Summary
이온 채널의 약리학적 표적화는 고형 종양을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 암세포에서 이온 채널 기능을 특성화하고 암 생존력에 대한 이온 채널 조절제의 효과를 분석하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.
Abstract
이온 채널은 세포 발달과 세포 항상성 유지에 중요합니다. 이온 채널 기능의 섭동은 광범위한 장애 또는 채널병증의 발병에 기여합니다. 암세포는 이온 채널을 활용하여 자체 발달을 유도할 뿐만 아니라 종양으로 개선되고 다양한 비암성 세포를 포함하는 미세 환경에서 동화됩니다. 또한, 종양 미세 환경 내에서 성장 인자 및 호르몬 수준의 증가는 이온 채널 발현을 향상시켜 암세포 증식 및 생존에 기여할 수 있습니다. 따라서 이온 채널의 약리학적 표적화는 원발성 및 전이성 뇌암을 포함한 고형 악성 종양을 치료하는 유망한 접근 방식일 수 있습니다. 본원에서는 암 세포에서 이온 채널의 기능을 특성화하기 위한 프로토콜과 암 생존력에 미치는 영향을 결정하기 위해 이온 채널의 조절자를 분석하는 접근법을 설명합니다. 여기에는 이온 채널에 대한 세포 염색, 미토콘드리아의 편광 상태 테스트, 전기 생리학을 사용하여 이온 채널 기능 확립, 약물 효능을 평가하기 위한 생존력 분석 수행이 포함됩니다.
Introduction
막 수송 단백질은 세포 간의 통신과 세포 항상성 유지에 중요합니다. 막 수송 단백질 중에서 이온 채널은 세포의 성장과 발달을 촉진하고 도전적이고 변화하는 환경에서 세포의 상태를 유지하는 역할을 합니다. 이온 채널은 또한 전신 및 중추신경계(CNS)에서 고형 종양의 발달을 유도하고 지원하는 것으로 보고되었습니다1,2. 예를 들어, KCa3.1 채널은 세포 주기 조절에 중요한 막 전위를 조절하고 세포 부피를 조절하는 역할을 합니다. 결함이 있는 KCa3.1 채널은 종양 세포의 비정상적인 증식에 기여하는 것으로 보고되었다3. 또한, 이온 채널은 암의 전이성 전파에 기여할 수 있습니다. 일시적인 수용체 전위 (TRP) 채널은 예를 들어 Ca2+ 및Mg2+ 유입에 관여하고; 이 유입은 종양을 둘러싼 세포외 기질을 조절하는 기능을 하는 여러 키나아제와 열 충격 단백질을 활성화시키며, 이는 차례로 암 전이를 시작하는 데 중요합니다4.
이온 채널은 암 발병에 기여할 수 있기 때문에 약물 관련 암 치료의 표적이 될 수도 있습니다. 예를 들어, 화학 요법 및 새로운 면역 요법을 포함한 치료 양식에 대한 내성은 이온 채널 기능 조절 장애와 관련이 있습니다 5,6,7. 또한, 이온 채널은 암의 성장과 발달을 방해하는 중요한 약물 표적으로 부상하고 있으며, 용도 변경 소분자(FDA 승인) 약물과 단클론 항체를 포함한 생체 고분자가 연구되고 있습니다 1,2,8,9. 이 분야에서 많은 진전이 있었지만 이온 채널 암 약물 발견은 아직 개발되지 않았습니다. 이것은 부분적으로 암세포에서 이온 채널을 연구하는 독특한 문제 때문입니다. 예를 들어, 느리게 작용하는 화합물에 대한 전기생리학 분석을 설정하는 데는 기술적 한계가 있고 채널 활성화 및 약물 작용의 시간적 차이가 있습니다. 또한, 화합물의 용해도는 또한 진행을 방해할 수 있는데, 이는 오늘날 일반적으로 사용되는 대부분의 자동화된 전기생리학 시스템이 소수성 기질을 사용하며, 이는 화합물 흡착의 결과로 인공물에 기여할 수 있기 때문입니다. 또한, 천연물, 펩타이드 및 단클론 항체와 같은 대형 생체 유기 분자 치료제는 기존의 전기생리학 분석법을 사용하여 스크리닝하기가 기술적으로 어렵다10. 마지막으로, 암세포의 생체 전기적 특성은 잘 알려져 있지 않다11.
한편, 이온 채널의 면역형광 염색은 종종 까다롭습니다. 이는 부분적으로 구조의 복잡성과 멤브레인의 맥락 때문이며, 이는 현미경 연구를 위해 항체를 생성하고 사용하는 능력에 영향을 미칩니다. 이온 채널을 염색하는 데 사용되는 항체의 특이성, 친화도 및 재현성을 검증하는 것이 특히 중요합니다. 이온 채널에 대한 상용 항체는 검증 전략 및 출판 기록에 따라 고려해야 합니다. 실험에는 표적 단백질의 녹다운 또는 녹아웃에 의한 비특이적 결합의 부족을 입증하기 위한 음성 대조군이 포함되어야 합니다. 대안적으로, mRNA 또는 단백질 결정에 기초하여 표적 단백질이 부재하거나 낮은 풍부도에 있는 세포주는 음성 대조군으로서 기능할 수 있다. 예를 들어, 이 연구는 수모세포종 세포주(D283)에서 (GABA) 수용체 서브유닛 Gabra5의 국소화를 보여줍니다. siRNA 녹다운을 갖는 D283 세포 및 또 다른 소뇌 수모세포종 세포주인 Daoy 세포를 Gabra5에 대해 염색하였고, 눈에 띄는 염색을 나타내지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
여기에서는 이온 채널 기능뿐만 아니라 이온 채널 조절제가 암세포에 미치는 영향을 분석하고 분석하는 방법을 제시합니다. 프로토콜은 (1) 이온 채널에 대한 세포 염색, (2) 미토콘드리아의 편광 상태 테스트, (3) 전기생리학을 사용한 이온 채널 기능 확립, (4) 시험관 내 약물 검증을 위해 제공됩니다. 이러한 프로토콜은 A형 감마-아미노부티르산(GABAA) 수용체 2,12,13,14,15,16, 염화물 음이온 채널 및 주요 억제성 신경전달물질 수용체에 대한 연구를 강조합니다. 그러나 여기에 제시된 방법은 다른 많은 암세포 및 이온 채널을 연구하는 데 적용됩니다.
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Protocol
1. 배양된 세포의 면역표지 이온 채널
- 세포 준비 및 실험 설정
- 세포를 75cm2 배양 플라스크에서 활발하게 성장하는 배양물로 유지한다. 사용 중인 세포주의 배가 시간에 따라 50%-90% 합류할 때까지 세포를 한 번 계대합니다.
참고: 본 연구를 위해, 그룹 3 수모세포종 세포주인 D283 세포를 사용하였다. - 배양 플라스크에서 세포를 원심분리기 튜브(15mL 또는 50mL)에 모으고 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 추가하여 부착 세포를 분리합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 5 분 후 플라스크를 3-5 번 두드려 세포를 분리합니다. 세포를 10% FBS와 함께 10mL의 배지에 모아 트립신의 작용을 중지시킨다.
- RT에서 480 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 매체를 부드럽게 흡인합니다. 세포 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 배양물의 밀도에 따라 5 mL 내지 10 mL의 배지에서 세포를 재현탁한다.
참고: 밀도는 활발하게 성장하는 세포와 일치해야 하며 플라스크 내 세포의 밀도에 따라 달라집니다. 최적의 세포 밀도를 근사화하기 위해 시각적 평가를 사용해야 합니다. 특히, 셀은 40%-90% 사이에 합류하고 고르게 분포되어야 합니다. - 100 μL의 세포를 제거하고, 100 μL의 0.4% 트립판 블루가 들어 있는 1.5 mL 튜브에 넣어 생존 불가능한 세포를 표시합니다. 세포주에 따라 RT에서 5-15분 배양합니다.
