एफसीसीपी (कार्बोनिल साइनाइड 4-[ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी] फेनिलहाइड्राज़ोन)। पीक:एक्स, 549 एनएम; ईएम, 575 एनएम। स्केल बार = 10 μm. (B) सॉफ्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके TMRE धुंधला (पैनल A में दिखाए गए चित्र) का परिमाणीकरण। डेटा को माध्य की माध्य और मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। यह आंकड़ा कल्ले एट अल.14 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करके आयन चैनल फ़ंक्शन की स्थापना । (ए) दिखाया गया एक पोर्ट-ए-पैच सेटअप या रिग है, जिसमें फैराडे पिंजरे (ए), रिकॉर्डिंग कक्ष (बी), और सक्शन यूनिट (सी, दाएं) शामिल हैं। (बी) पोर्ट-ए-पैच रिग का शीर्ष दृश्य एक छिड़काव इनलेट (ए), आउटलेट (बी), और संदर्भ इलेक्ट्रोड (सी) से लैस रिकॉर्डिंग कक्ष को उजागर करता है। (ग) पोर्ट-ए-पैच प्रचालन और समाधान जलाशयों के स्वचालित और मैनुअल तरीकों के साथ एक तीव्र समाधान विनिमय छिड़काव प्रणाली से जुड़ा हुआ है। (डी) पोर्ट-ए-पैच रिग (एनियन) और डी 283 मेडुलोब्लास्टोमा कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करके पूरे सेल पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि वर्तमान ट्रेस। GABA (10 μM) को -80 mV की धारण क्षमता के साथ 5 s के लिए लागू किया गया था। (ई) पोर्ट-ए-पैच रिग (एनियन) और डी 283 मेडुलोब्लास्टोमा कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करके पूरे सेल पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि वर्तमान ट्रेस, जीएबीए (1 μM) और GABAA रिसेप्टर एगोनिस्ट (सामान्य एनेस्थेटिक) प्रोपोफोल (50 μM) के सह-अनुप्रयोग के साथ, जो अकेले GABA द्वारा प्रेरित वर्तमान को शक्तिशाली बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: दवा शक्ति का आकलन करने के लिए एमटीएस परख। (ए) "एमटीएस परख" को अंतर्निहित रासायनिक प्रतिक्रियाएं एक एजेंट की शक्ति का आकलन करने के लिए उपयोग की जाती हैं, जैसा कि सेल प्रसार में कमी से परिलक्षित होता है। कोशिकाओं द्वारा एमटीएस टेट्राज़ोलियम की कमी जो व्यवहार्य हैं, डाई फॉर्माज़न उत्पन्न करते हैं। (बी) एक 96-वेल प्लेट जो बढ़ती दवा सांद्रता के साथ एमटीएस परख के रंगीन परिणामों को दिखाती है। इस प्रयोग में, डीएओवाई मेडुलोब्लास्टोमा कैंसर कोशिकाओं को एक पूर्व-नैदानिक दवा, केआरएम-II-08 की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया जाता है, जो जीएबीएए रिसेप्टर का एक सकारात्मक एलोस्टेरिक मॉड्यूलेटर है। (सी) एमटीएस परख के साथ उत्पन्न एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र (96-वेल प्लेट के परिमाणीकरण से)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हस्तचालित अर्ध/पूरी तरह से स्वचालित
थ्रू-पुट नीचा उच्च
तेजी से समाधान विनिमय संभव हाँ
क़ीमत उच्च नीचा
संचालक अनुभवी शुरुआती/मध्यवर्ती
सेल का प्रकार सभी कोशिकाएं; ऊतकों प्राथमिक एकल कोशिकाएं; सेल लाइनें
सेल नंबर आवश्यक हैं कम से कम* उच्च*
दवा / समाधान की मात्रा उच्च नीचा
संसाधन/उपयोगिताएँ उच्च नीचा
अनुरक्षण उच्च नीचा
प्रयोग नियंत्रण बहुत अच्छा अच्छा
लाइव सेल इमेजिंग हाँ नहीं
* पोर्ट-ए-पैच, उदाहरण के लिए, रिकॉर्डिंग के लिए कम से कम एक मिलियन सेल / एमएल की आवश्यकता होती है, जबकि एक मैनुअल सेट-अप को आमतौर पर कवरस्लिप पर कुछ सौ कोशिकाओं की आवश्यकता होती है।

