Alimentation RNAi dans la culture liquide: Une méthode à haut débit pour renverser l’expression des gènes dans C. elegans

Overview

RnAi est un outil génétique puissant à la disposition des chercheurs de C. elegans. Cette vidéo introduit une méthode pour traiter plus de vers avec RNAi que l’alimentation par plaque en utilisant des conditions de culture liquide.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Groh et coll., Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Culture liquide d’animaux sans 9d pour recueillir les animaux jeunes et âgés soumis à l’ARNi ciblant un gène d’intérêt

REMARQUE: La réponse de certains gènes à l’ARNi peut dépendre de la température comme décrit précédemment. Comme alternative au RNAi, un gène mutant pourrait être incorporé dans l’arrière-plan gon-2(-).

1. Préparation des bactéries à la culture liquide
   1. Préparer les bactéries OP50 et RNAi (bactéries produisant le dsRNA désiré et les bactéries avec le vecteur vide comme contrôle) en inoculant 4 LB moyen avec 12 mL de la culture bactérienne respective (ajouter une concentration finale de 50 μg/mL de carbenicilline et 1 mM IPTG aux cultures bactériennes RNAi) et les incuber à 37 °C pendant la nuit à 180 rpm.
   2. Le lendemain, récoltez les cultures à 6 700 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirer les supernatants et resuspendre chaque granulé dans un fond basal S glacé de 60 mL (100 mM NaCl, 50 mM de phosphate de potassium pH 6, maintenu sur glace). Gardez les trois granulés résuspendus (OP50, bactéries RNAi de contrôle, et bactéries RNAi pour le gène d’intérêt) à 4 °C jusqu’à l’étape 1.2.
      REMARQUE: Les vers peuvent être cultivés sur RNAi à partir de l’étape L1 ou pour éviter les défauts de développement de la dernière étape larvaire L4 (voir étape 1.2).
2. Culture liquide pour le traitement avec RNAi à partir de la dernière étape larvaire L4
   1. Ajouter 200 mL de fond s dans un flacon de culture Fernbach (capacité de 2 800 mL). Pour un volume de culture final de 300 mL (voir 1,2,2,4), ajouter 10 mM de citrate de potassium, pH 6, 3 mL Trace metals solution (5 mM éthylèneediaminetetraacetic acid (EDTA), 2.5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO_{2 4}, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL carbendazim, et 5 μg/mL de cholestérol). Fermer le flacon à l’intérieur d’un bouchon à vis membranaires. Reportez-vous au tableau 1 pour les recettes de tampons.
   2. Sortez les L1 de 25 °C et transférez-les sur des tubes de 15 mL. Centrifugeuse à 1 900 x g pendant 3 min, enlever le supernatant et compter les L1 par 2 μL. Ajouter 500 000 L1 dans le flacon de culture Fernbach préparé à l’étape précédente.
   3. Ajouter OP50 (à partir de l’étape 1.1) proportionnellement au nombre de vers. Par exemple, pour 500 000 vers ajouter 60 mL OP50.
   4. Culture complète des vers avec S basal pour porter le volume total à 300 mL. Incuber la culture du ver jusqu’au stade L4 à 25 °C dans un incubateur secouant à 150 rpm.
   5. Le lendemain, les vers devraient avoir la taille de L4 de type sauvage. Pour passer de la bactérie OP50 à la bactérie RNAi, recueillez les animaux dans six tubes de 50 mL, laissez-les sédimenter et enlevez le supernatant. Laver les L4 avec M9 pour éliminer les bactéries OP50 résiduelles : centrifugeuse à 1900 x g pendant 3 min, enlever le supernatant et transférer tous les L4 dans un tube de 50 mL. Comptez les L4 par 5 μL (au moins neuf fois). Deux fois 50.000 L4 sont nécessaires pour la collecte des jeunes vers et deux fois 100.000 L4 sont nécessaires pour la collecte des vers âgés.
   6. Préparez quatre flacons de culture Fernbach tels que décrits dans 1.2.2.1. Ajouter également une concentration finale de 50 μg/mL de carbenicilline et de 1 mM IPTG à chaque flacon.
   7. Ajouter les bactéries RNAi de contrôle et les bactéries RNAi pour le gène d’intérêt (à partir de l’étape 1.1) proportionnellement au nombre de vers : Ajouter 7 mL des bactéries respectives par flacon pour les jeunes vers et 14 mL par flacon pour les vers âgés.
   8. Ajoutez 50 000 vers par flacon pour la collection de jeunes vers et 100 000 vers par flacon pour la collection de vers âgés, et complétez les cultures avec du basal S pour remplir jusqu’à 300 mL. Incuber les cultures de vers (quatre au total) à 25 °C et 150 rpm.

2. Entretien des cultures liquides de C. elegans

1. Recueillir périodiquement un aliquot de chaque culture liquide et le placer sur une lame de verre (alternativement sur une plaque d’agar) pour vérifier qu’il n’y a pas de contaminations. À l’aide d’un microscope à dissection, vérifiez les niveaux d’aliments bactériens dans la culture, en particulier pendant la phase de croissance. Préparez à l’avance 2 L cultures de contrôle des bactéries RNAi et des bactéries RNAi pour le gène d’intérêt tel que décrit à l’étape 1.1. Ajoutez-les aux cultures liquides de C. elegans si nécessaire et gardez le reste à 4 °C.
2. Vérifiez périodiquement que les animaux sont stériles. La majorité des animaux n’auront pas de 90. Selon la pénétration de la mutation gon-2, certains peuvent avoir avorté des structures gonadales, mais aucun animal avec des oeufs ne doit être observé.

Solution stock	quantité	Concentration finale	Commentaires/Description
S basal (Pour 500 mL: 5.9 g NaCl, 50 mL 1 M Phosphate de potassium pH 6)	200 mL		1 M Phosphate de potassium pH 6: Pour 1 L: 129 g KH2PO4 monobasique, 52 g K2HPO4 anhydre dibasique
1 M Citrate de potassium pH 6 (Pour 400 mL : 13,1 g de monohydrate d’acide citrique, 134,4 g de monohydrate de citrate de tri potassium)	3 mL	10 mM
Solution trace metals (Pour 1 L: 1,86 g d’acide éthylèneediaminetetraacetic (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g de MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 mL		Stocker la solution de stock dans l’obscurité à 4 °C
1 M MgSO4 (Pour 500 mL: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (Pour 500 mL: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/mL Carbendazim (Pour 50 mL: 10 mg en méthanol)	150 μL	100 ng/mL
5 mg/mL de cholestérol (Pour 100 mL : 0,5 g d’éthanol)	300 μL	5 μg/mL

Tableau 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]