- 10 μL의 용액에서 혈구계( 재료 표 참조)를 사용하여 수동으로 세포 수를 세십시오. 혈구계의 16개 사각형의 네 모서리 각각에 있는 염색되지 않은 살아있는 세포를 세십시오. 평균 세포 수에 희석 계수를 곱하고 10,000을 곱하여 밀리리터당 세포(cells/mL)를 얻습니다. 대안적으로, 자동화된 세포 계수기가 사용될 수 있다.
- 세포를 1 x 105 cells/mL로 각 세포주에 지정된 배양 배지에 희석합니다. 종자 1. 제조업체의 지침에 따라 0.1mg/mL 폴리-D-라이신으로 미리 코팅된 22mm x 22mm 커버슬립이 포함된 6웰 플레이트의 각 웰에 8mL의 세포를 넣습니다( 재료 표 참조).
참고: poly-D-Lysine과 poly-L-Lysine의 사용을 모두 테스트하기를 원할 수 있는데, 이는 세포주 특이적 선호도에 대한 보고가 있기 때문이다17,18. 일부 세포주에는 폴리-L-라이신을 분해할 수 있는 프로테아제가 있는 반면, 폴리-D-라이신은 일부 세포주에 독성이 있다는 보고가 있습니다. 대조적으로, PC12와 같은 신경 세포는 폴리-D-라이신 표면에서 더 건강한 것으로 보고되었습니다. - 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 가습된 5%CO2 환경으로 인큐베이터에서 성장시켜 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 한다. 20x 대물렌즈로 도립 현미경으로 세포의 부착을 검사합니다.
참고: 세포는 치료 또는 직접 면역염색 전에 커버슬립에 완전히 부착되어야 합니다. 이때, 세포는 농축된 스톡(예를 들어, 4x 스톡 용액 600 μL)을 첨가하거나 배지를 원하는 1x 농도의 약물을 함유하는 새로운 배지로 교체함으로써 약물(또는 비히클 대조군)로 치료할 수 있고; 그런 다음 세포를 최대 48시간 동안 인큐베이터로 되돌릴 수 있습니다. 용매 처리된 세포는 표적 분자의 수준 및 국소화에 대한 약물의 효과를 평가하기 위해 포함된다. 본 연구에서, D283 세포를 48시간 동안 GABAA 수용체-양성 알로스테릭 조절제, QH-II-06614 ( 재료 표 참조)의 3.2 μM 용액 600 μL로 처리하였다. 대조군 세포는 동등한 부피의 DMSO로 처리되었다.
- 세포를 75cm2 배양 플라스크에서 활발하게 성장하는 배양물로 유지한다. 사용 중인 세포주의 배가 시간에 따라 50%-90% 합류할 때까지 세포를 한 번 계대합니다.
- 면역표지 준비: 고정, 투과화 및 차단
- 세포를 2.5 mL의 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mMKH2PO4, 재료 표 참조)로 헹구고,용액을 즉시 흡인한다.
- RT에서 1시간 동안 1x PBS에 4% PFA 1mL를 사용하여 세포를 고정합니다.
참고: 4% PFA는 면역염색을 위한 표준 고정제이지만 글루타르알데히드 또는 글리옥살은 면역형광을 위해 막 단백질을 고정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 얼음처럼 차가운 메탄올로 처리하는 것과 같은 알코올 기반 고정 방법은 형태가 잘 보존되지 않고 막 단백질이 손실될 수 있습니다19,20. - 2.0mL의 1x PBS(세척당 5분)로 셰이커에서 교반하여 6회 세척합니다. 1차 항체의 숙주 종과 일치하는 0.8% 트리톤 X-100 및 10% 정상 혈청을 갖는 1x PBS로 구성된 블로킹 완충액에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다 (대안적으로, 3% BSA 또는 소 혈청 분획 V 알부민을 정상 혈청 대신 사용할 수 있다).
참고: 이 단계는 비특정 바인딩을 차단하는 데 사용됩니다.
- 면역 표지
참고: 형광단에 결합된 항체를 추가한 후 광표백을 방지하기 위해 곧 측정해야 합니다. 접합 항체를 사용한 배양은 빛으로부터 보호해야합니다. 자유 라디칼을 제거하는 물질이 포함된 장착 매체를 사용하면 광표백을 줄일 수 있습니다. 슬라이드를 밀폐된 불투명 용기(4°C)에 보관합니다. 이미징 할 때, 여기 조명의 강도와 노출 시간을 제한함으로써 광 표백을 최소화 할 수 있습니다.- 150mm 배양 접시의 바닥을 여과지로 라이닝하여 가습 챔버를 준비합니다. 멸균 증류수로 여과지를 적시십시오. 여과지 위에 맞도록 절단된 실험실 필름 조각에 3 x 2 그리드를 그리고 6웰 플레이트에서 커버슬립의 방향을 유지하도록 레이블을 지정합니다. 여과지 위에 실험실 필름을 놓고 위쪽과 아래쪽 가장자리를 노출시켜 챔버를 가습합니다.
- 3% BSA가 포함된 1x PBS에서 원하는 1차 항체 희석액의 커버슬립당 100μL를 준비합니다. GABRA 유전자 단백질 생성물을 검출하기 위해, 토끼 재조합 단일클론 1차 항체를 1:200으로 희석하여 사용하십시오(Gabra5 항체, 중간 영역; 재료 표 참조).
참고: 백그라운드에서 최적의 신호를 생성하는 1차 항체 농도를 경험적으로 결정하려면 2차 농도를 일정하게 유지하면서 1차 항체의 희석 시리즈를 사용하십시오. 최적의 1차 항체 농도를 설정하기 위해 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 및 1:1,000의 희석을 권장합니다. - 커버슬립을 6웰 플레이트의 블록 용액에서 실험실 필름에 그려진 그리드의 적절한 위치로 옮깁니다. 6-웰 플레이트로부터 블록 용액을 버리고, 세척 단계를 위해 플레이트를 유지한다.
- 희석된 1차 항체 100 μL를 각 커버슬립의 중앙에 조심스럽게 추가합니다. 커버슬립의 가장자리 위에 용액을 놓지 마십시오. RT에서 1 시간 동안 배양합니다.
- 2.5mL의 1x PBS를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 커버슬립을 6웰 플레이트의 적절한 위치로 다시 옮깁니다.
- 2.5mL의 1x PBS로 각각 5분 동안 6회 세척을 수행합니다.
알림: 헹굼 단계 중에 커버슬립이 건조되지 않도록 하십시오., 이는 배경 형광 신호에 기여할 수 있습니다. - 커버슬립을 실험실 필름의 적절한 위치로 되돌립니다. 각 커버슬립에 대해 1x PBS + 1%-5% BSA에 희석한 100μL의 2차 항체를 추가합니다.
참고: 처음에는 Alexa Fluor 488에 결합된 2차 항체( 재료 표 참조)를 1x PBS + 3% BSA에서 1:1,000 희석으로 사용합니다. 2차 항체 농도는 필요한 경우 저농도 표적 단백질을 검출하기 위해 농도를 증가시키거나 백그라운드를 감소시키기 위해 농도를 감소시킴으로써 최적화될 수 있다. - 나머지 단계에서는 접합된 2차 항체의 광표백을 방지하기 위해 광 노출을 최소화한다. 배양 접시를 알루미늄 호일로 덮고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- 커버슬립을 6웰 플레이트로 다시 옮깁니다. 셰이커를 사용하여 2.5mL의 1x PBS로 각각 5분 동안 6회 세척합니다. 싱크대나 쓰레기통 위로 접시를 뒤집어 PBS를 제거합니다. 마지막 세척 후 커버슬립을 쉽게 제거할 수 있도록 PBS를 웰에 그대로 두십시오.