तालिका 1: मैनुअल बनाम अर्ध और / या पूरी तरह से स्वचालित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटअप की तुलना।

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Discussion

आयन चैनल फ़ंक्शन में परिवर्तन इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग कैस्केड को बदल देता है, जो सेल के समग्र कामकाज को प्रभावित कर सकता है। पिछले दशक में, यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि आयन चैनल कैंसर सेल के विकास और मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण हैं। महत्वपूर्ण रूप से, कई आयनचैनल विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला को लक्षित करने वाले अनुमोदित चिकित्सीय के लिए प्राथमिक लक्ष्य हैं। जांचकर्ताओं ने जांच की है कि क्या आयन चैनल कैंसर-रोधी लक्ष्य हो सकते हैं, और प्रारंभिक परिणामआशाजनक 2,16,25 हैं। क्षेत्र अभी कैंसर के विकास में और चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में आयन चैनलों की भूमिका की जांच करना शुरू कर रहा है, और भविष्य दोनों मोर्चों पर उज्ज्वल दिखता है।

इस काम में, कैंसर कोशिकाओं में आयन चैनलों का विश्लेषण करने और यह निर्धारित करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं प्रदान की जाती हैं कि क्या एक चैनल एक चिकित्सीय भेद्यता है। ये परख कैंसर कोशिकाओं में आयन चैनलों का अध्ययन करने में सहायता के लिए एक गाइड के रूप में काम करते हैं। विधियों का वर्णन किया गया है जो कैंसर कोशिकाओं में आयन चैनलों के विज़ुअलाइज़ेशन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, यह निर्धारित करना कि आयन चैनलों का मॉड्यूलेशन कैंसर कोशिकाओं की ध्रुवीकृत स्थिति को कैसे बदलता है, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करके आयन चैनल फ़ंक्शन का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण, और कैंसर सेल व्यवहार्यता का माप।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का उपयोग आयन चैनलों की उपस्थिति और सेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। प्रयोगात्मक स्थितियों को सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि सटीक रूप से प्रतिनिधित्व किया जा सके कि सेल के भीतर एक चैनल कहां पाया जाता है। सहज रूप से, कोई उम्मीद करेगा कि आयन चैनलों का धुंधलापन अपेक्षाकृत सीधा होगा, क्योंकि वे सबसे अधिक विलायक सुलभ हैं। हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस एपिटोप आसानी से सुलभ नहीं हो सकता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि यह एक बाह्य या इंट्रासेल्युलर डोमेन का हिस्सा है या नहीं। इसके अलावा, आयन चैनल अक्सर कोशिका झिल्ली पर घने क्लस्टर होते हैं, इसलिए इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा उनका पता लगाने के लिए प्रोटीन14,26 के अन्य वर्गों की तुलना में निर्धारण और परमेबिलाइजेशन प्रक्रियाओं के अधिक व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता कई माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़ी प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक है, जिसमें एटीपी संश्लेषण, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की पीढ़ी, कैल्शियम अनुक्रम, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का आयात, झिल्ली गतिशीलता और ट्रिगर एपोप्टोसिस शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल एकल कोशिकाओं में सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया में झिल्ली क्षमता को लेबल करने के लिए टीएमआरई परख का उपयोग करता है। उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन के लिए, टीएमआरई स्तर को माइक्रोप्लेट प्रारूप में फ्लोरेसेंस प्लेट के साथ मापा जा सकता है।

पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी आयन चैनल कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए "स्वर्ण मानक" विधि है। आयन चैनल मॉड्यूलेटर की संरचना-कार्य संबंधों और फार्माकोलॉजी को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए पूरे सेल और एकल-चैनल विधियां भी उच्चतम-रिज़ॉल्यूशन विधियां हैं। यह विधि आयन चैनल27 के माध्यम से आयनों की गति के कारण झिल्ली में छोटे विद्युत परिवर्तनों के अध्ययन का उपयोग करती है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग पारंपरिक रूप से एक समय में एकल सेल के मैनुअल पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग का उपयोग करके किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम-थ्रूपुट दृष्टिकोण होता है जिसके लिए उपयोगकर्ता को विशेष कौशल सेट की एक श्रृंखला रखने की आवश्यकता होती है। पोर्ट-ए-पैच, आयनफ्लक्स मर्करी, पैचलाइनर और / या सिंक्रोपैच प्रौद्योगिकियों जैसी स्वचालित पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक, एक समय में कई रिकॉर्डिंग प्रदान करती हैं, और ये तकनीकयौगिक अनुप्रयोग के लिए एक परिष्कृत छिड़काव सेटअप से लैस हैं, जिसके परिणामस्वरूप विशेष कौशल की आवश्यकता के बिना अर्ध-उच्च थ्रूपुट या उच्च थ्रूपुट होता है। कुछ प्रयोगों के लिए, मैनुअल पैच क्लैंपिंग अपूरणीय है (तालिका 1)। फिर भी, स्वचालित पैच-क्लैंप तकनीक ने आयन चैनल बायोफिज़िक्स अनुसंधान और संबंधित दवा खोज कार्यक्रमों को गति दी है। गैर-संक्रमित कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग की सीमाओं में से एक रिसाव, गैर-विशिष्ट अंतर्जात धाराओं का योगदान है। हमारी रिकॉर्डिंग में, हमने मामूली आधारभूत भिन्नताओं को देखा, जो डी 283 कोशिकाओं से अंतर्जात धाराओं के संभावित योगदान का सुझाव देते हैं।

सेल प्रसार परख एक रासायनिक एजेंट के जवाब में सेल विकास गतिविधि के क्षोभ को मापते हैं। सेल प्रसार पर दवा की कार्रवाई का आकलन करने के लिए इस तरह के परख महत्वपूर्ण उपकरण हैं। सेल प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए, जांचकर्ता आमतौर पर एमटीटी (3-[4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल]-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड), एमटीएस (3-[4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल]-5-[3-कार्बोक्सीमेथॉक्सीफेनिल]-2-[4-सल्फोफिनाइल]-2एच-टेट्राज़ोलियम), और / या क्लोनोजेनिक परख का उपयोग करते हैं। एमटीटी और एमटीएस परख पानी में घुलनशील टेट्राज़ोलियम नमक (पीले) के रूपांतरण (कमी) को एक मात्रात्मक फॉर्माज़न उत्पाद (एमटीटी परख में बैंगनी) में मापते हैं, जो चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाओं के डिहाइड्रोजनेज एंजाइम प्रणाली द्वारा उत्प्रेरित होता है। रंगीन उत्पाद की तीव्रता "व्यवहार्य" (जैसे, चयापचय रूप से सक्रिय) कोशिकाओं की संख्या का अनुमान प्रदान करती है। इसके विपरीत, क्लोनोजेनिक परख एक दवा28,29 के साथ उपचार के बाद एक कॉलोनी (कम से कम 50 कोशिकाओं या छह क्रमिक विभाजनों) बनाने के लिए संस्कृति में एकल कोशिकाओं की क्षमता का विश्लेषण करती है। एमटीटी, एमटीएस और क्लोनोजेनिक परख प्रत्येक के फायदे और नुकसान हैं, और किसी को दिए गए सेल लाइन (एस) के साथ दवा (ओं) की शक्ति निर्धारित करने के लिए इन परखों की उपयुक्तता का सावधानीपूर्वक आकलन करना चाहिए। बेहतर रूप से, इनमें से एक से अधिक परखों (जैसे, क्लोनोजेनिक और एमटीटी या एमटीएस परख) का उपयोग करके दवा की शक्ति निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है।

