Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması
Summary
İyon kanallarının farmakolojik olarak hedeflenmesi, solid tümörlerin tedavisinde umut verici bir yaklaşımdır. Kanser hücrelerinde iyon kanalı fonksiyonunu karakterize etmek ve iyon kanalı modülatörlerinin kanser canlılığı üzerindeki etkilerini test etmek için ayrıntılı protokoller sağlanmıştır.
Abstract
İyon kanalları, hücre gelişimi ve hücre homeostazının korunması için kritik öneme sahiptir. İyon kanalı fonksiyonunun bozulması, çok çeşitli bozuklukların veya kanalopatilerin gelişmesine katkıda bulunur. Kanser hücreleri, kendi gelişimlerini sürdürmek, ayrıca bir tümör olarak gelişmek ve çeşitli kanserli olmayan hücreleri içeren bir mikro ortamda asimile olmak için iyon kanallarını kullanır. Ayrıca, tümör mikroçevresindeki büyüme faktörleri ve hormon seviyelerindeki artışlar, kanser hücresi proliferasyonuna ve hayatta kalmasına katkıda bulunan iyon kanalı ekspresyonunun artmasına neden olabilir. Bu nedenle, iyon kanallarının farmakolojik hedeflemesi, primer ve metastatik beyin kanserleri de dahil olmak üzere katı malignitelerin tedavisinde potansiyel olarak umut verici bir yaklaşımdır. Burada, kanserli hücrelerde iyon kanallarının işlevini karakterize etmek için protokoller ve kanser canlılığı üzerindeki etkilerini belirlemek için iyon kanallarının modülatörlerini analiz etme yaklaşımları açıklanmaktadır. Bunlar, bir iyon kanalı/kanalları için bir hücrenin/hücrelerin boyanmasını, mitokondrinin polarize durumunun test edilmesini, elektrofizyoloji kullanılarak iyon kanalı fonksiyonunun oluşturulmasını ve ilaç gücünü değerlendirmek için canlılık deneylerinin yapılmasını içerir.
Introduction
Membran taşıma proteinleri, hücreler arasındaki iletişimin yanı sıra hücresel homeostazı korumak için kritik öneme sahiptir. Membran taşıma proteinleri arasında iyon kanalları, hücrelerin büyümesini ve gelişmesini yönlendirmeye ve zorlu ve değişen ortamlarda hücrelerin durumunu korumaya hizmet eder. İyon kanallarının ayrıca hem sistemik olarak hem de merkezi sinir sisteminde (CNS) katı tümörlerin gelişimini yönlendirdiği ve desteklediği bildirilmiştir1,2. Örneğin, KCa3.1 kanalları, hücre döngüsü düzenlemesinde önemli olan membran potansiyelini düzenlemekten ve hücre hacmini kontrol etmekten sorumludur. Kusurlu KCa3.1 kanallarının tümör hücrelerininanormal proliferasyonuna katkıda bulunduğu bildirilmiştir 3. Ayrıca, iyon kanalları kanserlerin metastatik yayılımına katkıda bulunabilir. Örneğin geçici reseptör potansiyeli (TRP) kanalları,Ca2+ veMg2+ akışında rol oynar; Bu akış, bir tümörü çevreleyen hücre dışı matrisi düzenleme işlevi gören birkaç kinaz ve ısı şoku proteinini aktive eder ve bu da kanser metastazını başlatmak için önemlidir4.