- 각 커버슬립에 현미경 슬라이드에 라벨을 붙입니다. 슬라이드 중앙에 DAPI(핵을 염색하기 위해)가 있는 글리세롤 함유 장착 배지 한 방울을 추가합니다( 재료 표 참조).
- 집게를 사용하여 우물에서 커버슬립을 제거하고 슬라이드 중앙에 있는 장착 매체 드롭에 부드럽게 놓습니다.
알림: 장착 매체에 기포가 형성되지 않도록 하십시오. - 작은 여과지 조각을 사용하여 과도한 장착 매체를 제거하십시오. 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 이미징하기 전에 광택제가 완전히 건조되도록 합니다. 유리 슬라이드를 4°C에서 불투명한 플라스틱 상자에 보관하십시오.
- 이미징 및 분석
- 침지 오일을 사용하여 40x 대물렌즈에서 형광 현미경으로 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조).
- 적절한 필터로 형광 이미지를 시각화합니다.
- 알림: Alexa Fluor 488의 경우 496nm/519nm의 여기/방출을 사용하십시오. DAPI의 경우 358nm/461nm의 여기/방출을 사용합니다.
- 디지털 이미지 파일을 캡처하고 저장합니다. 4 x 4의 비닝 값은 이미지 수집 속도를 용이하게 하고 배경을 줄이는 데 사용됩니다.
- 최종 이미지를 준비합니다. 이미지는 ImageJ 또는 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어로 처리 할 수 있습니다. 결과는 그림 1에 나와 있습니다.
2. 미토콘드리아의 편광 상태 테스트
참고: 이 프로토콜은 TMRE(테트라메틸로다민, 에틸 에스테르) 분석을 사용하여 활성 미토콘드리아의 막 전위를 표시하여 음전하21,22를 유지합니다. TMRE는 상대적인 음전하로 인해 활성 미토콘드리아에 축적되는 세포 투과성, 적색-주황색, 양전하를 띤 염료입니다. 비활성 또는 탈분극된 미토콘드리아는 막 전위를 감소시키고 TMRE를 비례적으로 격리하지 못합니다. 산화 적 인산화 (OXPHOS)의 이오노 포어 언 커플러 인 FCCP (카르 보닐 시안화물 4- [트리 플루오로 메톡시] 페닐 히드라 존)는 미토콘드리아 막을 탈분극시켜 TMRE23의 축적 및 격리를 방지합니다. 이 내용은 그림 2에 나와 있습니다.
- 세포 준비 및 실험 설정
- 세포를 75cm2 배양 플라스크에 유지한다. 배양 배지를 흡인하고 칼슘과 마그네슘이 없는 1x PBS로 세포를 헹굽니다.
- 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 넣어 부착 세포를 분리합니다. RT에서 5분 동안 인큐베이션하고, 세포를 10mL의 배지에 재현탁시킨다.
- 배양 플라스크에서 세포를 15mL 원심분리기 튜브에 수집합니다. RT에서 480 x g 에서 5분 동안 원심분리기.
- 배양의 원래 밀도에 따라 5 mL 내지 10 mL의 배지에 세포를 재현탁하여 세포 농도가 혈구계에서 제곱당 50-100 세포가 되도록 합니다. 필요한 경우 부피를 조정하여 정확한 계수에 필요한 셀 밀도를 제공합니다.
- 100 μL의 세포를 제거하고, 100 μL의 0.4% 트립판 블루가 들어 있는 1.5 mL 튜브에 넣는다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세십시오. 페놀 레드가 없는 배양 배지에서 세포를 3 x 104 cells/mL로 희석합니다.
참고: 페놀 레드가 결핍된 DMEM 배지는 페놀 레드 노출이 막 투과성을 억제하고 배경 자가형광에 기여할 수 있기 때문에 사용됩니다. - 웰 당 2.5 mL의 세포 현탁액(75,000 세포)을 제조자의 지시에 따라 폴리-D-라이신으로 미리 코팅된 22 x 22 mm 커버슬립을 함유하는 6-웰 플레이트에 넣는다( 재료의 표 참조).
- 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 가습된 5%CO2 로 인큐베이터에서 성장시켜 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 한다.
- 20x 대물렌즈로 도립 현미경으로 세포의 부착을 검사합니다. 더 진행하기 전에 셀이 커버슬립에 완전히 부착되어야 합니다.
- 원액 준비
- TMRE(MW = 514.96g/mol)의 1mM 원액(1,000x)을 제조하려면( 재료 표 참조) TMRE 1mg을 DMSO 1.94mL에 용해시킵니다. 분취량 및 -20 °C에서 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. 반복되는 동결/해동 주기를 피하십시오.
- FCCP(MW = 254.17g/mol)(미토콘드리아 산화 인산화 언커플러)의 50mM(2,500x) 원액을 제조하기 위해 10mg의 FCCP를 786.9μL의 DMSO에 용해시킵니다. 분취량 및 -20 °C에서 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. 반복되는 동결/해동 주기를 피하십시오.
- 참고: 준비된 원액은 TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit의 일부입니다( 재료 표 참조).
- 세포주에 대한 TMRE 농도 설정
- 세포 배양 배지에서 500 nM 작동 TMRE 용액을 준비한다. 작업 용액을 빛으로부터 보호하십시오.
- 50-200 nM 사이의 최종 농도 범위로 배지에서 커버슬립에서 성장한 세포에 TMRE를 추가합니다. 먼저 배양 배지를 흡인하고 TMRE를 함유한 배양 배지로 교체하여 이를 수행합니다.
- 37°C에서 20분 동안 배양한다. 세포가 실시간으로 보이기 때문에 이미징을 허용하기 위해 처리 시간을 엇갈리게 해야 합니다.
- 1x PBS로 세포를 두 번 세척하고 최종 TMRE 농도로 표지된 현미경 슬라이드에서 커버슬립을 뒤집습니다.
- 살아있는 세포를 즉시 이미지화합니다(피크 Ex/Em = 549nm/575nm).
참고: 배양 조건에서 제거된 샘플을 즉시 이미지화합니다., 세포가 배지에서 제거되고 현미경 슬라이드에 배치되면 미토콘드리아 건강이 손상되기 때문입니다. 커버슬립의 대안으로, 세포는 유리 바닥 접시에서 이미지화될 수 있습니다. - 사용 가능한 현미경 및 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
참고: TMRE 농도 최적화 프로세스 중에 실험 현미경 이미징 매개변수를 설정하고 정확한 데이터 비교를 보장하기 위해 후속 실험에서 동일한 조건을 유지합니다. 자세한 프로토콜은 컨포칼 현미경과 호환 가능한 소프트웨어를 사용했습니다( 재료 표 참조). - 세포주에 따라 달라지는 최적의 TMRE 농도를 선택합니다.
참고: 미토콘드리아 TMRE 수준의 변화를 해결하기 위한 최상의 신호를 제공하는 TMRE 농도는 일반적으로 가장 낮은 TMRE 농도로, 균일하고 쉽게 감지할 수 있는 형광 신호를 제공합니다.
- 세포의 편광 상태 테스트
- 분석 준비
- 원하는 농도의 처리 원액을 준비하고, 분석할 최종 화합물 농도로 배지를 준비합니다. FCCP의 경우 원액은 20mM이어야 합니다(50mM 원액에서 DMSO로 제조).
- 한 번에 하나의 커버슬립으로 작업하면서 1.8mL의 배지와 테스트 화합물을 세포에 추가합니다.
- 시험 화합물과 함께 세포를 원하는 기간 동안 가습된 환경에서 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션한다.
