Скрининг ионных каналов в раковых клетках
Summary
Фармакологическое таргетирование ионных каналов является перспективным подходом к лечению солидных опухолей. Предоставлены подробные протоколы для характеристики функции ионных каналов в раковых клетках и анализа влияния модуляторов ионных каналов на жизнеспособность рака.
Abstract
Ионные каналы имеют решающее значение для развития клеток и поддержания клеточного гомеостаза. Нарушение функции ионных каналов способствует развитию широкого спектра расстройств или каналопатий. Раковые клетки используют ионные каналы, чтобы стимулировать свое собственное развитие, а также совершенствоваться как опухоль и ассимилироваться в микросреде, которая включает в себя различные нераковые клетки. Кроме того, повышение уровня факторов роста и гормонов в микроокружении опухоли может привести к усилению экспрессии ионных каналов, что способствует пролиферации и выживанию раковых клеток. Таким образом, фармакологическое воздействие на ионные каналы является потенциально перспективным подходом к лечению солидных злокачественных новообразований, включая первичный и метастатический рак головного мозга. Описаны протоколы характеристики функции ионных каналов в раковых клетках и подходы к анализу модуляторов ионных каналов для определения их влияния на жизнеспособность рака. К ним относятся окрашивание клетки (клеток) на ионный канал (каналы), тестирование поляризованного состояния митохондрий, установление функции ионных каналов с помощью электрофизиологии и проведение анализа жизнеспособности для оценки эффективности препарата.
Introduction
Мембранные транспортные белки имеют решающее значение для коммуникации между клетками, а также для поддержания клеточного гомеостаза. Среди мембранных транспортных белков ионные каналы служат для стимулирования роста и развития клеток, а также для поддержания состояния клеток в сложных и изменяющихся условиях. Кроме того, сообщалось, что ионные каналы стимулируют и поддерживают развитие солидных опухолей как системно, так и в центральной нервной системе (ЦНС)1,2. Например, каналы KCa3.1 отвечают за регулирование мембранного потенциала и контроль объема клеток, что важно для регуляции клеточного цикла. Сообщалось, что дефектные каналы KCa3.1 способствуют аномальной пролиферации опухолевых клеток3. Кроме того, ионные каналы могут способствовать метастатической диссеминации рака. Каналы транзиторного рецепторного потенциала (TRP), например, участвуют в притоке Ca2+ иMg2+; Этот приток активирует несколько киназ и белков теплового шока, которые функционируют для регуляции внеклеточного матрикса, окружающего опухоль, что, в свою очередь, важно для инициирования метастазирования рака4.
Поскольку ионные каналы могут способствовать развитию рака, они также могут быть мишенями для медикаментозного лечения рака. Например, резистентность к методам лечения, включая химиотерапию и новую иммунотерапию, связана с дисрегуляцией функции ионных каналов 5,6,7. Кроме того, ионные каналы становятся важными мишенями для лекарств, препятствующих росту и развитию рака, при этом исследуются перепрофилированные низкомолекулярные препараты (одобренные FDA), а также биополимеры, включая моноклональные антитела 1,2,8,9. Несмотря на значительный прогресс на этом фронте, разработка лекарств от рака ионных каналов остается недостаточно разработанной. Отчасти это связано с уникальными проблемами изучения ионных каналов в раковых клетках. Например, существуют технические ограничения в настройке электрофизиологических анализов для медленно действующих соединений и временные различия в активации каналов и действии лекарств. Кроме того, растворимость соединений также может препятствовать прогрессу, поскольку большинство автоматизированных электрофизиологических систем, широко используемых сегодня, используют гидрофобные субстраты, которые могут способствовать возникновению артефактов в результате адсорбции соединений. Кроме того, крупные биоорганические молекулярные терапевтические средства, такие как натуральные продукты, пептиды и моноклональные антитела, технически сложны для скрининга с помощью традиционных электрофизиологических анализов10. Наконец, биоэлектрические свойства раковых клеток остаютсямалоизученными.
Между тем, иммунофлуоресцентное окрашивание ионных каналов часто является сложной задачей. Отчасти это связано со сложностью их структур и контекстом в мембране, которые влияют на способность генерировать и использовать антитела для микроскопических исследований. Особенно важно, чтобы антитела, используемые для окрашивания ионных каналов, были проверены на специфичность, сродство и воспроизводимость. Коммерческие антитела к ионным каналам следует рассматривать на основе стратегии валидации и публикаций. Эксперименты должны включать отрицательный контроль, чтобы продемонстрировать отсутствие неспецифического связывания путем нокдауна или нокаута белка-мишени. В качестве альтернативы, клеточные линии, в которых целевой белок отсутствует или находится в низком количестве, основанные на определении мРНК или белка, могут служить отрицательным контролем. Например, это исследование показывает локализацию субъединицы рецептора (ГАМК) Gabra5 в клеточной линии медуллобластомы (D283). Клетки D283 с нокдауном миРНК и клетки Daoy, еще одна клеточная линия мозжечковой медуллобластомы, были окрашены на Gabra5 и не показали заметного окрашивания (данные не показаны).
Представлены методы анализа и анализа функции ионных каналов, а также влияния модуляторов ионных каналов на раковые клетки. Предусмотрены протоколы для (1) окрашивания клеток для ионного канала, (2) тестирования поляризованного состояния митохондрий, (3) установления функции ионных каналов с помощью электрофизиологии и (4) валидации лекарств in vitro. В этих протоколах особое внимание уделяется исследованиям рецептора гамма-аминомасляной кислоты (ГАМКА) типа А 2,12,13,14,15,16, хлорид-анионного канала и главного тормозного рецептора нейротрансмиттера. Однако методы, представленные здесь, применимы и к изучению многих других раковых клеток и ионных каналов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изменения в функционировании ионных каналов изменяют внутриклеточные сигнальные каскады, которые могут влиять на общее функционирование клетки. За последнее десятилетие стало все более очевидным, что ионные каналы играют важную роль в росте и метастазировании раковых клеток. Важно о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность Фонду семьи Томаса Э. и Памелы М. Мишель С.С. и Фонду Гарольда К. Шотта, который финансировал Медицинский колледж Калифорнийского университета.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
References
- Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
- Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
- Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
- Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
- Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
- Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
- Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
- Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
- Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
- Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
- Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
- Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
- Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
- Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
- Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
- Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
- Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
- Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
- Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
- Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
- Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
- Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
- Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
- Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
- Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
- Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
- Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).