एमटीटी और एमटीएस परख जीवित कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि का आकलन करते हैं, जो सेल प्रकार और परख की स्थिति से भिन्न हो सकते हैं। एमटीटी या एमटीएस परख फायदेमंद हैं, क्योंकि ये परख प्रदर्शन करना आसान है, प्रतिकृति में प्रदर्शन किया जा सकता है, और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग30 के लिए उत्तरदायी हैं। एमटीटी या एमटीएस परख 3-4 दिनों में पूरी की जा सकती है, जबकि क्लोनोजेनिक परख में 10-21 दिन लग सकते हैं, जो28 उपयोग की जाने वाली सेल लाइन की विशेषताओं पर निर्भर करता है। इसके विपरीत, एमटीएस और एमटीटी परख दोनों के नुकसान संस्कृति माध्यम के साथ परख करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों का संभावित हस्तक्षेप, परख का उपयोग करने में कठिनाई और सेल चयापचय स्थिति औरसंस्कृति स्थितियों के कारण प्रतिकृति के बीच संभावित परिवर्तनशीलता है। एमटीटी और एमटीएस परख के बीच चयन के बारे में, किसी को यह विचार करना चाहिए कि एमटीटी परख को कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक घुलनशीलता चरण की आवश्यकता होती है और फॉर्माज़न क्रिस्टल को माध्यम में घुलने की अनुमति देता है और 570 एनएम पर अवशोषण दिखाता है, जबकि एमटीएस परख एक "एक-चरण परख" है, जिसमें फॉर्माज़न को आंतरायिक चरणों के बिना सीधे माध्यम में घुलनशील किया जाता है (उदाहरण के लिए, सेल लाइसिस चरण)। एमटीएस परख में फॉर्माज़न उत्पाद रंग में गहरा होता है और इसमें अधिक संवेदनशील अवशोषण मूल्य सीमा (490-500 एनएम) होती है, इस प्रकार सकारात्मक प्रतिक्रिया का पता लगाना आसान हो जाता है। एमटीएस परख एमटीटी परख की तुलना में तेज है, क्योंकि प्रतिक्रिया के लिए 2-3 घंटे बनाम प्रतिक्रिया के लिए 4 घंटे और एमटीटी परख में 1-2 एच घुलनशीलता की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, एमटीएस परख फॉर्माज़न उत्पाद निलंबन में रहता है, और परख एमटीटी परख की तुलना में निलंबन कोशिकाओं के लिए अधिक उपयुक्त है, क्योंकि एमटीएस परख32 के दौरान किसी भी मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, एक संशोधित एमटीटी परख विकसित की गई है जिसमें डीएमएसओ और एसडीएस लाइसिस समाधान के संयोजन का उपयोग करके घुलनशीलता चरण में सुधार किया गया है। इस संशोधित एमटीटी परख का उपयोग अनुयायी और निलंबन कोशिकाओं दोनों के लिए किया जा सकता है। यदि कोई एमटीटी परख का उपयोग करने का विकल्प चुनता है, तो सेल कल्चर और सेल विकास के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियों / अभिकर्मकों का चयन करने में सावधानी बरतनी चाहिए। उदाहरण के लिए, परिणाम अलग-अलग होंगे यदि कोशिकाओं को एक मोनोलेयर के रूप में उगाया जाता है, विभेदित किया जाता है, एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर या सेनेसेंट के रूप में। इसके अलावा, कुछ गैर-माइटोकॉन्ड्रियल डिहाइड्रोजनेज, जैसे कुछ इंट्रासेल्युलर रिडक्टेस और फ्लेविन ऑक्सीडेज, एमटीटी अभिकर्मक को कम कर सकते हैं, संभवतः गलत-सकारात्मक रीडिंगप्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, एमटीटी अभिकर्मक में विषाक्तता की डिग्री होती है, इसलिए इनक्यूबेशन समय सीमित होना चाहिए। एमटीटी में कमी की दर संस्कृति की स्थिति के साथ भी बदल सकती है, जैसे कि माध्यम की पीएच और ग्लूकोज सामग्री और कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति32,34। उदाहरण के लिए, एस्कॉर्बिक एसिड की उपस्थिति कथित तौर पर एमटीटी को फॉर्माज़ान तक कम कर देती है, और यह प्रभाव रेटिनॉल35 की उपस्थिति में बढ़ाया जाता है। क्लोनोजेनिक परख के साथ संभावित मुद्दों के बारे में, यह जानना महत्वपूर्ण है कि दवा जोड़ने के बाद, कोशिकाएं समय से पहले संवेदनशील और "क्लोनोजेनिक रूप से निष्क्रिय" हो सकती हैं (यानी, वे उपनिवेश नहीं बनाती हैं) लेकिन चयापचय रूप से सक्रिय रहती हैं और एमटीटी या एमटीएस परख में गतिविधि प्रदर्शित करती हैं। याद रखने वाली एक और बात यह है कि क्लोनोजेनिक परख अनुयायी कोशिकाओं के अध्ययन तक सीमित है, और सभी अनुयायी कोशिकाएं कम सेल घनत्व पर चढ़ाए जाने पर उपनिवेश नहीं बना सकती हैं, क्योंकि सेल-सेलसंचार खो जाता है। अपर्याप्त सेल-सेल संचार और स्व-उत्पादित विकास कारकों की सीमाओं के कारण, क्लोनोजेनिक परख एमटीटी और एमटीएस परख की तुलना में कम दवा खुराक का जवाब देती है।