참고: 치료 시간은 테스트 화합물이 미토콘드리아 막 전위를 변경할 수 있는 메커니즘에 따라 달라집니다. 미토콘드리아 막 전위를 빠르고 직접적으로 탈분극하는 FCCP와 같은 강력한 프로토노포어는 치료 직후(몇 분 이내) 분석이 필요합니다. 대조적으로, 미토콘드리아 전자 수송 사슬 기능에 간접적으로 영향을 미치는 화합물, 예를 들어 단백질 활성화 또는 단백질 회전율을 변경하거나 단백질 합성을 필요로 하는 화합물의 치료 효과는 효과를 나타내는 데 더 오래 걸릴 수 있습니다. - 배양하는 동안 현미경을 켜고 게인, 레이저 강도, 이미지 캡처 속도, 평균화 및 노출 시간 측면에서 미리 결정된 최적의 이미징 매개변수로 설정합니다.
- 약물 처리 기간 후, 200 μL의 10x TMRE(위에서 결정된 최적 농도)를 대조군 및 약물 처리 세포에 첨가한다.
- 가습된 환경에서 5%CO2 중 37°C에서 15-30분 동안 인큐베이션한다. 배지를 부드럽게 흡인하고 세포를 1x PBS로 한 번 헹굽니다.
- 1x PBS 헹굼 단계를 반복하여 세포 배양 배지 또는 처리 화합물로 인한 백그라운드를 방지하고 처리 조건이 표시된 현미경 슬라이드에서 커버슬립을 뒤집습니다.
- 세포가 Ex / Em = 549 nm / 575 nm에서 살고 있음을 이미지화하십시오. 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 무결성이 손실되기 전에 고속 이미지 캡처(512픽셀 x 512픽셀, 평균 = 4)로 여러 z-스택 필드를 수집합니다.
- 분석을 위해 이미지 파일을 저장하고 저장합니다. 이 절차는 다음 실험 조건에 대해 반복됩니다.
- 실험적 통제
- 배지에 시험 화합물이 없는 위에서 설명한 대로(단계 3.1.1-3.1.8) 수행된 무처리(음성) 대조군을 사용합니다.
- 미토콘드리아 막 전위 파괴 가능성(positive) 대조군인 FCCP를 사용하여 양성자단을 화합물로 구성하였다. 배지에 1.8mL의 20μM FCCP( 재료 표 참조)를 세포에 추가합니다. 전술한 바와 같이(단계 3.1.1-3.1.2; 및 단계 3.1.3-3.1.8에 요약된 바와 같은 세포 이미징), TMRE로 염색하기 전에 가습 환경에서 5%CO2 중 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
참고: 이 실험에는 양성 대조군과 음성 대조군이 모두 필요합니다.
- 부량
- 각 z-스택의 중앙 영역에 있는 단일 대표 이미지에서 개별 셀의 캡처된 픽셀 강도를 측정합니다. 이 작업에서는 분석을 용이하게 하기 위해 단일 초점면을 선택했습니다.
- 처리당 최소 30개 셀(전체)의 픽셀 강도를 분석합니다. Excel 또는 Prism을 사용하여 각 처리에 대한 픽셀 강도의 평균을 구하고 평균의 표준 오차와 함께 막대 그래프 형식으로 표시합니다.
참고: ImageJ는 형광 정량화에도 사용할 수 있습니다. 대안적으로, TMRE 염색 형광은 상용 소프트웨어 플랫폼으로 정량화할 수 있습니다.
- 분석 준비
3. 전기생리학을 이용한 이온 채널 기능 확립
참고: 이 섹션의 절차에서는 자동 전기생리학 분석을 사용하여 암 세포주에서 테스트 화합물을 스크리닝하는 방법을 설명합니다(그림 3).
- 세포 준비
- 죽은 세포 및/또는 세포 과증식이 없는 건강한 배양에서 세포를 수확합니다. 화학 세포 분리 용액 TrypLE 또는 수동 세포 스크레이퍼를 사용하여 부착 및 클러스터형 세포를 수확합니다. 중추신경계 암세포에서 특히 흔한 덩어리 또는 구체로 자라는 세포를 해리합니다.
참고: 세포의 부드러운 해리는 이온 전도에 필수적인 막 단백질의 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다. - RT에서 10분 동안 561 x g 에서 세포를 원심분리하고, 상층액을 버리고, 펠릿을 DMEM(페놀 레드 없음), HEPES 및 페니실린/스트렙토마이신에 20% FBS 및 4mM L-글루타민( 재료 표 참조)으로 현탁하여 37°C로 유지합니다.
참고: 페놀 레드가 결핍된 DMEM 배지는 페놀 레드 노출이 막 투과성을 억제하기 때문에 사용됩니다. - poly-L-lysine-coated coverslip에 세포를 저밀도로 플레이트하여 단일 세포 사이에 분리가 있도록 합니다.
참고: 폴리-L-라이신이 더 나은 코팅 특성을 가지고 있기 때문에 폴리-D-라이신이 아닌 폴리-L-라이신이 여기에 사용됩니다. - 기록을 취하기 전에 세포를 37°C 및 5% CO2에서12 시간 내지 24시간(최적 시간이 확립되어야 함) 동안 가습된 챔버에서 배양합니다.
- 죽은 세포 및/또는 세포 과증식이 없는 건강한 배양에서 세포를 수확합니다. 화학 세포 분리 용액 TrypLE 또는 수동 세포 스크레이퍼를 사용하여 부착 및 클러스터형 세포를 수확합니다. 중추신경계 암세포에서 특히 흔한 덩어리 또는 구체로 자라는 세포를 해리합니다.
- 전기생리학 기록
- 커버슬립에서 매체를 제거합니다. 1x PBS로 세포를 두 번 부드럽게 세척합니다. ~300 μL의 TrypLE 용액을 추가합니다. 피펫을 사용하여 세포가 분리될 때까지 4-5회 부드럽게 위/아래로 피펫팅합니다.
- 무혈청 배지(DMEM)(페놀 레드 프리)를 추가하고 부피당 최종 세포 수를 최소 100만 cells/mL로 유지합니다. 1mL 피펫을 사용하여 세포를 디클러터링하여 세포 클러스터가 없는 세포 현탁액을 얻습니다.
- 세포 현탁액을 1mL 튜브로 옮깁니다. 세포를 4°C에서 10분 동안 배양하여 세포막을 안정화시킨다. 세포 덩어리가 형성되지 않도록 셰이커(부드러운 주기)에서 세포를 계속 회전시킵니다.
- Port-a-Patch 설정을 준비합니다( 재료 표 참조). 컴퓨터, 증폭기 및 관류 시스템을 켭니다. Patch-Master 소프트웨어를 열고 새 파일을 만듭니다.
- 완충액(세포외 및 내부)을 RT로 가져온 다음 완충액을 각각의 관류 튜브에 로드합니다.
참고 : GABAA 수용체의 기록은 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES 및 6 mM D- 글루코스 (NaOH를 사용하여 7.4로 pH 조정)를 포함하는 "세포 외 (욕조) 용액"과 120 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM EGTA를 포함하는 "내부 용액"을 모두 필요로합니다. 및 10mM HEPES (NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정). - 전극 칩(제조업체 제공)의 하단에 5μL의 내부 용액을 채우고 Port-a-Patch의 패러데이 상단에 전극 칩을 놓습니다. 칩에 10μL의 외부 용액을 추가하고 Patch-Master 소프트웨어를 사용하여 오실로스코프에서 직사각형 펄스를 관찰합니다( 재료 표 참조).
참고: 저항은 2-3MΩ 범위일 수 있지만 이는 세포주에 따라 다릅니다. - 직사각형 펄스가 보이고, 초기 전자 조정 후, 소프트웨어가 사용자에게 셀을 추가하라는 메시지를 표시한 후 기록을 시작합니다.
