РНК Кормление в жидкой культуре: высокая пропускная способность метод нокдаун гена экспрессии в C. elegans

Overview

РНК является мощным генетическим инструментом, доступным для исследователей C. elegans. Это видео вводит метод для лечения больше червей с РНК, чем пластины кормления с использованием условий жидкой культуры.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Groh et al, Методы для изучения изменений в inherent Агрегации белка с возрастом в Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Ликвидная культура животных без гонада для сбора молодых и престарелых животных, подвергаемых РНК, ориентированных на ген, представляющий интерес

ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция некоторых генов на РНК может зависеть от температуры, как описано ранее. В качестве альтернативы РНК, мутантный ген может быть включен в гон-2 (-) фон.

1. Подготовка бактерий к жидкой культуре
   1. Подготовка OP50 и РНК бактерий (бактерий, производящих желаемое dsRNA и бактерий с пустым вектором в качестве контроля) путем инокуляции 4 ЛБ среды с 12 мл соответствующей бактериальной культуры (добавить окончательную концентрацию 50 мкг / мл карбенициллина и 1 мМ ИПТГ в РНК бактериальных культур) и инкубировать их на 37 градусов по Цельсию ночь на 180 об /мин.
   2. На следующий день урожай культур на 6700 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Удалите супернатанты и повторно снимите каждую гранулу в 60 мл ледяного S базального средства (100 мМ НаКл, 50 мМ фосфат фосфат рН 6, хранится на льду). Храните три рсуспенных гранулы (OP50, контроль РНК бактерий и рнк бактерий для гена интереса) на 4 кк до шага 1,2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Черви могут быть выращены на РНК из стадии L1 или, чтобы избежать дефектов развития от последней личиновой стадии L4 (см. шаг 1.2).
2. Культура жидкости для лечения РНК, начиная с последней личиновидной стадии L4
   1. Добавьте 200 мл базальных средств массовой информации в колбу культуры Фернбаха (вместимость 2800 мл). Для конечного объема культуры 300 мл (см. 1.2.2.4), добавьте 10 мм цитрата калия, рН 6, 3 мл раствора металлов Trace (5 мМ этилендиаминетатетраатетическая кислота (ЭДТА), 2,5 мМ FeSO₄, 1 мМНКл₂, 1 мМ зНСО₄, 0,1 мММ CuSO₄), 3 мММ МгСО₄, 3 мМ CaCl₂, 100 нг/мл карбендазим, и 5 мкг / мл холестерина). Закройте колбу мембранной крышкой винта. Обратитесь к таблице 1 для рецептов буферов.
   2. Возьмите L1s из 25 градусов по Цельсию и передать их в 15 мл труб. Центрифуга на 1900 х г в течение 3 мин, удалить супернатант, и рассчитывать L1s на 2 л. Добавить 500000 L1s в колбу культуры Фернбах подготовлены на предыдущем этапе.
   3. Добавьте OP50 (из шага 1.1) пропорционально количеству червей. Например, для 500 000 червей добавьте 60 мл OP50.
   4. Полная культура червей с S базальным довести общий объем до 300 мл. Инкубировать червя культуры до L4 этапе при 25 градусов по Цельсию в встряхивания инкубатор со 150 об /мин.
   5. На следующий день, черви должны быть размером с дикий тип L4s. Чтобы перелиться с OP50 на бактерии РНК, собирайте животных в шесть 50 мл трубок, дайте им отложения и удалите супернатант. Вымойте L4s с M9, чтобы удалить остаточные бактерии OP50: центрифуга на 1900 х г в течение 3 минут, удалить супернатант и передать все L4s в один 50 мл трубки. Подсчитайте L4s на 5 л (по крайней мере девять раз). Два раза 50000 L4s необходимы для сбора молодых червей и два раза 100000 L4s необходимы для в возрасте сбора червей.
   6. Подготовь четыре Флябы культуры Фернбаха, описанные в 1.2.2.1. Добавьте также окончательную концентрацию 50 мкг/мл карбенициллина и 1 мМ IPTG к каждой колбе.
   7. Добавить контроль РНК бактерий и рнк бактерий для гена интереса (от шага 1,1) пропорционально количеству червей: Добавить 7 мл соответствующих бактерий на колбу для молодых червей и 14 мл на колбу для пожилых червей.
   8. Добавьте 50 000 червей на колбу для сбора молодых червей и 100 000 червей на колбу для коллекции червей в возрасте, и дополните культуры S базальными, чтобы заполнить до 300 мл. Инкубировать червя культур (четыре в общей сложности) при 25 градусов по Цельсию и 150 об / мин.

2. Поддержание жидких культур C. elegans

1. Периодически собирайте алицит из каждой жидкой культуры и полагайте на стеклянную горку (альтернативно на агар-тарелку), чтобы убедиться, что загрязнений нет. Используя микроскоп вскрытия, проверьте уровень бактериальной пищи в культуре, особенно на этапе роста. Подготовка заранее 2 L культур контроля РНК бактерий и рнк бактерий для гена, представляющих интерес, как описано в шаге 1.1. Добавьте их в жидкие культуры C. elegans, если это необходимо, и держите остальные на уровне 4 градусов по Цельсию.
2. Периодически проверяйте, стерильны ли животные. У большинства животных не будет гонада. В зависимости от проницаемой мутации гон-2, некоторые из них, возможно, прервали гонадальные структуры, но не животных с яйцами должны соблюдаться.

Решение по акциям	количество	Окончательная концентрация	Комментарии/Описание
S базальный (для 500 мл: 5,9 г NaCl, 50 мл 1 М фосфат калия рН 6)	200 мл		1 M Фосфат калия рН 6: Для 1 л: 129 г KH2PO4 монобазный, 52 г дибазного ангидроуса K2HPO4
1 M цитрат калия рН 6 (Для 400 мл: 13,1 г моногидрата лимонной кислоты, 134,4 г три-калия цитрат моногидрат)	3 мл	10 мМ
Трейс металлы решение (Для 1 л: 1,86 г этилендиаминтетраатетической кислоты (ЭДТА), 0,69 г FeSO4 7 H2O, 0,2 г MnCl2 4 H2O, 0,29 г nSO4 7 H2O, 0,025 г CuSO4 5 H2O)	3 мл		Храните складе раствор в темноте при 4 градусов по Цельсию
1 M MgSO4 (на 500 мл: 123,3 г)	900 йл	3 мМ
1 M CaCl2 (для 500 мл: 73,5 г)	900 йл	3 мМ
200 мкг/мл карбендазим (На 50 мл: 10 мг метанола)	150 МКЛ	100 нг/мл
5 мг/мл холестерина (На 100 мл: 0,5 г этанола)	300 МКЛ	5 мкг/мл

Таблица 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]