Эпидермальный лазерный раны: индуцирование локализованных повреждений для изучения процессов ремонта в C. elegans

- Для начала перенесите молодых взрослых червей на свежую агарозную площадку на слайде. Затем добавьте несколько капель 12 миллимоляльных левамизоловых растворов, чтобы парализовать червей. Накройте червей крышкой и подождите несколько минут. Поместите слайд под вращающийся диск конфокального микроскопа и сосредоточьтесь на боковой внешней поверхности червя.

Эпидермис взрослого червя представляет собой тонкую однослойную структуру, состоящую из многоядерной синцитии, которая является результатом событий синтеза клеток. Апическая поверхность эпидермиса выделяет гибкую коллагеновую кутикулу, в то время как базальная поверхность покрыта тонким слоем внеклеточной матрицы, называемой базальной ламиной.

Далее, рана апической поверхности эпидермиса с помощью лазера. Цитоплазма из поврежденных клеток может просочиться, появляясь в качестве пузыря на месте раны.

Лазерное облучение имеет преимущество перед другими методами, такими как рана иглы, так как вызывает локальное нарушение кутикулы и эпидермальных клеток, не повреждая внутренние ткани. В примере протокола мы увидим процесс лазерного ранения в C. elegans.

- Чтобы точно ранить нематод, этот протокол использует фемтосекундный лазер, прикрепленный к вращающемуся диску конфокального микроскопа.

- Начните с сбора 10 молодых взрослых на агар площадку. Paralyze их в два микролитра капли 12 миллимолярный раствор левамизола. Затем накройте их крышкой скольжения и подождать несколько минут, пока они парализуют.

- Очень важно, чтобы животное было полностью парализовано. 12 миллимоляйных левамизолов не повлияют на реакцию раны.

- Убедитесь, что фемтосекундная мощность лазера установлена до 140 милливатт, как измеряется перед целью, и скорость повторения лазера составляет 80 мегагерц. Теперь, найдите червей под вращающимся диском конфокального микроскопа. Использование 100x цели с высокой диафрагмой, сосредоточьтесь на боковой передней или задней синцитиальной синцитиальной эпикодермии целевого червя.

Сосредоточившись на апиальной поверхности эпидермальной клетки, сияйте лазером до двух 200 миллисекундных импульсов, разделенных на 20 миллисекунд. Этого должно быть достаточно, чтобы ранить эпидермис. Подождите минутку и наблюдайте локальное нарушение цитоплазмы, которое будет выглядеть как восходящее. Если флуоресцентный маркер присутствует, можно наблюдать локализованное отбеливание.