Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Pour commencer, ajouter la carbenicilline et un millimolaire IPTG pour contrôler et tester les flacons de culture contenant des supports basaux S. Faites tourner un tube contenant des larves au stade de croissance un, également appelé larves de L1, pendant quelques minutes. Maintenant, retirez le supernatant et placez deux microlitres de L1 sur une plaque d’agar. Placez la plaque sous un microscope dissectant et comptez le nombre de larves.
Ajouter les bactéries RNAi porteuses d’un plasmide RNAi non spécifique au flacon de contrôle et aux bactéries dont le gène cible les ARN au flacon d’essai. La quantité de bactéries ajoutées devrait être proportionnelle au nombre de vers.
Laissez les larves pousser avec des secousses continues pour assurer une oxygénation adéquate. Les larves se nourrissent des bactéries. À l’intérieur de la larve, le petit ARN interférant se lie à l’ARNm complémentaire produit par le gène ciblé et inhibe l’expression des protéines. Enfin, examinez les vers pour votre phénotype d’intérêt.
Dans le protocole d’exemple, nous traiterons les larves de L1 avec RNAi ciblant le gène daf-2, dans la culture liquide.
- Pour commencer le traitement, ajouter 207,45 millilitres de supports basaux S avec des réadageurs supplémentaires tels que décrits dans le protocole texte qui l’accompagne à un flacon de culture Fernbach de 2 800 millilitres. Ajouter une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre de carbenicilline et 1 millimolaire d’IPTG, et fermer le flacon avec un bouchon à vis membranaire.
Sortez les L1 de l’incubateur de 25 degrés Celsius et transférez-les dans des tubes de 15 millilitres. Centrifugez les L1 à 1 900 fois g pendant trois minutes. Après avoir tourné, retirez le surnatant. Au microscope, comptez les L1 par deux microlitres et faites la moyenne des nombres obtenus à partir d’au moins neuf gouttes.
Ensuite, ajoutez 50 000 vers pour la collecte des jeunes vers et 100 000 vers pour la collecte des vers âgés en quatre flacons de culture Fernbach préparés à l’étape précédente. Puis ajoutez les bactéries RNAi de contrôle et les bactéries RNAi pour le gène d’intérêt proportionnellement au nombre de vers.
Après l’ajout de bactéries, la culture complète des vers avec S basal pour porter le volume total à 300 millilitres. Incuber la culture du ver à 25 degrés Celsius dans un incubateur secouant avec 150 RPM jusqu’à la collecte.
