Login processing...

Journal / Chemistry /

JoVE Journal
Chemistry

This content is Open Access.

JoVE Journal Chemistry

Analysere Protein arkitekturer og Protein-Ligand komplekser av integrerende strukturelle massespektrometri

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

Journal (Chemistry)

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

Ultrafast Time-resolved Near-IR Stimulated Raman Measurements of Functional π-conjugate Systems

Journal (Chemistry)

Ultrafast Time-resolved Near-IR Stimulated Raman Measurements of Functional π-conjugate Systems

Click here for the English version

Analysere Protein arkitekturer og Protein-Ligand komplekser av integrerende strukturelle massespektrometri

Article DOI: 10.3791/57966 • 07:33 min

October 15th, 2018 •

Zainab Ahdash¹, Andy M. Lau¹, Chloe Martens¹, Argyris Politis¹

¹Department of Chemistry, King's College London

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

October 15th, 2018

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Massespektrometri (MS) har dukket opp som en viktig verktøy for å undersøke strukturen og dynamikken i macromolecular samlinger. Her integrere vi-baserte tilnærminger til å forhøre protein kompleks dannelse og ligand binding.

Transcript

I dag spiller massespektrometri en viktig rolle i strukturell biologi. Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om viktige biologiske makromolekyler i hjemstaten, spesielt proteiner og proteinkomplekser. Native massespektrometri er allment aktuelt for en rekke biomolekylære samlinger, inkludert multiprotein og nukleinsyresystemer.

Den største fordelen med denne teknikken er at den er rask og svært følsom. Den kan brukes til å avhøre heterogene proteinprøver, gjøre det mulig å analysere flere proteiner i oligomerisk tilstand samtidig. Å demonstrere prosedyren vil være Andy Lau, en ph.d.-student i gruppen min.

For å starte denne prosedyren, forberede interne kapillærene for nanoelektrospray som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered en ligand-fri prøve som en kontroll for hver kjøring som bufferutveksling hver til ammoniumacetat. Deretter velger du følsomhets-, positivionanskaffelse og tof-moduser for mobilitet.

Deretter slår du på felle-, API- og IMS-gassene. For IM separasjon bruk nitrogen og argon startpunkter vist her og justere etter behov. Angi et passende m/z-anskaffelsesområde.

For et ukjent protein bør de første optimaliseringstrinnene bruke et bredt spekter. Sett den gullbelagte kapillæren inn i en kapillærholder. Deretter laster du mellom to og tre mikroliter av den proteinkomplekse løsningen av interesse inn i kapillæren.

Stram kapillæren forsiktig og plasser den på elektrospraykildestadiet. Skyv fasen på plass for å begynne å anskaffe data. Påfør et lavt nanostrømningsgasstrykk til et fall dannes på spissen av kapillæren.

Flytt kapillæren med hensyn til kjeglen og overvåk idestrømmen for å oppnå en stabil idestrøm. Påfør en kapillærspenning i området mellom 0,9 og 1,6 kilovolt. Angi deretter prøvetakingskjegle, kildeforskyvning, kildetemperatur og kjeglegassstrøm som beskrevet i tekstprotokollen.

For å skaffe seg et godt løst massespektrum og maksimert imasjonsoverføring, juster MS-parametrene og overvåk den resulterende endringen i spektra. Sett fellekollisjonsenergien til et startpunkt mellom 10 og 50 volt. Hvis spenningsforskyvningene ikke er tilstrekkelige, justerer du fellekollisjonsenergiene.

Sett fellen via spenningen til et startpunkt mellom 20 og 45 volt. Forbedre oppløsningen ved å optimalisere denne spenningen. Etter dette optimaliserer du bølgehastigheten og bølgehøyden som beskrevet i teksten for å oppnå best mulig mobilitetsseparasjon.

For studier som involverer HerA og NurA bruke en bølgehastighet på 40 meter per sekund og en bølgehøyde mellom 550 og 650 volt. For DNA-bindingsanalyse, bland proteinet og DNA med et molarforhold som muliggjør protein-DNA-kompleks dannelse. Tilsett økende mengder av følgende, 5'O-3-tio-trifosfat, tetralithium salt, eller ADP.

Ved hjelp av riktig programvare måle massene av genererte arter og identifisere ligand binding, for eksempel ATP og ADP bindende og oligomeriske tilstander. Bruk deretter ideintensitetene observert i den rå ESI MS-spektraen for å kvantifisere den tilsvarende relative overfloden av arter. Etter å ha optimalisert instrumentforholdene for stabil overføring, reduser kollisjonsenergien og prøvetakingskjeglen så lavt som mulig, samtidig som den beholder god spektrakvalitet.

Bruk den tidligere fastslåtte optimaliserte bølgehastigheten og bølgehøyden til å skaffe IM MS. Mål iddriftstiden ved tre forskjellige bølgehastigheter samtidig som den samme bølgehøyden opprettholdes. For å bestemme proteinion ccs måle fire protein kalibrants, to med massen over proteinet under undersøkelse og to med massen nedenfor, ved hjelp av de samme instrumentering forhold. Først forberede protein prøver og buffer utveksle dem til ammoniumacetat som beskrevet i tekstprotokollen.

Legg til løsningsmiddel i 10% trinn til du når ønsket beløp. Inkuber på is i en time. Etter dette får du et IM-MS-spektrum for hvert utvalg.

Bruk SUMMIT-programvaren til å tildele proteinunderkomplekser og generere proteininteraksjonsnettverk. Alternativt kan du manuelt generere en liste over teoretiske masser for de forventede artene. For å begynne å undersøke protein kompleks stabilitet, registrere IM-MS data samtidig øke felle akselerasjon spenning fra 10 volt til 200 volt, som gradvis vil utfolde seg til protein og gassfasen.

Analyser dataene ved hjelp av riktig programvare og generer todimensjonale utfoldelsesplott ved å stable intensiteten normaliserte CCS-distribusjoner ved hver akselererende spenning for hver ladetilstand. Native MS resultater avslører oligomerisk tilstand, sammensetning, og topologi av HerA og NurA kompleks. Ettersom ikke-kovalente interaksjoner bevares i gassfasen, brukes innfødte MS av ATP gamma S- og ADP-titreringseksperimenter til å bestemme den parvise nukleotidbindingen i HerA og NurA.

Massespektra av HerA oligomeriske tilstander avslører at å øke ATP gamma S konsentrasjonen øker den relative intensiteten av heksameriske HerA. De eksperimentelle CCS-verdiene for proteinene og deres komplekser er deretter avledet fra IM-MS-eksperimentene. Disse verdiene er sett å ha god enighet med teoretiske målinger fra røntgenkrystallografi, som validerer ved hjelp av CCS-verdier for å bygge lavoppløsningsmodeller av proteinmontering.

CIU- og KEcom-analysen viser at DNA-bundet HerA-NurA er mer stabil enn det DNA-frie komplekset. CIU MS-analyse og de respektive ATP-bindingstilstandene viser at de fire ATP gamma S-bundne tilstanden reduserer kompleks stabilitet i gassfasen. Men de seks ATP gamma S bundet tilstand der alle områder er okkupert, er sett på som den mest stabile.

Nøyaktige målinger av den molekylære massen av et intakt kompleks gir verdifull innsikt i biomolekylær karakterisering. Vi kan få informasjon om komplekse monteringsveier, protein oligomerisering og ligand binding. Ved å kombinere all denne informasjonen kan du generere detaljerte modeller av funksjonelle biologiske samlinger.

X

Simple Hit Counter