Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Per iniziare, trasferire i vermi giovani adulti su un cuscinetto di agarosio fresco su una diapositiva. Aggiungere alcune gocce di soluzione di levamisolo da 12 millimolari per paralizzare i vermi. Coprire i vermi con un coverslip e attendere alcuni minuti. Posizionare la diapositiva sotto un microscopio confocale del disco rotante e concentrarsi sulla superficie laterale più esterna del verme.
L'epidermide di un verme adulto è una sottile struttura a strato singolo costituita da sincitia multi-nucleata che derivano da eventi di fusione cellulare. La superficie apicale dell'epidermide secestra una cuticola collagenosa flessibile, mentre la superficie basale è coperta da un sottile strato di matrice extracellulare chiamato lamina basale.
Successivamente, avvolte la superficie apicali dell'epidermide con un laser. Il citoplasma delle cellule danneggiate potrebbe fuoriuscire, apparendo come una bolla nel sito della ferita.
L'irradiazione laser ha un vantaggio rispetto ad altre tecniche, come il mento dell'ago, in quanto causa l'interruzione localizzata della cuticola e delle cellule epidermiche, senza danneggiare i tessuti interni. Nel protocollo di esempio, vedremo il processo di feritae laser in C. elegans.
- Per ferire con precisione i nematodi, questo protocollo utilizza un laser a femtosecondi collegato al microscopio confocale del disco rotante. Dovrebbero essere sufficienti anche scansioni di linea o punti utilizzando laser a femtosecondi, come quelli al microscopio a due fotoni.
- Iniziare raccogliendo 10 giovani adulti su un tampone di agar. Paralizzarli in una goccia di due microlitri di soluzione di levamisolo millimolare. Quindi coprirli con un foglietto di copertura e attendere qualche minuto mentre paralizzano.
- È essenziale che un animale sia completamente paralizzato. La levamisolo millimolare 12 non influirà sulla risposta della ferita. Tuttavia, è possibile utilizzare anche altri metodi di immobilizzazione.
- Assicurarsi che la potenza del laser al femtosecondo sia impostata su 140 milliwatt, misurata prima dell'obiettivo, e che il tasso di ripetizione del laser sia di 80 megahertz. Ora, individuare i vermi sotto un microscopio confocale del disco rotante. Utilizzando un obiettivo 100x con un'apertura numerica elevata, concentrarsi sull'epidermide sincreziale laterale o posteriore del verme bersaglio.
Concentrandosi sulla superficie apicale della cellula epidermica, brillare il laser per due impulsi di 200 millisecondi separati da 20 millisecondi. Questo dovrebbe essere sufficiente per ferire l'epidermide. Attendere un momento e osservare l'interruzione locale del citoplasma, che apparirà come gorgogliante. Se è presente un marcatore fluorescente, è possibile osservare lo sbiancamento localizzato.