- 전극의 중앙 부분에 20μL의 단일 셀 현탁액을 부드럽게 추가하고 소프트웨어의 저항 값을 관찰하여 셀 패치를 기다린 후 Giga-Ohm 씰을 기다립니다.
- 셀 패치의 실시간 진행 상황은 소프트웨어의 왼쪽 열에서 관찰할 수 있습니다. 셀이 "전체 셀 모드로 유지"되면 소프트웨어 내에서 프로토콜을 열어 녹음을 시작합니다.
- 유지 전위를 -80mV로 설정합니다. Patch-Master 소프트웨어를 사용하여 갭 없는 연속 기록 프로토콜을 실행하여 셀의 전류를 기록합니다.
- 안정적인 기준선을 확보하고 소프트웨어의 왼쪽 패널에 있는 자동 관류 탭을 사용하여 지정된 기간 동안 리간드 및 해당 화합물 적용으로 전환합니다.
- Patch-Master 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집합니다.
참고: 데이터는 1kHz에서 저역 통과 필터링되고 100kHz에서 디지털화됩니다. - Nest-o-Patch 소프트웨어를 사용하여 현재 응답의 최대 진폭을 계산하여 데이터 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
4. 체외 효능
참고: 이 절차에서는 약물 효능을 결정하기 위한 MTS 분석에 대해 자세히 설명합니다. One Solution Cell Proliferation Assay는 실험 화합물로 처리한 후 세포 생존율과 증식을 평가하기 위해 세포 배양 웰에 한 단계로 추가할 수 있는 준비된 용액에 필요한 모든 분석 시약을 결합합니다. 시약은 제조업체의 권장 사항( 재료 표 참조)에 따라 재구성되고 분취되어 -20°C에서 보관됩니다. 이 섹션에서는 특정 세포주에서 테스트 화합물의IC50 을 측정하기 위한 분석의 사용을 설명합니다(그림 4). 이 MTS 시약은 알려진 농도에서 많은 수의 화합물에 대한 고처리량 스크리닝에도 사용할 수 있습니다.
- 세포 준비
참고: 세포 수는 각 개별 세포주의 성장과 대사에 따라 다릅니다. 임의의 연구용 처리를 평가하기 위해 분석을 사용하기 전에 실험적으로 최적의 세포 수를 결정한다.- 트립신 처리에 의해 배양물에서 부착 세포를 수확하고 Accutase ( 재료 표 참조)를 사용하여 덩어리 또는 구체에서 자라는 세포를 해리합니다.
참고: 교모세포종 및 원발성 수모세포종 세포주는 덩어리 또는 구체에서 자라는 경향이 있기 때문에 종종 Accutase가 필요합니다. - 세포를 계수하고, 75 μL 부피로 웰 당 10,000개의 세포가 있는 세포 용액을 만든다. 테스트할 세포 번호를 위해 스톡을 희석합니다. 희석 당 최소 1mL를 준비하십시오.
- 각 희석액 75μL를 96웰 플레이트에 5개의 연속 웰 세트로 플레이트합니다. 37°C 및 5%CO2 에서 하룻밤 동안 가습된 환경(즉, 인큐베이터)에서 인큐베이션한다.
참고: 성장 또는 신진대사가 느린 세포주(3일 이상 성장 배지를 산성화함)는 상위 세포 수 범위로 10,000개 이상의 세포가 필요할 수 있는 반면, 빠르게 성장하는(일반적으로 20시간 배가 시간보다 빠름) 세포주는 더 적은 수의 세포를 필요로 합니다. 신진대사가 높은 세포주는 웰당 1,000개 미만의 세포를 필요로 할 수 있습니다. 이러한 세포주에 대한 MTS 분석을 위한 최적의 도금 밀도를 결정하기 위해 세포 범위를 조정할 수 있습니다.
- 트립신 처리에 의해 배양물에서 부착 세포를 수확하고 Accutase ( 재료 표 참조)를 사용하여 덩어리 또는 구체에서 자라는 세포를 해리합니다.
- 모의 치료 통제
- MTS 분석에서 테스트 화합물의 첨가를 시뮬레이션하기 위해 웰당 25μL의 배지를 추가합니다.
참고: 실제 MTS 분석에서 테스트 화합물(여기서는 GABAA 수용체 조절제, QH-II-066)에 대해 선택한 처리 농도의 4배 스톡 25μL를 세포에 추가하여 웰당 100μL의 총 부피로 1x 최종 처리 농도를 제공합니다. - 37°C 및 5%CO2 에서 48시간 동안 가습된 환경에서 인큐베이션한다. 이것은 약물이 있는 상태에서 표준 배양을 시뮬레이션합니다.
- MTS 분석에서 테스트 화합물의 첨가를 시뮬레이션하기 위해 웰당 25μL의 배지를 추가합니다.
- MTS 분석
- MTS 시약의 필요한 분취량을 해동합니다. 웰당 20μL의 MTS 시약을 추가합니다. 37°C 및 5%CO2 에서 1시간 동안 가습 환경에서 배양합니다.
- 플레이트(1,350 x g 에서 5분 동안)를 원심분리하여 흡광도 판독을 방해할 수 있는 기포를 제거합니다.
알림: 미세 게이지 바늘로 기포를 제거하십시오. - 490nm에서 흡광도를 읽습니다. 데이터를 Excel 파일로 저장합니다.
- 플레이트를 5%CO2 중에서 37°C로 되돌리고, 분석의 4시간 선형 범위 기간 내에서 반복적으로 판독한다.
알림: 흡광도를 읽기 전에 다시 원심분리할 필요가 없습니다. 이후 판독값, 특히 2시간 판독값의 데이터는 세포주가 MTS 시약을 대사하는 속도를 검사하는 데 중요할 수 있으며 분석을 위해 플레이트에 넣을 세포 수를 선택하는 데 유용할 수 있습니다. - Excel 또는 Prism을 사용하여 490nm(OD490)에서 흡광도 광학 밀도(OD)와 도금된 셀 수를 플로팅합니다.
- 분석을 위한 세포 번호를 선택합니다. 최적의 세포 수는 선형 범위와 포화 미만입니다 (OD490 = 1).
참고: 성장이 느린 세포의 경우 플레이트된 가장 높은 세포 수를 웰당 20,000개 세포로 조정할 수 있으며 웰당 500개 세포는 분석에서 제외할 수 있습니다.
- IC 결정50
- 1일차: MTS 분석을 위해 세포를 플레이트
- 연구에서 각 라인의 세포주 이름과 통과 번호를 기록합니다. 분석 중 증발에 대응하기 위해 최소한 96웰 플레이트의 외부 주변 상단 및 하단 행과 끝 왼쪽 및 오른쪽 주변 컬럼을 1x PBS(웰당 100μL)로 채워 분석 중 증발에 대응합니다.
- 분석 시작 전에 결정된 대로 각 세포주에 대한 최적의 세포 수를 플레이트합니다. HEPES 완충액을 포함하지 않는 페놀 레드가 없고 항생제가 없는 배지의 웰당 75μL로 세포를 플레이트합니다. FBS는 세포주의 성장을 지원하기 위해 20%까지 증가될 수 있습니다.
참고: 페놀 레드가 없는 배지는 페놀 레드 노출이 막 투과성을 억제하기 때문에 사용됩니다. - 처리 농도를 위해 샘플을 최소 quintuplicate로 플레이트합니다. 수동 또는 자동 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.
