Ensaio de paralisia induzida por natação (SWIP): Um método para quantificar a locomoção mediada por dopamina em C. elegans

- Para realizar a paralisia natação-induced, ou ensaio SWIP, transfira larvas L4 encenadas C. elegans para uma placa de ponto de vidro cheia de líquido. Identifique hermafroditas L4 pela presença da vulva em desenvolvimento. Um patch em forma de meia-lua no ponto médio do corpo, e uma cauda semelhante a um chicote.

Para avaliar a natação mediada pela dopamina, registo do movimento do verme caracterizado pela dobra corporal em forma de C e comportamento de espancamento. Geralmente, os neurônios dopaminérgicos liberam dopamina na fissura sináptica, que por sua vez, liga os receptores de dopamina na célula receptora.

Uma vez que a mensagem é transmitida, a dopamina é liberada dos receptores, e neurotransmissores não ligados podem ser tomados pelo neurônio dopaminérgico através de proteínas de transporte especializados e reutilizados.

Em larvas com sinalização de dopamina alterada, causadas pela inativação de mutações no transportador de dopamina ou tratamentos medicamentosos que aumentam a liberação de dopamina, a dopamina se acumula na fissura sináptica. O excesso de dopamina estimula os receptores de dopamina interferindo no programa motor e deixando as larvas paralisadas.

No protocolo de exemplo, veremos demonstrações detalhadas de ensaios SWIP manuais e automatizados em C. elegans tratados com anfetamina.

- Para avaliação manual do SWIP, adicione 40 microlitros de solução de controle com ou sem anfetamina de 0,5 milimolar em uma placa de vidro. Sob um estereoscópio, escolha 8 a 10 vermes de estágio L4 com uma picareta de cílios e submersa a picareta no poço contendo a solução até que os vermes se movam para fora da picareta e nadem para a solução.

Inicie o temporizador. Observe o número de worms liberados no poço, e observe e regise o número de worms exibindo SWIP em cada minuto marca por um total de 10 minutos.

Ao final do procedimento, copie os dados brutos em uma planilha e calcule a porcentagem de vermes paralisados dividindo o número de vermes paralisados a cada minuto pelo número total de worms testados ao longo do ensaio e multiplicando por 100. Copie os valores por cento em qualquer software gráfico e estatístico e plote os dados com valores percentual de SWIP no eixo y e tempo no eixo x usando o formato xy graph.

A análise estatística entre os grupos de controle e tratamento de anfetamina e o tempo de tratamento podem ser realizadas. Por exemplo, utilizando-se análises de duas vias ANOVA e pós-hoc.

Para análise automatizada da paralisia induzida pela natação, configure a câmera, o software worm tracker e o script para executar a análise do software de rastreamento.

Em seguida, grave vídeos de natação de um worm de cada vez, e use o software worm tracker para calcular a frequência de dobras corporais. Após o script fornecido com o software de rastreamento para obter a frequência de desbaste de worm e gerar mapas de calor a partir dos dados de espancamento de worms.