Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Start med en petriskål indeholdende embryoner i E3 medium. Tilsæt tricain for at bedøve embryonerne og phenylthiouria, PTU-opløsning, for at hæmme pigmentdannelsen.
Brug en glaspipette til at overføre et af de dechorionerede embryoner til en lille petriskål med en lav glasbund godt i midten og fjern det overskydende medium. Placer derefter en agaroseopløsning i en optimal koncentration for at minimere embryoforvrængning og motilitet i et mikrofugerør og opvarm det. Bring temperaturen ned til 30 grader Celsius for at undgå at beskadige embryoet på grund af varme.
Hæld det første lag af agarose over embryoet, helt fylde den lavvandede godt. Placer en anden dække glas over brønden og tilsæt 1% agarose på toppen af det. Det andet lag holder dækglas på plads.
Når agarose størkner, fylde Petri parabol med E3 medium, der indeholder tricain. Dette er det tredje lag og holder agarose og embryo hydreret. I den følgende protokol, vil vi udføre lagdelte agar montering af zebrafisk embryoner for længere tid bortfalder billeddannelse.
- Lige før montering opvarmes agaroseopløsningen til 65 grader Celsius, og lad den køle af til ca. 30 grader Celsius, så embryoet ikke skades af varmen og tilsæt tricain til agaroseopløsningen. Brug 35 millimeter glas bund retter med et tal nul dækket glas bund. Forsigtigt placere en dechorionated embryo med en af sine laterale sider mod bunden af fadet med et glas pipette eller en micropipette. Derefter forsigtigt fjerne eventuelle resterende E3 med en micropipette.
Tilføj Første Agarose Løsning Til Lille Godt Lavet Af Dække Glas Knyttet Til Bunden Af Parabol Til Dække Embryo Gør Sikker At Agarose Dækker Lille Godt Men Gør Ikke Overløb Det. Dække Lille Godt Med Dække Glas Til Oprette A Smalle agarosefyldt Plads Med Embryo Mellem To Dække Briller. Sted A Lag Af 1% Agarose Løsning På Top Af Dække Glas Alle Over Bunden Af Parabol Som Vil Holde Dække Glas I Sted Som Det Størkner. Derefter Fylde Resterende Del Af Parabol Med E3 Indeholdende 0.02% tricaine Til Holde System Hydreret. Til Identificere Optimal Agarose Koncentration For Lag En Mount Embryoner I Stigende Koncentrationer Af Agarose Og Udføre Timelapse Imaging Til Identificere Koncentration At Minimerer Embryo Forvrængning Og Motilitet Derefter Test A Finere Vifte Af Koncentrationer Baseret På Resultater.
- Det mest kritiske trin i denne protokol er at identificere den optimale koncentration af agarose til lag 1. Test forskellige nanokoncentrationer af agarose, såsom 0,030%, 0,032%, osv., for at finde den optimale koncentration.
