Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begynn med en Petri-tallerken som inneholder embryoer i E3-medium. Tilsett trikain for å bedøve embryoer og fenylthiouria, PTU-oppløsning, for å hemme pigmentdannelse. Ved hjelp av et dissekerende mikroskop, dechorionate embryoene.
Bruk en glasspipette til å overføre et av de dechorionated embryoene til en liten Petri-tallerken med en grunn glassbunn godt i midten og fjern overflødig medium. Deretter plasserer du en agaroseløsning med optimal konsentrasjon for å minimere embryoforvrengning og motilitet i et mikrofugerør og varme det. Ta ned temperaturen til 30 grader Celsius for å unngå å skade embryoet på grunn av varme.
Hell det første laget av agarose over embryoet, fyll den grunne brønnen helt. Legg et annet dekselglass over brønnen og tilsett 1% agarose på toppen av det. Det andre laget holder dekkglasset på plass.
Når agarose størkner, fyll Petri-parabolen med E3-mediet som inneholder trikain. Dette er det tredje laget og holder agarose og embryo hydrert. I følgende protokoll vil vi utføre lagdelt agarmontering av sebrafiskembryoer for lengre tidsforløpavbildning.
- Rett før montering, varm opp agaroseløsningen til 65 grader Celsius og la den avkjøles til ca. 30 grader Celsius slik at embryoet ikke blir skadet av varmen og tilsett trikain til agaroseoppløsningen. Bruk 35 millimeter glassbunnretter med et tall null dekket glassbunn. Legg forsiktig et avkorionert embryo med en av sidesidene mot bunnen av parabolen med en glasspipette eller en mikropipette. Fjern deretter forsiktig eventuell gjenværende E3 med en mikropipette.
Legge den Første agarose Løsning Å den Liten Godt Opprettet Av den Dekke Glass Knyttet Å den Bunnen Av den Parabolen Å Dekke den embryo, Gjør Sikker Som den agarose Dekker den Liten Godt men Gjør Ikke Overflyt Det. Dekke den Liten Godt Med den Dekke Glass Å Opprette A Smale agarose-fylt Plass Med den embryo Mellom den To Dekke Briller. Sted A Lag Av 1% agarose Løsning På Topp Av den Dekke Glass Alle Over den Bunnen Av den Parabolen Som Vil Holde den Dekke Glass I Sted Som Det Stivner. Deretter Fylle den Gjenværende Del Av den Parabolen Med E3 Inneholder 0.02% trikain Å Holde den System Hydrert. Å Identifisere den Optimal agarose Konsentrasjon For Lag Én Montere den Embryo I Økende Konsentrasjoner Av agarose Og Utføre tidsforløp Imaging Å Identifisere den Konsentrasjon Som Minimerer embryo Forvrengning Og Motilitet Deretter Test A Finere Området Av Konsentrasjoner Basert På den Resultater.
- Det mest kritiske trinnet i denne protokollen er å identifisere den optimale konsentrasjonen av agarose for lag én. Test forskjellige nanokonsentrasjoner av agarose som 0,030%, 0,032%, et cetera, for å finne den optimale konsentrasjonen.