İyon kanalları kanserlerin gelişimine katkıda bulunabileceğinden, ilaca bağlı kanser tedavisi için de hedef olabilirler. Örneğin, kemoterapi ve yeni immünoterapi dahil olmak üzere tedavi yöntemlerine direnç, iyon kanalı fonksiyon düzensizliği 5,6,7 ile ilişkilidir. Ek olarak, iyon kanalları, monoklonal antikorlar 1,2,8,9 dahil olmak üzere biyopolimerlerin yanı sıra yeniden tasarlanmış küçük moleküllü (FDA onaylı) ilaçların incelenmesiyle, kanserlerin büyümesini ve gelişmesini engellemek için önemli ilaç hedefleri olarak ortaya çıkmaktadır. Bu cephede çok ilerleme kaydedilmiş olsa da, iyon kanalı kanseri ilaç keşfi az gelişmiş durumda. Bu kısmen, kanser hücrelerinde iyon kanallarını incelemenin benzersiz zorluklarından kaynaklanmaktadır. Örneğin, yavaş etkili bileşikler için elektrofizyoloji deneylerinin kurulmasında teknik sınırlamalar ve kanal aktivasyonu ve ilaç etkisinde zamansal farklılıklar vardır. Ayrıca, günümüzde yaygın olarak kullanılan otomatik elektrofizyoloji sistemlerinin çoğu, bileşik adsorpsiyonunun bir sonucu olarak artefaktlara katkıda bulunabilecek hidrofobik substratlar kullandığından, bileşiklerin çözünürlüğü de ilerlemeyi engelleyebilir. Ek olarak, doğal ürünler, peptitler ve monoklonal antikorlar gibi büyük biyoorganik moleküler terapötiklerin geleneksel elektrofizyoloji deneyleri kullanılarak taranması teknik olarak zordur10. Son olarak, kanser hücrelerinin biyoelektriksel özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır11.
Bu arada, iyon kanallarının immünofloresan boyaması genellikle zordur. Bu, kısmen, yapılarının karmaşıklığından ve mikroskopi çalışmaları için hem antikor üretme hem de kullanma yeteneğini etkileyen zardaki bağlamlarından kaynaklanmaktadır. İyon kanallarını boyamak için kullanılan antikorların özgüllük, afinite ve tekrarlanabilirlik açısından doğrulanması özellikle önemlidir. İyon kanalları için ticari antikorlar, doğrulama stratejilerine ve yayın kayıtlarına göre düşünülmelidir. Deneyler, hedef proteinin yıkılması veya nakavt edilmesiyle spesifik olmayan bağlanma eksikliğini göstermek için negatif kontroller içermelidir. Alternatif olarak, hedef proteinin bulunmadığı veya mRNA veya protein tayinlerine dayalı olarak düşük bollukta olduğu hücre hatları, negatif kontroller olarak işlev görebilir. Örneğin, bu çalışma (GABA) reseptör alt birimi Gabra5’in bir medulloblastoma hücre hattında (D283) lokalizasyonunu göstermektedir. Bir siRNA yıkımı olan D283 hücreleri ve başka bir serebellar medulloblastom hücre hattı olan Daoy hücreleri, Gabra5 için boyandı ve kayda değer bir boyama göstermedi (veriler gösterilmemiştir).
Burada, iyon kanalı fonksiyonunun yanı sıra iyon kanalı modülatörlerinin kanser hücreleri üzerindeki etkisini analiz etmek ve analiz etmek için yöntemler sunulmaktadır. (1) bir iyon kanalı için boyama hücreleri, (2) mitokondrinin polarize durumunun test edilmesi, (3) elektrofizyoloji kullanılarak iyon kanalı fonksiyonunun oluşturulması ve (4) in vitro ilaç validasyonu için protokoller sağlanmıştır. Bu protokoller, A tipi gama-aminobütirik asit (GABAA) reseptörü 2,12,13,14,15,16, bir klorür anyon kanalı ve majör inhibitör nörotransmitter reseptörü ile ilgili çalışmaları vurgulamaktadır. Bununla birlikte, burada sunulan yöntemler, diğer birçok kanser hücresini ve iyon kanalını incelemek için geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İyon kanalı işlevindeki değişiklikler, bir hücrenin genel işleyişini etkileyebilecek hücre içi sinyal kaskadlarını değiştirir. Son on yılda, iyon kanallarının kanser hücresi büyümesi ve metastazı için önemli olduğu giderek daha açık hale geldi. Daha da önemlisi, birçok iyon kanalı, geniş bir hastalık yelpazesini hedefleyen onaylanmış terapötikler için birincil hedeflerdir24. Araştırmacılar, iyon kanallarının anti-kanser hedefleri olup olamayacağını araşt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Thomas E. & Pamela M. Mischell Aile Vakfı’nın S.S.’ye ve Harold C. Schott Vakfı’nın UC Tıp Fakültesi’ndeki Harold C. Schott Bağış Kürsüsü’nün S.S.’ye sağladığı desteği kabul etmektedir.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
References
- Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
- Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
- Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
- Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
- Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
- Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
- Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
- Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
- Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
- Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
- Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
- Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
- Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
- Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
- Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
- Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
- Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
- Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
- Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
- Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
- Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
- Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
- Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
- Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
- Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
- Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
- Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).