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Disclosures

डी.ए.पी.के. अमलाल फार्मास्यूटिकल्स इंक के सह-संस्थापक, अध्यक्ष और सीईओ हैं। एस.एस. अमलाल फार्मास्यूटिकल्स इंक के सह-संस्थापक हैं और बेक्सियन फार्मास्यूटिकल्स, इंक के ड्रग सेफ्टी मॉनिटरिंग बोर्ड में बैठते हैं।

Acknowledgments

लेखक थॉमस ई और पामेला एम मिशेल फैमिली फाउंडेशन से एस.एस. और हेरोल्ड सी. स्कॉट फाउंडेशन से समर्थन स्वीकार करते हैं, जो हेरोल्ड सी. स्कॉट संपन्न चेयर, यूसी कॉलेज ऑफ मेडिसिन के एस.एस.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABS SpectraMax Plate Reader Molecular Devices ABS
Accutase Invitrogen 00-4555-56
Alexa Flor 488 Invitrogen A32723 Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 100x
B27 Supplement Gibco 12587-010 Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet LABCONCO 302381101 Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1606-100
CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-211 Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride Fisher Scientific C7902 Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm Fisher Scientific 12-600-004 Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2 Fisher Scientific 430641U Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well Fisher Scientific 353046 Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well Fisher Scientific 353072 Cell culture treated
Centrifuge Eppendorf EP-5804R Refrigerated
Corning CoolCell Fisher Scientific 07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-553-450 Corning brand
D283 Med ATCC HTB-185
DABCO Mounting Media EMS 17989-97
D-Glucose Sigma Life Sciences D9434
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650 Cell culture grade
DMEM/F12, base media Fisher Scientific 11330-032 With phenol red
DMEM/F12, phenol red free Fisher Scientific 21041-025
EGTA Sigma Aldrich E4378
Epidermal Growth Factor STEMCELL 78006.1
FCCP Abcam AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic Millipore GF003
GARBA5 Antibody Aviva ARP30687_P050 Rabbit Polyclonal
Glutamax Gibco 35050-061
Glycerol Mounting Medium EMS 17989-60 With DAPI+DABCO
Hemocytometer Millipore Sigma
Heparin STEMCELL 7980
HEPES HyClone SH3023701 Solution
HEPES Fisher Scientific BP310-500 Solid
ImageJ Open platform With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI EMS 17989-97
KRM-II-08 experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor Novus N276314100U
L-Glutamine Gibco 25030-081
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M9272 Hexahydrate
Microscope, Confocal Leica SP8
Microscope, Light VWR 76382-982 DMiL Inverted
MTS - Promega One Step Promega G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL Eppendorf Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL Eppendorf Z683957
Nest-O-Patch Heka
Neurobasal-A Medium Gibco 10888022 Without vitamin A
Neurobasal-A Medium Gibco 12348-017 Phenol red free
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
NOR-QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm Fisher Scientific 50-998-944 4 inch width
Paraformaldehyde EMS RT-15710
PATHCHMASTER Heka
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Perfusion System Nanion 4000120
PFA EMS RT-15710
Phosphate Bufered Saline Fisher Scientific AAJ75889K2 Reagent grade
Poly-D-Lysine Fisher Scientific A3890401
Poly-L-Lysine Sigma Life Sciences P4707
Port-a-Patch Nanion 21000072
Potassium Chloride Sigma Life Sciences P5405
Primary Antibody Invitrogen MA5-34653 Rabbit Monoclonal
Prism GraphPad
Propofol Fisher Scientific NC0758676 1 mL ampule
QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs VWR 89094-664 Sterile
Slides, 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-544-7 Frosted one side
Sodium Bicarbonate Corning 25-035-Cl
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070
Synth-a-Freeze Medium Gibco R00550 Cryopreservation
TMRE Fisher Scientific 50-196-4741 Reagent
TMRE Kit Abcam AB113852 Kit
Triton X-100 Sigma Aldrich NC0704309
Trypan Blue Gibco 15-250-061 Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Solution, 0.25%
Vortex Mixer VWR 97043-562
Whatman Filter Paper Fisher Scientific 09-927-841

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 196 झिल्ली परिवहन आयन चैनल सेल व्यवहार्यता कैंसर कोशिकाएं मेडुलोब्लास्टोमा जीएबीएए रिसेप्टर्स।
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Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam,… More

Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam, D. K., Bhattacharya, D., Jenkins, A., Sengupta, S., Pomeranz Krummel, D. A. Screening Ion Channels in Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65427, doi:10.3791/65427 (2023).

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