Montaggio agar stratificato: preparazione di embrioni zebrafish vivi per l'imaging a lungo termine con un microscopio invertito

- Iniziare con una piastra di Petri contenente embrioni in mezzo E3. Aggiungere la tricaina per anestetizzare gli embrioni e la feniltiouria, soluzione PTU, per inibire la formazione del pigmento. Con l'aiuto di un microscopio dissezionante, dechorionare gli embrioni.

Utilizzare una pipetta di vetro per trasferire uno degli embrioni dechorionati in una piccola piastra di Petri con un fondo di vetro poco profondo al centro e rimuovere il mezzo in eccesso. Successivamente, posizionare una soluzione di agarosio a una concentrazione ottimale per ridurre al minimo la distorsione e la motilità dell'embrione in un tubo di microfugo e riscaldarlo. Ridurre la temperatura a 30 gradi Celsius per evitare di danneggiare l'embrione a causa del calore.

Versare il primo strato di agarosio sull'embrione, riempiendo completamente il pozzo poco profondo. Posizionare un altro vetro di copertura sopra il pozzo e aggiungere l'1% di agarosio sopra. Il secondo strato mantiene il vetro di copertura in posizione.

Una volta che l'agarosio si solidifica, riempire la piastra di Petri con il mezzo E3 contenente tricaina. Questo è il terzo strato e mantiene l'agarrose e l'embrione idratati. Nel seguente protocollo eseguiremo il montaggio agar stratificato di embrioni di zebrafish per un'imaging a tempo prolungato.

- Poco prima del montaggio, riscaldare la soluzione di agarosio a 65 gradi Celsius e quindi lasciarla raffreddare a circa 30 gradi Celsius in modo che l'embrione non sia danneggiato dal calore e aggiungere tricaina alla soluzione di agarosio. Utilizzare stoviglie inferiori in vetro da 35 millimetri con un fondo di vetro coperto numero zero. Posizionare delicatamente un embrione dechorionato con uno dei lati laterali verso il fondo del piatto con una pipetta di vetro o una micropipetta. Rimuovere con cura l'E3 rimanente con una micropipetta.

Aggiungere Le primo agarosio soluzione A Le piccolo bene creato presso Le coprire vetro allegato A Le Fondoschiena di Le piatto A coprire Le embrione fabbricazione sicuro quella Le agarosio Copre Le piccolo bene ma fa non traboccare esso. coprire Le piccolo bene vimine Le coprire vetro A creare un stretto pieno di agarosio spazio vimine Le embrione tra Le Due coprire occhiali. luogo un strato di 1% agarosio soluzione su In alto di Le coprire vetro tutto sopra Le Fondoschiena di Le piatto che volontà mantenere Le coprire vetro Pollici luogo come esso Solidifica. allora riempire Le rimanente porzione di Le piatto vimine E3 contenente 0.02% tricaina A mantenere Le sistema idrato. A identificare Le ottimale agarosio concentrazione per strato Uno montare Le Embrioni Pollici crescente Concentrazioni di agarosio e eseguire timelapse Imaging A identificare Le concentrazione quella Minimizza embrione distorsione e motilità allora test un più fine gamma di Concentrazioni Basato su Le risultati.

- Il passaggio più critico di questo protocollo è identificare la concentrazione ottimale di agarosio per lo strato uno. Testare diverse nano concentrazioni di agarosio come 0,030%, 0,032%, eccetera, per trovare la concentrazione ottimale.