참고: 수동 혈구계를 사용하려면 (1) 트리판 블루로 배지에 재현탁된 세포의 1:1 희석액을 준비합니다. (2) 세포주에 따라 5-15분 배양합니다. (3) 트립판 블루의 세포 10μL를 혈구계 계수 챔버에 로딩합니다. (4) 네 모서리와 중간 사각형에서 생존 가능한 세포를 세고 사각형당 평균 세포 수를 결정합니다. (5) 밀리리터당 생존 가능한 세포를 다음과 같이 계산합니다.
mL당 생존 세포 = 평균 생존 세포 × 2(희석 계수) × 104 - HEPES 완충액을 포함하지 않는 페놀 레드, 무항생제 배지(즉, 웰당 75μL x 플레이트당 60웰 = 플레이트당 세포 4.5mL)에서 원하는 농도의 세포를 준비하기에 충분한 부피를 사용합니다.
참고: 각 플레이트에는 배경 빼기를 위한 중간 전용 컨트롤이 있어야 합니다. 매체 제어는 필요한 경우 PBS 웰을 교체할 수 있습니다.
- 2일째: 처리 화합물 첨가
- 75 μL의 배지(= 웰당 100 μL 총 부피)에 도말된 세포에 25 μL의 처리 용액을 첨가할 때 원하는 최종 농도의 4배로 실험 처리를 준비한다.
- 시험 용액 (이 경우, GABAA 수용체 조절제 QH-II-066)을 최고 농도의 주식의 연속 희석에 의해 준비한다. 예를 들어, 최종 약물 농도가 5.0 μM, 2.5 μM, 1.25 μM, 0.625 μM 및 0.3125 μM인 경우, 20 μM으로 시작하는 1:1 연속 희석액을 준비하여 각각 10 μM, 5 μM, 2.5 μM 및 1.25 μM 농도를 얻습니다.
참고: 각 플레이트에는 배지 전용 대조군 외에 알려진 농도로 처리되지 않은 세포(배지 단독)와 용매 처리된 세포(종종 DMSO)의 두 가지 세포 기반 대조군이 필요합니다. 비히클이 화합물의 활성 범위에서의 세포 증식에 영향을 미치지 않도록 하는 것이 양호한 습관이다. - 시험 화합물이 첨가되면, 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 48시간 동안 가습된 환경에서 인큐베이션한다.
- 3일차: 세포증식 분석법(MTS) 수행
- 필요한 MTS 시약의 부피(테스트 배양 100μL당 20μL)를 계산하고 분취된 MTS 시약의 필요한 부피를 해동합니다( 재료 표 참조).
- 소용돌이를 일으키고 사용하기 전에 시약이 용액에 완전히 있는지 확인하십시오. 해동된 시약을 멸균된 25mL 시약 저장소에 피펫합니다.
- 피펫 20 μL의 MTS 시약(멀티채널 피펫 사용)을 100 μL의 배양 배지에 샘플이 들어 있는 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣었다.
- 플레이트를 37°C 및 5%CO2 에서 1시간 내지 4시간 동안 가습된 환경에서 인큐베이션한다. 플레이트는 여러 시점에서 읽을 수 있습니다. 일반적으로 플레이트는 1 시간 및 2 시간 또는 3 시간에 판독됩니다.
- 매체의 기포는 잘못된 결과를 초래할 수 있습니다. 플레이트 리더에서 판독하기 전에 플레이트를 실온에서 5분 동안 1,350 x g 로 돌립니다. 바늘이나 피펫 팁을 사용하여 원심분리 후 남아 있는 기포를 제거할 수 있습니다.
- 적절한 마이크로플레이트 리더 또는 분광 광도계를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정합니다( 재료 표 참조).
- 데이터를 Excel 파일로 저장합니다.
참고: 시험 화합물이 있는 상태에서 배양 시간은 시험 중인 화합물 외에도 연구 중인 세포주의 대사 속도 및 성장에 따라 달라집니다. 48시간의 배양 기간은 대부분의 세포주 및 시험 화합물에 대한 좋은 출발점입니다.
- 1일차: MTS 분석을 위해 세포를 플레이트
- 데이터 분석
- 데이터를 Excel 파일로 전송하고 검정 화합물 농도를 높여 각 반복실험에 대한 데이터를 구성합니다. 중간 전용 대조군 값의 평균을 구하고 실험 데이터에서 이 값을 뺍니다.
- 각각의 복제에 대해 대조군을 100% 증식으로 설정함으로써 비히클 웰 (또는 용매-처리된 대조군 웰)과 비교하여 처리 웰에서의 세포 증식의 퍼센트를 결정한다.
- Excel에서 생성된 데이터를 선택한 프로그램으로 전송합니다. 저자는 일반적으로 Prism 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 세포 증식을 50%(IC50)까지 억제하는 약물 농도를 결정합니다.
- Prism 소프트웨어에서 X-컬럼을 셀 번호로, Y-컬럼을 병렬 하위 컬럼의 5개 반복실험 값에 대한 평균 OD로 사용하여 데이터 테이블을 생성합니다.
- 약물 치료를 분석할 때 X 열에 치료 농도 값을 입력합니다. x축에 처리 화합물 이름과 농도 단위를 표시합니다.
- Excel 분석에서 계산된 반복 반복 세포 생존도 값을 Y 하위 열에 입력합니다. y축을 세포 증식(%)으로 표시합니다.
- 분석 도구를 사용하여 XY 분석에서 비선형 회귀 (곡선 적합)를 선택합니다.
- 용량-반응[억제] vs. 정규화된 반응-가변 기울기를 선택합니다.
- 분석 기능을 수행합니다. 결과 표를 보고 IC50 에 대해 계산된 최적 적합 값과 곡선 적합 그래프를 확인합니다. 원하는 경우 그래프의 x축을 로그 스케일로 변경할 수 있습니다.
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Representative Results
위는 암세포에서 이온 채널을 특성화하는 데 사용할 수 있는 선별된 절차입니다. 첫 번째 프로토콜은 이온 채널의 염색을 강조합니다. 자세히 설명했듯이 이온 채널 또는 세포외막에 존재하는 단백질을 염색할 때 많은 어려움이 있습니다. 도 1에 나타낸 것은 펜타머 GABAA 수용체의 서브유닛에 대한 염색이다. 두 번째 프로토콜은 암세포에서 미토콘드리아의 편광 상태를 테스트한 결과를 강조합니다. 미토콘드리아는 세포 생존력과 증식, 세포 사멸에 필수적인 역할을 합니다. 포유류 세포에서 미토콘드리아는 미토콘드리아 내막과 외막 사이에서 발견되는 Bcl-2 계열 단백질의 방출을 통해 세포 스트레스에 대한 반응으로 세포 사멸을 활성화합니다. 세포질에서 Bcl-2 계열 단백질은 프로그램된 세포 사멸을 매개하는 카스파아제 프로테아제를 활성화합니다. 원형질막 이온 채널 기능의 변화는 미토콘드리아 내의 이온 수준을 포함하여 세포 내 이온 항상성의 파괴를 초래할 수 있으며, 이는 막 전위의 손실로 이어질 수 있으며, 따라서 세포 사멸을 유발할 수 있습니다14. Ca2+, K+, Na+ 및 H+의 수준은 미토콘드리아 개시 세포 사멸을 유발할 수 있는 신호 전달 이벤트의 중요한 결정 요인입니다. 도 2에 나타낸 것은 음전하를 유지하는 활성 미토콘드리아에서 막 전위를 표지하고 이미지화하기 위해 세포 투과성, 양전하를 띤 염료 TMRE로 염색한것이다 21,22. TMRE는 상대적인 음전하 때문에 활성 미토콘드리아와 결합하는 적주황색 염료입니다. 탈분극되거나 비활성 미토콘드리아는 막 전위를 감소시켜 TMRE를 격리하지 못합니다. 이 실험에서 이오노포어 언커플러 FCCP는 미토콘드리아 막을 탈분극시켜 TMRE23의 축적을 방지하기 때문에 중요한 대조군입니다. 세 번째 프로토콜은 단일 세포 패치 클램프 전기 생리학을 강조합니다. 도 3에 나타낸 것은 환자 유래 수모세포종 세포주 D283으로부터 기록된 트레이스의 대표적인 기록이다. 마지막으로, 네 번째 프로토콜은 암세포의 증식 상태를 결정하는 분석을 강조합니다. 그림 4에는 MTS 분석의 작동 방식에 대한 세부 정보와 연구 중인 암세포의 생존력을 손상시키는 약제(이 경우 DAOY)와 함께 배양했을 때의 플레이트 및 판독값이 나와 있습니다.
그림 1: 이온 채널에 대한 세포 염색. (A) D283 수모세포종 암세포에서 GABAA 수용체의 서브유닛인 단백질 Gabra5의 염색. (B) DNA에 결합하는 형광 염색 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 처리된 고정 세포. (C) Gabra5 및 DAPI 모두에 대해 염색된 수모세포종 암세포의 병합. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림은 Kallay et al.14에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미토콘드리아의 편광 상태 테스트 . (a) 생D283 수모세포종 암세포는 증가하는 농도의 약물 QH-II-066으로 치료된다. 그런 다음 세포는 양전하를 띤 세포 투과성 TMRE(테트라메틸로다민, 에틸 에스테르)로 처리되며, 이는 활성(음전하를 띤) 미토콘드리아에 축적됩니다. 탈분극되거나 비활성 인 미토콘드리아는 막 전위가 감소하여 TMRE 염료를 유지하지 못합니다. 결과적으로 낮은 형광 신호를 나타냅니다. 형광 현미경으로 이미지화; FCCP (카르 보닐 시안화물 4- [트리 플루오로 메톡시] 페닐 히드라 존). 피크:λex, 549 nm; λem, 575 nm입니다. 스케일 바 = 10 μm. (B) 소프트웨어 플랫폼을 사용한 TMRE 염색 정량화 (패널 A에 표시된 이미지). 데이터는 평균의 평균 및 표준 오차로 표시됩니다. 이 그림은 Kallay et al.14에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 전기생리학을 이용한 이온 채널 기능 확립 . (a) 표시된 것은 패러데이 케이지(a), 기록 챔버(b) 및 흡입 장치(c, 오른쪽)로 구성된 Port-a-Patch 설정 또는 장비입니다. (B) 관류 입구(a), 출구(b) 및 기준 전극(c)이 장착된 녹음 챔버를 강조하는 Port-a-Patch 장비의 평면도. (C) Port-a-Patch는 자동 및 수동 작동 모드와 용액 저장소가 있는 신속한 용액 교환 관류 시스템에 연결됩니다. (D) Port-a-Patch rig(Nanion) 및 D283 수모세포종 암 세포를 사용하여 기록한 전체 세포 패치 클램프 전기생리학의 대표적인 전류 추적. GABA (10 μM)는 -80 mV의 유지 전위로 5 초 동안 적용되었다. (E) GABA(1μM)와 GABAA 수용체 작용제(전신 마취제) 프로포폴(50μM)의 동시 적용과 함께 Port-a-Patch rig(Nanion) 및 D283 수모세포종 암 세포를 사용하여 전체 세포 패치 클램프 전기생리학 기록의 대표적인 전류 추적, 이는 GABA 단독에 의해 유도된 전류를 강화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 약물 효능을 평가하기 위한 MTS 분석. (A) 세포 증식 감소에 의해 반영된 바와 같이 제제의 효능을 평가하는 데 사용되는 "MTS 분석"의 기초가 되는 화학 반응. 생존 가능한 세포에 의한 MTS 테트라졸륨의 환원, 염료 포르마잔 생성. (B) 약물 농도가 증가함에 따라 MTS 분석의 비색 결과를 보여주는 96웰 플레이트. 이 실험에서 DAOY 수모세포종 암세포는 GABAA 수용체의 양성 알로스테릭 조절제인 전임상 약물인 KRM-II-08의 농도를 증가시켜 치료합니다. (C) MTS 분석으로 생성된 용량-반응 곡선(96웰 플레이트의 정량화로부터). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 수동 | 반/완전 자동화 | |
| 처리량 | 낮다 | 높다 |
| 빠른 솔루션 교환 | 가능한 | 예 |
| 비용 | 높다 | 낮다 |
| 연산자 | 경험을 가진 | 초급/중급 |
| 세포 유형 | 모든 세포; 조직 | 1차 단일세포; 세포주 |
| 필요한 휴대폰 번호 | 최소* | 높다* |
| 약물/용액 부피 | 높다 | 낮다 |
| 자원/유틸리티 | 높다 | 낮다 |
| 정비 | 높다 | 낮다 |
| 실험 관리 | 아주 좋아요 | 좋다 |
| 라이브 셀 이미징 | 예 | 아니요 |
| *예를 들어, Port-a-Patch는 녹음을 위해 최소 백만 개의 셀/mL가 필요하지만 수동 설정에는 일반적으로 커버슬립에 수백 개의 셀이 필요합니다. | ||
표 1: 수동 대 반자동 및/또는 완전 자동 전기생리학 설정 비교.
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Discussion
이온 채널 기능의 변화는 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 변경하여 세포의 전반적인 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 지난 10년 동안 이온 채널이 암세포 성장과 전이에 중요하다는 것이 점점 더 분명해졌습니다. 중요하게도, 많은 이온 채널이 광범위한 장애를 표적으로 하는 승인된 치료제의 주요 표적이다24. 연구자들은 이온 채널이 항암 표적이 될 수 있는지 여부를 조사했으며 초기 결과는 2,16,25를 약속합니다. 이 분야는 암 발병 및 치료 표적으로서 이온 채널의 역할을 조사하기 시작했으며 미래는 두 가지 측면에서 모두 밝아 보입니다.
이 연구에서는 암세포의 이온 채널을 분석하고 채널이 치료 취약성인지 여부를 결정하기 위한 자세한 절차를 제공합니다. 이러한 분석은 암세포의 이온 채널을 연구하는 데 도움이 되는 가이드 역할을 합니다. 암세포에서 이온 채널의 시각화, 이온 채널의 조절이 암세포의 편광 상태를 변경하는 방법의 결정, 전기 생리학을 사용하여 이온 채널 기능을 분석하는 다양한 접근 방식 및 암세포 생존력 측정에 중점을 둔 방법이 설명되었습니다.
면역형광 염색은 이온 채널의 존재 및 세포 국소화를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 실험 조건은 셀 내에서 채널이 발견되는 위치를 정확하게 나타내기 위해 신중하게 최적화되어야 합니다. 직관적으로, 이온 채널의 염색은 용매에 접근할 가능성이 가장 높기 때문에 비교적 간단할 것으로 예상할 수 있습니다. 그러나 면역형광 에피토프는 세포외 또는 세포내 도메인의 일부인지 여부에 따라 쉽게 접근하지 못할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 이온 채널은 종종 세포막에 조밀하게 클러스터링되어 있으므로, 면역염색에 의한 이들의 검출은 다른 종류의 단백질에 비해 고정 및 투과화 절차의 보다 광범위한 최적화를 필요로 할 수 있다14,26.
미토콘드리아 막 전위는 ATP 합성, 활성 산소 종(ROS) 생성, 칼슘 격리, 미토콘드리아 단백질 수입, 막 역학 및 세포 사멸 유발을 포함한 많은 미토콘드리아 관련 과정에 필수적입니다. 이 프로토콜은 TMRE 분석을 사용하여 단일 세포에서 활성 미토콘드리아의 막 전위를 표시합니다. 고처리량 스크리닝의 경우 마이크로플레이트 형식의 형광 플레이트로 TMRE 수준을 측정할 수 있습니다.
패치 클램프 전기생리학은 이온 채널 동역학 연구를 위한 "황금 표준" 방법입니다. 전체 세포 및 단일 채널 방법은 이온 채널 조절제의 구조-기능 관계 및 약리학을 정확하게 결정하기 위한 최고 분해능 방법이기도 합니다. 이 방법은 이온 채널(27)을 통한 이온의 이동에 의해 야기된 멤브레인을 가로지르는 작은 전기적 변화의 연구를 이용한다. 전기생리학 실험은 전통적으로 한 번에 단일 세포의 수동 패치 클램프 전기생리학 기록을 사용하여 수행되므로 사용자가 일련의 전문 기술을 보유해야 하는 낮은 처리량 접근 방식이 발생합니다. Port-a-Patch, IonFlux Mercury, Patchliner 및/또는 Synchropatch 기술과 같은 자동화된 패치 클램프 전기생리학 기술은 한 번에 여러 기록을 제공하며, 이러한 기술은 화합물 적용을 위한 정교한 관류 설정을 갖추고 있어 특별한 기술 없이도 준고처리량 또는 고처리량을 제공합니다. 일부 실험의 경우 수동 패치 클램핑은 대체할 수 없습니다(표 1). 그럼에도 불구하고 자동화된 패치 클램프 기술은 이온 채널 생물물리학 연구 및 관련 약물 발견 프로그램을 가속화했습니다. 1차/비형질주입 세포에서 기록하는 것의 한계 중 하나는 누출된 비특이적 내인성 전류의 기여입니다. 우리의 기록에서, 우리는 약간의 기준선 변화를 관찰했으며, 이는 D283 세포로부터의 내인성 전류의 잠재적 기여를 시사한다.
세포 증식 분석은 화학 작용제에 대한 반응으로 세포 성장 활성의 섭동을 측정합니다. 이러한 분석은 세포 증식에 대한 약물의 작용을 평가하는 중요한 도구입니다. 세포 증식을 평가하기 위해 연구자들은 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드), MTS(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-5-[3-카르복시메톡시페닐]-2-[4-설포페닐]-2H-테트라졸륨) 및/또는 클론 생성 분석. MTT 및 MTS 분석은 수용성 테트라졸륨 염(노란색)을 정량화 가능한 포르마잔 생성물(MTT 분석에서 보라색)로 전환(환원)하는 것을 측정하며, 이는 대사 활성 세포의 탈수소효소 시스템에 의해 촉매됩니다. 착색된 생성물의 강도는 "생존 가능한"(예를 들어, 대사 활성) 세포의 수의 추정을 제공한다. 대조적으로, clonogenic 분석은 약물28,29로 처리 한 후 배양 된 단일 세포가 콜로니 (적어도 50 세포 또는 6 개의 연속 분열)를 형성하는 능력을 분석합니다. MTT, MTS 및 클론 생성 분석은 각각 장점과 단점이 있으며, 주어진 세포주에서 약물의 효능을 결정하기 위해 이러한 분석의 적합성을 신중하게 평가해야 합니다. 최적으로, 약물의 효능을 결정하기 위해 이러한 분석(예: 클론 생성 및 MTT 또는 MTS 분석) 중 하나 이상을 사용하는 것이 좋습니다.
MTT 및 MTS 분석은 살아있는 세포의 대사 활성을 평가하며, 이는 세포 유형 및 분석 조건에 따라 다를 수 있습니다. MTT 또는 MTS 분석법은 유리한데, 이들 분석법은 수행하기 쉽고, 복제로 수행될 수 있으며, 고처리량 스크리닝(30)에 적합하기 때문이다. MTT 또는 MTS 분석은 3-4 일 내에 완료 될 수 있으며, clonogenic 분석은 사용 된 세포주의 특성에 따라 10-21 일이 걸릴 수 있습니다28. 대조적으로, MTS 및 MTT 분석의 단점은 배양 배지를 사용하여 분석을 수행하는 데 필요한 시약의 간섭 가능성, 분석 사용의 어려움, 세포 대사 상태 및 배양 조건으로 인한 복제 간의 잠재적 가변성입니다31. MTT와 MTS 분석 사이의 선택과 관련하여 MTT 분석은 세포를 용해하고 포르마잔 결정이 배지에 용해되도록 하기 위해 가용화 단계가 필요하고 570nm에서 흡광도를 나타내는 반면, MTS 분석은 포르마잔이 간헐적인 단계 없이 배지에 직접 가용화되는 "1단계 분석"이라는 점을 고려해야 합니다(예: 세포 용해 단계). MTS 분석에서 포르마잔 생성물은 색상이 더 어둡고 흡광도 값 범위(490-500nm)가 더 민감하여 양성 반응을 더 쉽게 확인할 수 있습니다. MTS 분석은 반응에 2-3시간이 필요하고 반응에는 4시간이 필요하고 MTT 분석에서는 1-2시간의 가용화가 필요하기 때문에 MTT 분석보다 빠릅니다. 추가적으로, MTS 분석 포르마잔 생성물은 현탁액에 남아 있고, MTS 분석 동안 배지 변경이 요구되지 않기 때문에, 분석은 MTT 분석보다 현탁 세포에 더 적합하다(32). 그러나, DMSO 및 SDS 용해 용액의 조합을 사용하여 가용화 단계가 개선된 변형된 MTT 분석법이 개발되었다. 이 변형된 MTT 분석은 부착 세포와 현탁 세포 모두에 사용할 수 있습니다. MTT 분석을 사용하기로 선택한 경우 세포 배양 및 세포 성장에 사용되는 조건/시약을 선택할 때 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 세포가 단층으로 성장하거나, 분화되거나, 융합 단층으로 성장하거나, 노화되는 경우 결과가 달라집니다. 또한, 일부 세포내 환원효소 및 플라빈 산화효소와 같은 특정 비-미토콘드리아 탈수소효소는 MTT 시약을 감소시킬 수 있으며, 아마도 위양성 판독값을 유도할 수 있다33. 또한, MTT 시약은 어느 정도의 독성을 가지므로 배양 시간을 제한해야 한다. MTT 감소 속도는 또한 배지의 pH 및 포도당 함량 및 세포의 생리적 상태와 같은 배양 조건에 따라 변할 수 있습니다32,34. 예를 들어, 아스코르브산의 존재는 MTT를 포르마잔으로 감소시키는 것으로 보고되었으며, 이 효과는 레티놀35의 존재 하에서 강화됩니다. 클론 생성 분석의 잠재적 문제와 관련하여, 약물 첨가 후 세포가 조기 노화 및 "클론 생성 비활성"(즉, 콜로니를 형성하지 않음)이 될 수 있지만 대사 활성 상태를 유지하고 MTT 또는 MTS 분석에서 활성을 나타낼 수 있음을 인식하는 것이 중요합니다. 기억해야 할 또 다른 점은 클론 생성 분석이 부착 세포 연구로 제한되며, 세포 간 통신이 손실되기 때문에 모든 부착 세포가 낮은 세포 밀도로 도금될 때 콜로니를 형성할 수 있는 것은 아니라는것입니다 36. 부적절한 세포-세포 통신과 자가 생성 성장 인자의 한계로 인해 클론 생성 분석은 MTT 및 MTS 분석보다 낮은 약물 용량에 반응합니다.
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Disclosures
D.A.P.K.는 Amlal Pharmaceuticals Inc.의 공동 창립자, 사장 겸 CEO이며, Amlal Pharmaceuticals Inc.의 공동 설립자이며 Bexion Pharmaceuticals, Inc.의 의약품 안전 모니터링 위원회에 소속되어 있습니다.
Acknowledgments
저자는 Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation에서 S.S.에 대한 지원과 Harold C. Schott Foundation이 UC 의과 대학의 Harold C. Schott 기부 의장에게 자금을 지원했음을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS - Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
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